劉 煒，劉 菊，黃義新（首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院藥劑科，北京 100038）

萬古霉素殼聚糖緩釋微球的制備及其體外釋藥特性和抑菌作用研究

劉 煒＊，劉 菊，黃義新（首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院藥劑科，北京 100038）

目的：制備萬古霉素殼聚糖緩釋微球，考察其體外釋藥特性和抑菌作用。方法：采用乳化交聯(lián)法制備萬古霉素殼聚糖緩釋微球，觀察微球的粒徑分布及形態(tài)；應用紫外分光光度法測定微球藥物含量，計算載藥量及包封率；通過體外釋放試驗，比較其與鹽酸萬古霉素24 h內的體外釋藥情況，考察其7 d內的累積釋放度（Q）；通過體外抑菌試驗觀察其作用20 d對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的影響。結果：所制萬古霉素殼聚糖緩釋微球呈圓球形，表面圓整，無明顯凹凸和孔隙，平均粒徑為（165.6±19.7）μm，平均載藥量為（32.6±3.2）%，平均包封率為（53.8±6.3）%，Q7d為82.7%；其與鹽酸萬古霉素的Q2h分別為18.6%、91.3%；其作用1 d時的抑菌圈直徑＞3 cm，隨其作用時間的延長，抑菌圈直徑逐漸縮小。結論：成功制得萬古霉素殼聚糖緩釋微球，其體外緩釋效果明顯，且具有良好的體外抑菌作用。

萬古霉素；殼聚糖；微球；體外釋藥；體外抑菌

臨床修復骨損傷的過程中，常發(fā)生細菌感染難以控制的難題，常規(guī)靜脈滴注抗生素治療難以在局部產生高濃度的抗生素，無法達到理想的治療效果。因此，近年來抗生素局部緩釋系統(tǒng)在骨感染中的應用逐漸發(fā)展，該系統(tǒng)可以控制藥物在局部釋放，又能發(fā)揮良好抗菌活性[1-2]。微球作為緩控釋藥物載體應用廣泛，其制備方法簡便，適用于不同部位的給藥，可用于注射、黏膜吸附或口服等不同給藥方式，因此被廣泛應用于載藥緩釋系統(tǒng)[3-4]。萬古霉素是骨科應用較廣的抗生素，細胞毒性較低，主要針對革蘭氏陽性菌，對耐藥金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌抑制效果顯著[5]。本研究應用殼聚糖微球良好的緩控釋載體性能，制備萬古霉素殼聚糖緩釋微球，并探討其載藥性能、體外釋放性能和體外抑菌性能，旨在為骨修復過程中的局部載藥緩釋系統(tǒng)的應用提供依據。

1 材料

1.1 儀器

JEM-200CX透射電子顯微鏡（日本日立公司）；Lambda 650紫外-可見分光光度計（美國鉑金埃爾默）；Zetasizer-3000激光粒度分布測量儀（英國Malvern公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用鹽酸萬古霉素（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：150607，規(guī)格：每支500 mg）；殼聚糖（上海銳谷生物科技有限公司，分析純）；25%戊二醛、三氯甲烷、乙醇、NaOH等均為分析純。

1.3 細菌

金黃色葡萄球菌（ATCC 25923），購自上海復祥生物科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 萬古霉素殼聚糖緩釋微球的制備

采用水/油乳化交聯(lián)法制備萬古霉素殼聚糖緩釋微球。將殼聚糖分散于稀乙酸水溶液中，溶脹12 h后制成0.2%的殼聚糖溶液，取適量鹽酸萬古霉素溶入殼聚糖溶液，邊攪拌邊將0.4%戊二醛稀溶液5 ml緩慢加入殼聚糖溶液中，繼續(xù)攪拌10 min；加入液體石蠟和乳化劑油酸山梨坦，攪拌1 h后緩慢加入交聯(lián)劑25%戊二醛溶液4 ml，40℃攪拌；加適量的NaOH溶液調節(jié)pH至微堿性，過濾后依次用三氯甲烷、乙醇溶液洗滌脫水，真空干燥器中干燥，制得萬古霉素殼聚糖緩釋微球。

2.2 微球的粒徑分布與形態(tài)觀察

將萬古霉素殼聚糖緩釋微球粉末均勻分散地黏附于導電膠上，觀測前噴金，在透射電子顯微鏡下觀察微球的形態(tài)結構。取2 ml萬古霉素殼聚糖緩釋微球混懸液，置于激光粒度分布測量儀中分析微球的粒徑分布。結果顯示，萬古霉素殼聚糖緩釋微球形貌較好，大致呈圓球形，表面光滑圓整，無凹凸和孔隙，粒徑分布均勻，粒徑分布在200 nm左右，平均粒徑為（165.6±19.7）nm（n＝3）。萬古霉素殼聚糖緩釋微球電鏡掃描圖見圖1。

