董彩鳳，孫麗紅，張　健，張朝軍，張俊毅

1.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；3.烏海市人民醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 烏海 016000；4.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；

Delta-catenin蛋白通過抑制JNK通路活性而減少肺癌細(xì)胞的凋亡

董彩鳳1，孫麗紅2，張健3，張朝軍1，張俊毅4

1.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；3.烏海市人民醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 烏海 016000；4.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；

背景與目的：作為黏附蛋白catenin家族中的一員，Delta-catenin蛋白可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，然而其提高腫瘤細(xì)胞增殖能力的機(jī)制并不清楚。本研究檢測了Delta-catenin對肺癌細(xì)胞凋亡的影響及其與絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein hinase，MAPK)信號通路蛋白的關(guān)系，并初步探索了Delta-catenin促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲增殖的可能機(jī)制。方法：采用蛋白[質(zhì)]印跡法(Western blot)檢測肺癌細(xì)胞過表達(dá)Delta-catenin前后p38、c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)蛋白活性的變化，同時(shí)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測了腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù)量的改變，還通過Matrigel基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測了腫瘤細(xì)胞侵襲數(shù)量的變化。結(jié)果：與未處理組和空載體對照組相比，過表達(dá)Delta-catenin后肺癌細(xì)胞的p38蛋白活性沒有變化(P＞0.05)，但JNK的蛋白活性卻顯著減少(P＜0.05)，與此同時(shí)，腫瘤細(xì)胞的凋亡比例顯著下降(P＜0.05)，而腫瘤細(xì)胞的侵襲能力卻明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。結(jié)論：Delta-catenin可能通過抑制肺癌細(xì)胞JNK通路的活性而減少腫瘤細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲。

Delta-catenin；肺癌；細(xì)胞凋亡；c-jun氨基末端激酶通路

Delta-catenin蛋白(也被稱之為NPRAP蛋白，基因名稱為CTNND2)作為黏附蛋白catenin家族中的一員，其在腫瘤演進(jìn)過程中所發(fā)揮的作用越來越受到人們的關(guān)注。數(shù)篇文獻(xiàn)報(bào)道了Delta-catenin在食管癌［1］、前列腺癌［2］、大腦星形細(xì)胞瘤［3］及卵巢癌［4］中的表達(dá)明顯增高且和患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。特別是我們的研究結(jié)果證實(shí)，在非小細(xì)胞肺癌中存在Deltacatenin蛋白的高表達(dá)［5］，且Delta-catenin的表達(dá)促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。然而，上述結(jié)果僅僅是一些表面現(xiàn)象，Delta-catenin促進(jìn)肺癌增殖侵襲的具體機(jī)制以及究竟哪條信號通路參與了Delta-catenin對肺癌細(xì)胞凋亡的影響目前尚不明確。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成員在細(xì)胞的生物學(xué)活動中發(fā)揮重要作用，特別是p38和c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)通路參與了細(xì)胞受到外界刺激時(shí)引起的細(xì)胞凋亡［6-9］。有文獻(xiàn)報(bào)道，在神經(jīng)元中JNK可以通過磷酸化Delta-catenin而使后者通過蛋白酶體途徑降解，從而使Delta-catenin促進(jìn)神經(jīng)元突觸形成的能力顯著降低［10］。本研究旨在探討Deltacatenin對JNK通路活性的影響，以及Deltacatenin能否通過降低JNK通路的活性而減少腫瘤細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)瘤細(xì)胞的侵襲、增殖等生物學(xué)行為。

1　　材料和方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

人肺腺癌細(xì)胞系SPC-A-1(以下稱SPC)、SK-MES-1(以下稱SK)均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。上述細(xì)胞系培養(yǎng)于含100 U/mL青鏈霉素(購自美國Sigma-Aldrich公司)和10%FBS(購自美國Gibco公司)的RPMI-1640或DMEM(購自美國Gibco公司)培養(yǎng)基中。在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)。每2天用0.25%胰酶(購自美國Invitrogen公司)消化傳代。

1.2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

含人源性全長Delta-catenin cDNA的質(zhì)粒pCMV5-FLAG/Delta-catenin由日本神戶大學(xué)Nakamura博士惠贈［11］，并經(jīng)寶生物工程(大連)有限公司擴(kuò)增和驗(yàn)證。用LipofectamineTM2000(購自美國Invitrogen公司)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將pCMV5-FLAG/Delta-catenin質(zhì)粒導(dǎo)入SPC或SK肺癌細(xì)胞系中，并以空載體pCMV5作為陰性對照。實(shí)驗(yàn)分3組：未處理組、空載體對照組、Delta-catenin過表達(dá)組。

