殷　媛，王　成，戴　欣，黃朝暉

1.江南大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤研究所，江蘇 無(wú)錫 214062；2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南京 210002；3.美世大學(xué)藥學(xué)院，制藥科學(xué)系，癌癥納米醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，佐治亞州 亞特蘭大 30341

腸炎和腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌miRNA表達(dá)檢測(cè)及生物信息學(xué)分析

殷媛1，王成2，戴欣3，黃朝暉1

1.江南大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤研究所，江蘇 無(wú)錫 214062；2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南京 210002；3.美世大學(xué)藥學(xué)院，制藥科學(xué)系，癌癥納米醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，佐治亞州 亞特蘭大 30341

背景與目的：炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases，IBD)為一組慢性腸道疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)與克羅恩病(Crohn’s disease，CD)。腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌(colitis-associated colorectal cancers，CAC)是由IBD癌化形成的一種惡性腫瘤。該研究通過(guò)檢測(cè)UC、CD和CAC組織中相關(guān)微小核糖核酸(miRNA)的水平，初步探討其作為腸炎癌轉(zhuǎn)化分子標(biāo)志物的可能性，并對(duì)在腸炎和CAC中顯著變化的一組miRNAs進(jìn)行靶基因歸集和生物信息學(xué)分析，為以miRNAs為靶點(diǎn)的基因治療提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)技術(shù)，檢測(cè)13例UC組織、3例CD患者組織、12例CAC組織及8例正常腸組織中16種miRNAs的表達(dá)。通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)顯著變化的一組miRNA進(jìn)行靶基因分析，將文獻(xiàn)中已報(bào)導(dǎo)的所有靶基因進(jìn)行匯總，并利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶基因進(jìn)行功能富集分析(GO-analysis)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析(KEGG-analysis，BIOCARTA-analysis)。結(jié)果：炎癥相關(guān)miR-146a和癌癥相關(guān)miR-27a、miR-29a、miR-20a、miR-21在UC、CD和CAC中的表達(dá)都顯著高于正常結(jié)腸組織，且這一組miRNA的靶基因都富集在癌癥相關(guān)通路、免疫信號(hào)相關(guān)通路和炎癌轉(zhuǎn)換相關(guān)通路上。結(jié)論：miR-146a、miR-27a、miR-29a、miR-20a和miR-21可能是參與腸炎向結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)化的一組miRNA。

微小核糖核酸；潰瘍性結(jié)腸炎；克羅恩??；腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)；GO分析；KEGG分析；BIOCARTA分析

炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases，IBD)為一組慢性腸道疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)與克羅恩病(Crohn’s disease，CD)［1-2］。IBD是一類病因不明的腸道慢性非特異性炎癥，其診斷和治療都相當(dāng)棘手，現(xiàn)有治療手段很難將其完全治愈。IBD的持續(xù)發(fā)作不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，而且可發(fā)生癌變，嚴(yán)重威脅患者的生命健康［3-4］。腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌(colitis-associated colorectal cancers，CAC)是由IBD癌化形成的一種惡性腫瘤，雖然占總體結(jié)直腸癌的比例不高(小于等于5%)，但惡性程度高，診斷時(shí)多為晚期，且呈多灶性、異質(zhì)性特點(diǎn)，同時(shí)還常伴有其他部位腫瘤發(fā)生，如淋巴瘤、膽管癌等，因此其5年生存率明顯低于結(jié)直腸癌平均值。有研究顯示，18.4%的IBD患者會(huì)轉(zhuǎn)化為CAC，但目前尚無(wú)有效的方法對(duì)此種并發(fā)癥的發(fā)生進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)，IBD轉(zhuǎn)化為CAC的分子機(jī)制目前并不清楚［5］。

微小核糖核酸(miRNA)是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小核糖核酸分子，其在進(jìn)化上高度保守，普遍存在于動(dòng)植物體內(nèi)。目前，已經(jīng)證實(shí)人體內(nèi)有超過(guò)30%的編碼基因受到miRNA調(diào)控，因此miRNA廣泛參與細(xì)胞的發(fā)育分化、能量代謝、細(xì)胞周期及纖維化的生理過(guò)程［6］。有研究顯示，miRNA在癌癥包括結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，一些特異變化的miRNA被稱為“原癌miRNA”，可以作為癌癥發(fā)生、發(fā)展的標(biāo)志物［7］。同時(shí)，有研究表明，結(jié)腸炎組織中miRNA表達(dá)與正常組織差異顯著［8］。目前，關(guān)于CAC中miRNA表達(dá)報(bào)道較少，因此，對(duì)IBD組織及CAC組織中miRNA表達(dá)的檢測(cè)和比較將會(huì)為炎癥轉(zhuǎn)化為癌癥提供一種動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)指標(biāo)，同時(shí)也可為CAC的發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制研究提供一條新的思路。