圖1 萬古霉素殼聚糖緩釋微球的電鏡掃描圖（×200）Fig 1 TEM of vancomycin-loaded chitosan sustained-release microspheres（×200）

2.3 檢測波長的選擇

稱取鹽酸萬古霉素和空白殼聚糖緩釋微球在200～800 nm全波段行紫外掃描。結果顯示，萬古霉素在280 nm波長處有最大吸收峰，且空白殼聚糖緩釋微球在此波長下不干擾測定，故選用280 nm作為萬古霉素的檢測波長，光譜圖見圖2。

圖2 紫外吸收光譜圖Fig 2 UV spectrums

2.4 微球中萬古霉素的含量測定

精密稱取鹽酸萬古霉素100 mg溶解于HCl溶液中，置于100 ml量瓶中定容，制成1 mg/ml的對照品溶液；然后將對照品溶液稀釋制成系列梯度濃度的萬古霉素溶液，于280 nm波長處測定各濃度溶液的吸光度（A）。以A值對質量濃度（c）進行線性回歸分析，得回歸方程為A＝2.967 2c+0.003 2（r2＝0.999 6）。萬古霉素檢測質量濃度的線性范圍為10～500 μg/ml。

2.5 微球載藥量和包封率的測定

將萬古霉素殼聚糖緩釋微球溶解于HCl溶液中，于280 nm波長處測定萬古霉素的吸光度，根據回歸方程計算萬古霉素的含量。按公式計算包封率與載藥量，包封率（%）＝微球中藥物質量/藥物的投藥量×100%；載藥量（%）＝微球中藥物質量/微球的質量×100%。結果顯示，萬古霉素殼聚糖緩釋微球的載藥量為（32.6±3.2）%，包封率為（53.8±6.3）%（n＝3）。

2.6 體外釋放試驗

稱取定量的萬古霉素殼聚糖緩釋微球和鹽酸萬古霉素對照品，置于截留分子質量為8 000～10 000 Da的透析袋內，以釋放介質為pH 7.4的磷酸鹽緩沖液、轉速為100 r/min，于37℃恒溫水浴中振搖。分別于1、2、4、6、8、12、16、24 h取樣1 ml，并立即補加等量的釋放介質1 ml，在280 nm波長處測定取樣液的吸光度。根據回歸方程計算萬古霉素的濃度，再計算累積釋放度（Q），繪制釋放曲線，結果見圖3。

圖3 萬古霉素殼聚糖緩釋微球和鹽酸萬古霉素24 h內的累積釋藥曲線Fig 3 Accumulative release curves of vancomycin-loaded chitosan sustained-release microspheres and vancomycin hydrochloride within 24 h

由圖3顯示，萬古霉素殼聚糖緩釋微球的Q1h為13.2%，Q2h為18.6%，Q4h為29.5%，Q12h為42.3%，Q24h為47.6%；鹽酸萬古霉素的Q1h為82.1%，Q2h為91.3%，Q4h為98.7%。通過對二者的體外累積釋放度的比較，發(fā)現(xiàn)萬古霉素殼聚糖緩釋微球能減緩萬古霉素的體外釋放。同法測定萬古霉素殼聚糖緩釋微球7 d內的體外釋放情況，結果顯示，其Q7d為82.7%，表明萬古霉素殼聚糖緩釋微球具有較好的緩釋作用。萬古霉素殼聚糖緩釋微球7 d內的累積釋藥曲線見圖4。

圖4 萬古霉素殼聚糖緩釋微球7 d內的累積釋藥曲線Fig 4 Accumulative release curve of vancomycin-loaded chitosan sustained-release microspheres within 7 d

2.7 體外抑菌試驗

將平行3組萬古霉素殼聚糖緩釋微球材料滴入含金黃色葡萄球菌的瓊脂固體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。將微球材料置于新的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔24 h重復此操作，共測量抑菌圈20 d，繪制抑菌圈直徑-時間曲線。結果顯示，萬古霉素殼聚糖緩釋微球對金黃色葡萄球菌具有持續(xù)抑菌作用，隨著時間的延長，抑菌圈逐漸縮小。萬古霉素殼聚糖緩釋微球對金黃色葡萄球菌的體外抑菌圈直徑-時間曲線見圖5。