1.3蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測

用RIPA裂解液(購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)充分裂解收集的細(xì)胞，收集上清液并進(jìn)行蛋白定量。取等量總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜(購自美國Millipore公司)，再分別與一抗Delta-catenin、p38、磷酸化的p38(p-p38)、JNK、磷酸化的JNK(p-JNK)和β-actin(均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品)在4 ℃條件下溫育過夜。隨后PVDF膜與HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(購自美國Santa Cruz公司)在室溫下溫育2 h，再經(jīng)ECL發(fā)光(購自美國Pierce公司)并曝光膠片(購自日本富士膠片株式會社)。目的蛋白/β-actin的灰度比值作為該目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.4細(xì)胞凋亡測定

收集對數(shù)生長期細(xì)胞并制成1×107個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取1 mL細(xì)胞懸液用75%冷乙醇于4 ℃固定過夜，離心(110×g，2 min)后制成500 μL的細(xì)胞懸液，加50 μg/mL的PI染液(購自美國Sigma-Aldrich公司)，于4 ℃避光染核45 min后上流式細(xì)胞儀(購自美國BD公司)檢測，采用ModFit LT 3.0軟件分析細(xì)胞凋亡比例。

1.5細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

利用Matrigel基質(zhì)膠(購自美國BD公司)和Transwell小室(購自美國Corning公司)檢測肺癌細(xì)胞的侵襲能力。將1∶4稀釋的Matrigel基質(zhì)膠100 μL加入到上室，待膠凝固后加入100 μL細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為3×105個(gè)/mL)，下室加入含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液600 μL。將已轉(zhuǎn)染Delta-catenin質(zhì)粒24 h的腫瘤細(xì)胞接種到Matrigel基質(zhì)膠上繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨后用預(yù)冷甲醇固定，并用棉簽擦掉微孔膜上表面未侵襲的腫瘤細(xì)胞，然后用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野中侵襲到微孔膜下表面的細(xì)胞，然后取平均值作為該實(shí)驗(yàn)組的平均侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS for Windows 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果以示，并采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　　結(jié)果

2.1過表達(dá)Delta-catenin可以顯著抑制JNK通路的活性

為了探討Delta-catenin對MAPK通路蛋白中p38、JNK活性的影響，在肺癌細(xì)胞系SPC和SK中分別轉(zhuǎn)染pCMV5-FLAG/Delta-catenin質(zhì)粒后觀察p38、JNK蛋白及其各自磷酸化狀態(tài)的蛋白(即p-p38、p-JNK)表達(dá)水平是否改變。結(jié)果顯示，無論是p38還是p-p38蛋白水平在過表達(dá)Delta-catenin前后均沒有顯著變化(圖1A，P>0.05)。與此同時(shí)，JNK的總蛋白水平雖然沒有變化(圖1B，P>0.05)，但其磷酸化狀態(tài)蛋白p-JNK的表達(dá)水平卻顯著下降(圖1B，P<0.05)。無論是SPC細(xì)胞系還是SK細(xì)胞系均顯示了類似的蛋白表達(dá)結(jié)果。說明過表達(dá)Delta-catenin可以顯著降低JNK通路的活性。

圖1　　在SPC或SK細(xì)胞系中過表達(dá)Delta-catenin后p38、p-p38、JNK和p-JNK蛋白表達(dá)水平的變化Fig. 1 The alteration of p38, p-p38, JNK, p-JNK protein expressive level in SPC or SK cell lines with Delta-catenin overexpression

2.2過表達(dá)Delta-catenin顯著減少肺癌細(xì)胞的凋亡比例

為了探討Delta-catenin蛋白對肺癌細(xì)胞凋亡的影響。本研究采用流式細(xì)胞儀檢測不同實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞凋亡比例的改變。在SPC細(xì)胞系中，過表達(dá)Delta-catenin后瘤細(xì)胞的平均凋亡比例顯著減少，為(3.03±0.68)%，而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞凋亡比例分別為(19.49±0.88)%和(17.01±1.06)%，且過表達(dá)組與未轉(zhuǎn)染組或空載體組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與此類似，在SK細(xì)胞系中過表達(dá)Delta-catenin后瘤細(xì)胞的平均凋亡比例也顯著減少，為(2.15±0.47)%，而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞凋亡比例分別為(6.97±0.92)%和(7.51±0.74)%，且過表達(dá)組與未轉(zhuǎn)染組或空載體組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2，P<0.05)。

2.3過表達(dá)Delta-catenin顯著增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的侵襲能力

本研究采用Matrigel基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)觀察了過表達(dá)Delta-catenin前后肺癌細(xì)胞侵襲能力的改變。在SK細(xì)胞系中，過表達(dá)Delta-catenin蛋白后穿過微孔膜的瘤細(xì)胞數(shù)量［(36.12±4.33)個(gè)］明顯多于未處理組［(15.00±3.78)個(gè)］和空載體對照組［(13.68±1.46)個(gè)］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同樣，在SPC細(xì)胞系中過表達(dá)Delta-catenin蛋白后穿過微孔膜的瘤細(xì)胞數(shù)量［(67.31±8.02)個(gè)］也顯著高于未處理組［(24.62±4.78)個(gè)］和空載體對照組［(22.89±2.39)個(gè)］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3，P<0.05)。

圖2　　在SPC和SK細(xì)胞系中過表達(dá)Delta-catenin后瘤細(xì)胞凋亡的變化Fig. 2 The apoptotic alteration of tumor cell in SPC and SK cell lines with Delta-catenin overexpression The percent number of upper figure means only one experiment; *: P<0.05, compared with pCMV-Delta-catenin group

圖3　　在SK和SPC細(xì)胞系中過表達(dá)Delta-catenin后瘤細(xì)胞侵襲數(shù)量的變化Fig. 3 The number alteration of invasive tumor cell in SK and SPC cell lines with Delta-catenin overexpression.