隨著miRNA研究的日漸深入，對(duì)其功能進(jìn)行篩選和驗(yàn)證需要更明確的指向性［9］。通過(guò)對(duì)miRNA靶基因進(jìn)行生物學(xué)富集分析，可以為尋找miRNA表達(dá)譜改變所引起的生物學(xué)變化提供線索，以便進(jìn)一步鑒定和篩選有意義的生物學(xué)功能。

本研究檢測(cè)和分析了UC、CD和CAC組織中相關(guān)miRNA的水平，探討其作為腸炎癌轉(zhuǎn)化分子標(biāo)志物的可能性。對(duì)其中顯著變化的一組miRNAs靶基因進(jìn)行生物學(xué)富集分析，為以miRNAs為靶點(diǎn)的基因治療提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　　材料和方法

1.1標(biāo)本來(lái)源

收集2010年2月—2012年10月在江南大學(xué)附屬醫(yī)院確診的組織標(biāo)本36例，包括UC組織13例，CD患者組織3例，CAC組織12例及正常對(duì)照組織8例，所有組織標(biāo)本取出后立即置于液氮中速凍后，置-80 ℃環(huán)境中保存待用。

1.2主要儀器及試劑

7300型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Eppendorf公司，SAS67120型超純水機(jī)購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，引物、反向互補(bǔ)探針購(gòu)自美國(guó)ABI公司，TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQPCR)試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3組織RNA 提取

取100 μg組織，按TRIzol試劑說(shuō)明書操作提取組織RNA。

1.4RTFQ-PCR檢測(cè)

組織RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體系均為10 μL，包括DEPC處理的不含RNA酶H2O 3.5 μL，5×AMV逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液2 μL，dNTP 1 μL，逆轉(zhuǎn)錄引物1 μL，AMV酶0.5 μL，RNA 2 μL。反應(yīng)參數(shù)：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃循環(huán)反應(yīng)。RT F Q-P C R反應(yīng)體系為20 μL，包括雙蒸水14.77 μL，10×PCR緩沖液2 μL，25 mmol/L MgCl21.2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，Taq酶0.3 μL，探針0.33 μL，cDNA 1 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃5 min；95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本檢測(cè)3個(gè)復(fù)孔。組織miRNA的含量采用相對(duì)定量法進(jìn)行，以U6 snRNA為內(nèi)參照，用2?△Ct計(jì)算，其中△Ct = CtmiRNA-CtU6。

1.5靶基因生物信息學(xué)分析

利用miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)miRWalk 2.0分別對(duì)文獻(xiàn)中已證明過(guò)的miRNA靶基因進(jìn)行查詢和匯總，得到目標(biāo)靶基因合集。

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶基因進(jìn)行功能富集分析(GO-analysis)，根據(jù)GO的3大應(yīng)用功能(即分子功能、生物學(xué)過(guò)程和細(xì)胞組分)分析，得到這些靶基因主要參與的生物學(xué)過(guò)程。根據(jù)靶基因在功能集中的數(shù)量百分比計(jì)算富積得分，并計(jì)算顯著性程度P值，P<0.001為閾值得到差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的功能富集。

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶基因進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析(KEGG-analysis，BIOCARTA-analysis)，得到這些靶基因主要參與的信號(hào)通路。根據(jù)靶基因在功能集中的數(shù)量百分比計(jì)算富積得分，并計(jì)算顯著性程度P值，P<0.001為閾值得到差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以進(jìn)行，表示在分析前進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　　結(jié)果

2.1miRNA表達(dá)譜檢測(cè)和分析

根據(jù)課題組前期芯片結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果［10-11］，本研究運(yùn)用RTFQ-PCR技術(shù)對(duì)選取的包括炎癥相關(guān)miRNAs(miR-146a、miR-146b、miR-150、miR-155、miR-193-3p和miR-181a)和原癌miRNAs(miR-27a、miR-29a、miR-210、miR-191、miR-194、miR-214、miR-20a、miR-21、miR-24和miR-30d)共16種miRNAs的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。

2.1.1炎癥相關(guān)miRNAs在不同組織中的表達(dá)水平

本研究運(yùn)用RTFQ-PCR技術(shù)對(duì)選取的炎癥相關(guān)miRNAs的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，miR-146a、miR-146b和miR-150在UC、CD和CAC中的表達(dá)與正常結(jié)腸組織相比都上升，且miR-146a的表達(dá)與正常腸組織相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，并且CAC與UC相比，miR-146a的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1)。

圖1　炎癥相關(guān)miRNAs在不同組織中的表達(dá)水平Fig. 1 Expression levels of inflammation associated miRNAs in different tissues