圖5 萬古霉素殼聚糖緩釋微球對金黃色葡萄球菌的體外抑菌圈直徑-時間曲線Fig 5 The diameter of inhibition zone-time curve in vitro of vancomycin-loaded chitosan sustained-release microspher-es to S.aureus

3 討論

開放性骨折或感染性骨缺損，常因為存在感染因素，加大了治療難度[6]。常規(guī)口服或靜脈給予抗生素治療，由于藥物劑量大，易引發(fā)不良反應，且局部治療效果較差。而采用藥物緩控釋技術可以降低藥物的毒副作用，減少用藥次數，避免耐藥性的產生。

理想的抗生素緩釋載體材料，應具有一定的載藥量，釋藥速度平穩(wěn)；不但能夠有效釋放抗生素以控制感染，且能實現(xiàn)局部給藥增強藥物的療效，有效避免全身給藥產生的不利影響[7-10]。殼聚糖是一種天然高分子生物材料，以其良好的生物相容性和可降解特性，被廣泛應用于基因、藥物載體載體[9-10]。

本實驗以殼聚糖作為緩釋載體、戊二醛為交聯(lián)劑，采用乳化交聯(lián)法制備萬古霉素殼聚糖緩釋微球，經測量載藥量為（32.6±3.2）%，包封率為（53.8±6.3）%。推測萬古霉素在微球中的載藥機制為：萬古霉素與殼聚糖分子中均含有氨基，戊二醛作為交聯(lián)劑可以和氨基發(fā)生反應。在微球制備初期殼聚糖形成少量交聯(lián)網絡結構，將萬古霉素分子包裹其中。當水相和油相混合之后能有效減少萬古霉素的分散，從而提高微球交聯(lián)度和萬古霉素的交聯(lián)密度，增加復合微球的載藥性能[11-12]。

萬古霉素殼聚糖緩釋微球在釋放介質中開始時釋放較快，Q4h為29.5%，之后釋放平穩(wěn)。其機制在于鹽酸萬古霉素分子中含有親水性羥基，呈水溶性，可以與水分子以氧鍵結合，能很快地擴散在溶液中[13]。由緩釋微球和單藥萬古霉素的釋放對比曲線可以看出，載藥微球能顯著抑制萬古霉素的突釋，避免瞬間局部產生高藥物濃度。綜上所述，萬古霉素殼聚糖緩釋微球在體外顯示了良好的緩釋作用和抑菌活性，可為其在骨感染治療中的應用提供依據。

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（編輯：鄒麗娟）

Preparation of Vancomycin-loaded Chitosan Sustained-release Microspheres and Its Drug Release in vitro and Antibacterial Effect

LIU Wei，LIU Ju，HUANG Yixin（Dept.of Pharmacy，Beijing Shijitan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100038，China）

OBJECTIVE：To prepare vancomycin-loaded chitosan sustained-release microspheres and to study its drug release and antibacterial effects in vitro.METHODS：The emulsion cross-linking was used to prepare vancomycin-loaded chitosan sustainedrelease microspheres，and the particle size and morphology of microspheres were observed.The contents of vancomycin in microspheres was determined by UV spectrophotometry，and drug-loading amount of entrapment efficiency were calculated.Drug release of prepared microspheres and vancomycin hydrochloride within 24 h were compared by release trial in vitro，and then its accumulative release rate（Q）within 7 d was investigated.The effects of prepared microspheres on the diameter of inhibition zone to Staphylococcus aureus after treated for 20 d were observed through in vitro antibacterial test.RESULTS：The microspheres were spherical and complete round without obvious bump and pore.The average particle size of the microspheres was（165.6±19.7） μm；average drug-loading amount was（32.6±3.2）%；average encapsulation efficiency was（53.8±6.3）%；Q7dwas 82.7%.Q2hof prepared microspheres and vancomycin hydrochloride were 18.6%and 91.3%.The diameter of inhibition zone was higher than 3 cm after treated for 1 d，and then decreased gradually as time.CONCLUSIONS：Vancomycin-loaded chitosan sustained-release microspheres can be prepared successfully，and show obvious in vitro sustained-release effect and antibacterial effects.

Vancomycin；Chitosan；Microsphere；Release in vitro；Antibacterial effect in vitro

R943

A

1001-0408（2016）31-4443-03

2016-03-21

2016-06-20）

＊副主任藥師，碩士。研究方向：藥物制劑、臨床藥學。電話：010-63926411。E-mail：liuwei8090@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.31.36