2.1.2癌癥相關(guān)miRNA在不同組織中的表達(dá)水平

本研究運(yùn)用RTFQ-PCR技術(shù)對(duì)選取的癌癥相關(guān)miRNAs的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，miR-27a、miR-29a、miR-214、miR-20a、miR-21和miR-24在UC、CD和CAC中的表達(dá)都上升，其中miR-27a、miR-29a、miR-20a和miR-21的表達(dá)與正常腸組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)，我們對(duì)IBD和CAC組織中的miRNA表達(dá)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，miR-27a、miR-20a和miR-21在IBD和CAC之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而miR-29a的表達(dá)雖然在IBD和CAC之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其表達(dá)豐度高，與正常組織相比變化明顯，因此考慮其在腸炎向腸癌轉(zhuǎn)化中也發(fā)揮重要作用。

以上實(shí)驗(yàn)表明，炎癥相關(guān)miR-146a和癌癥相關(guān)miR-27a、miR-29a、miR-20a和miR-21在UC、CD和CAC中的表達(dá)都顯著高于正常結(jié)腸組織，且在腸炎和腸癌之間也有明顯區(qū)分，提示miR-146a、miR-27a、miR-29a、miR-20a和miR-21可能是參與腸炎向結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)化的一組miRNAs。

圖2　　癌癥相關(guān)miRNAs在不同組織中的表達(dá)水平Fig. 2 Expression levels of cancer associated miRNAs in different tissues

2.2生物信息學(xué)分析

2.2.1靶基因合集

利用miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)miRWalk 2.0分別對(duì)文獻(xiàn)中已證明過(guò)的miR-27a、miR-29a、miR-146a、miR-20a和miR-21的靶基因進(jìn)行查詢，并進(jìn)行歸集匯總，共得到710個(gè)靶基因。

2.2.2靶基因集合的功能富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶基因進(jìn)行功能富集分析(GO-analysis)，結(jié)果顯示，miR-27a、miR-29a、miR-146a、miR-20a和miR-21的靶基因功能分別富集在轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、RNA代謝過(guò)程、細(xì)胞表面受體相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖調(diào)控和細(xì)胞程序性死亡調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程中(P<0.001，圖3)。

圖3　　差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生物功能富集得分Fig. 3 Enrichment scores of the biological function processes with statistically significant difference

2.2.3靶基因集合的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶基因進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析(KEGG-analysis，BIOCARTA-analysis)，結(jié)果顯示，miR-27a、miR-29a、miR-146a、miR-20a和miR-21的靶基因富集在結(jié)直腸癌相關(guān)通路、p53通路、細(xì)胞因子和炎癥反應(yīng)通路、MAPK通路及Toll樣受體通路中(P<0.001，圖4)。

圖4　　差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的通路富集得分Fig. 4 Enrichment scores of the pathways with statistically significant difference

3　　討論

IBD是一種原因未明的結(jié)直腸炎性病變，以反復(fù)發(fā)生的腸道潰瘍?yōu)樘卣?，患者常表現(xiàn)為腹瀉、黏液血便及腹痛。在發(fā)病率最高的北美和西歐國(guó)家，IBD的發(fā)病率為100/10 000～200/ 10 000。我國(guó)尚缺乏大規(guī)模人群的發(fā)病率調(diào)查，但最新的一項(xiàng)基于住院患者的研究統(tǒng)計(jì)顯示，近10年發(fā)病人數(shù)增加了3倍，說(shuō)明在我國(guó)的發(fā)病率呈快速上升趨勢(shì)。IBD隨著病程延長(zhǎng)，癌變風(fēng)險(xiǎn)增加。有研究表明，IBD患者與普通人相比患腸癌風(fēng)險(xiǎn)增加了19倍，炎癌轉(zhuǎn)化是IBD患者死亡的主要原因之一，但對(duì)于IBD轉(zhuǎn)化為CAC的分子機(jī)制目前并不清楚［12］。

本研究選取了結(jié)腸組織相關(guān)miRNAs、炎癥相關(guān)miRNAs及原癌miRNAs等3種來(lái)源的miRNAs，用RTFQ-PCR方法檢測(cè)了UC、CD和CAC組織中這些miRNAs的表達(dá)情況。結(jié)果表明，miR-27a、miR-29a、miR-146a、miR-20a和miR-21在這3類組織中較正常腸組織都顯著上升，且在結(jié)直腸炎和結(jié)直腸癌之間也有明顯區(qū)分，提示其可能是參與結(jié)直腸炎向結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)化的一組miRNAs。miR-27a和miR-29a被報(bào)道在結(jié)直腸組織中高表達(dá)并參與了腸癌的發(fā)生、發(fā)展，本研究發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)miRNAs在IBD中也呈高表達(dá)，而經(jīng)典的原癌基因miR-20a和miR-21在IBD中也顯著升高，顯示了這些miRNAs在炎癥轉(zhuǎn)化為癌癥中可發(fā)揮動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)作用，并且可能直接參與IBD轉(zhuǎn)化為CAC的調(diào)控。miR-146a是一種在天然免疫中發(fā)揮重要作用的miRNA，尤其是參與了巨噬細(xì)胞的分化和功能調(diào)控［13］。而在對(duì)IBD有限的機(jī)制研究中，研究者認(rèn)為，巨噬細(xì)胞對(duì)IBD的發(fā)生、發(fā)展起關(guān)鍵作用［14］。與我們的結(jié)果結(jié)合來(lái)看，miR-146a很可能是IBD轉(zhuǎn)化為CAC的重要標(biāo)志和調(diào)控分子。

隨著對(duì)miRNA研究的深入，機(jī)體中miRNA的錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)控方式也顯示出來(lái)。miRNA的調(diào)控呈現(xiàn)“多對(duì)多”的形式，即一種miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶點(diǎn)，而多種miRNA也可能調(diào)控一個(gè)靶基因［15］。任何生理病理過(guò)程都伴隨著多種miRNA的變化，意味著對(duì)生物學(xué)過(guò)程的研究不能局限于點(diǎn)和線，而應(yīng)該著眼于整個(gè)動(dòng)態(tài)變化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。GO功能分析和KEGG通路分析等生物信息學(xué)方法的出現(xiàn)［16］，對(duì)miRNA相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究有很大的幫助，也為機(jī)制的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供了線索，使功能驗(yàn)證不再盲目［17］。本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)挑選出的miR-27a、miR-29a、miR-146a、miR-20a和miR-21進(jìn)行了靶基因功能富集分析和通路富集分析，結(jié)果顯示，這一組miRNA與癌癥相關(guān)通路、炎癥相關(guān)通路、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體密切相關(guān)。該結(jié)果提示，篩選的在IBD向CAC轉(zhuǎn)化過(guò)程中動(dòng)態(tài)變化的這組miRNA，不僅僅作為檢測(cè)指標(biāo)存在，很可能參與了腸組織中炎癌轉(zhuǎn)化的過(guò)程。

本研究對(duì)IBD組織及CAC組織中miRNA表達(dá)的檢測(cè)和比較將會(huì)為炎癥轉(zhuǎn)化為癌癥提供一種動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)指標(biāo)，同時(shí)也可為CAC的發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制研究提供一條新的思路。

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Investigation of key miRNAs and their target genes in inflammatory bowel diseases and colitis-associated colorectal cancers using miRNA profiling and bioinformatic tools

YIN Yuan1, WANG Cheng2,DAI Xin3, HUANG Zhaohui1
(1. Wuxi Oncology Institute, the Affiliated Hospital of Jiangnan University, Wuxi 214062, Jiangsu Province, China; 2. Department of Clinical Laboratory, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command, PLA, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China; 3. Cancer Nanomedicine Laboratory, Department of Pharmaceutical Sciences, Mercer University College of Pharmacy, Atlanta 30341, GA, USA)
Correspondence to: HUANG Zhaohui E-mail: hzhwxsy@126.com

Background and purpose: Inflammatory bowel diseases (IBD) are a group of chronic intestinal diseases, including ulcerative colitis (UC) and Crohn’s disease (CD). This study identified differentially expressed miRNAs in UC, CD and colitis-associated colorectal cancers (CAC) to explore their potential as novel molecular biomarkers. Methods: Tissue samples were taken from 13 UC patients, 3 CD patients, 12 CAC patients, and 8 ageand gender-matched healthy controls. The miRNA expressions were detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (RTFQ-PCR) assay. Known targets of deregulated miRNAs were utilized using miRWalk 2.0 database, and subsequent bioinformatics analysis of these target genes was performed by DAVID software (GO-analysis, KEGG-analysis and BIOCARTA-analysis). Results: The data showed that miR-146a, miR-27a, miR-29a, miR-20a and miR-21 were upregulated in UC, CD and CAC tissues compared with normal control. Moreover, the target genes ofthese miRNAs were enriched in several key signal transduction pathways including cancer-related pathway and immunity-associated pathway. Conclusion: miR-146a, miR-27a, miR-29a, miR-20a and miR-21 may play important roles in the switching from IBD to CAC.

miRNA; Ulcerative colitis; Crohn’s disease; Colitis-associated colorectal cancers; Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction; GO-analysis; KEGG-analysis; BIOCARTA-analysis

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.11.006

R735.3

A

1007-3639(2016)11-0916-06

國(guó)家自然科學(xué)基金(81301784，81272299，81000867)。

黃朝暉E-mail: hzhwxsy@126.com

（2015-06-11

2016-12-25）