3　　討論

Delta-catenin蛋白的表達(dá)與惡性腫瘤之間的關(guān)系研究已有較多報(bào)道［2-5］。包括我們在食管癌中關(guān)于Delta-catenin表達(dá)的最新研究在內(nèi)［1］，Delta-catenin蛋白及基因表達(dá)水平在多個(gè)所研究的惡性腫瘤中表達(dá)都明顯增加，而且它的陽性表達(dá)與腫瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。因此，把Delta-catenin作為一個(gè)預(yù)測惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的生物標(biāo)記物可能具有重要的臨床意義。然而，既然不久的將來可以把Deltacatenin作為臨床預(yù)測患者預(yù)后或判斷患者治療效果的腫瘤標(biāo)記物來應(yīng)用，但是Delta-catenin促進(jìn)腫瘤增殖侵襲的確切機(jī)制卻仍然不清楚，這也為Delta-catenin檢測的臨床推廣增加了難度。因此，在本研究中我們針對Delta-catenin可能的促癌機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

眾所周知，MAPK家族成員p38、JNK、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated kinase，ERK)在多種細(xì)胞生理和病理?xiàng)l件下發(fā)揮重要的作用，而其中的p38、JNK對于細(xì)胞凋亡的促進(jìn)起主要影響［12］。本研究結(jié)果顯示，在肺癌細(xì)胞系中過表達(dá)Delta-catenin對p38及p-p38的表達(dá)水平并沒有影響，并且對JNK的表達(dá)也沒有影響，但卻顯著降低p-JNK的表達(dá)水平，而我們知道只有磷酸化的JNK才可以發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。以上結(jié)果說明，Deltacatenin可以明顯降低JNK蛋白的活性，而我們知道JNK蛋白活性的增加是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的主要途徑，那么Delta-catenin是否可以通過降低JNK的活性而減少腫瘤細(xì)胞的凋亡呢？因此，我們借助流式細(xì)胞術(shù)觀察了過表達(dá)Delta-catenin后JNK蛋白活性下降的同時(shí)腫瘤細(xì)胞的凋亡是否明顯減少。與我們的猜測一致，過表達(dá)Delta-catenin后肺癌細(xì)胞的凋亡比例也顯著減少，而我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Delta-catenin可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖［5］，也就是說Delta-catenin可能通過抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。此外，我們通過Matrigel基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Delta-catenin還可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。那么，結(jié)合本次研究結(jié)果得出，Deltacatenin高表達(dá)可能通過降低JNK通路的活性而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡比例的下降并進(jìn)而促進(jìn)了瘤細(xì)胞的增殖，也進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，這也印證了我們之前關(guān)于Delta-catenin高表達(dá)與腫瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)的結(jié)論。

總之，Delta-catenin促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性表型的機(jī)制可能比較復(fù)雜，因?yàn)槲覀冎暗难芯窟€顯示Delta-catenin可能通過改變小GTPases (包括RhoA、Cdc42和Rac1)的活性而促進(jìn)細(xì)胞骨架的重新裝配，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動能力增強(qiáng)，也就促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移［13］。所以，Delta-catenin可能通過多條通路來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，而且這些通路之間可能存在多處Crosstalk位點(diǎn)，如果我們今后能找到?jīng)Q定Delta-catenin多條信號傳遞通路的限制性位點(diǎn)，那么開發(fā)針對Delta-catenin的分子靶向藥物將會變得更加容易且高效。

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Delta-catenin protein reduces apoptosis of lung cancer cells via inhibiting the activity of JNK pathway

DONG Caifeng1, SUN Lihong2, ZHANG Jian3, ZHANG Chaojun1, ZHANG Junyi4
(1.Department of Respiratory, the Affiliated Hospital of Chifeng University, Chifeng 024000, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 2.Clinical Laboratory, the Affiliated Hospital of Chifeng University, Chifeng 024000, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 3.Department of Pathology, People’s Hospital of Wuhai City, Wuhai 016000, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 4.Department of Pathology, the Affiliated Hospital of Chifeng University, Chifeng 024000, Inner Mongolia Autonomous Region, China)
Correspondence to: ZHANG Junyi E-mail: zhangjunyi77@sina.com

Background and purpose: As a member of the catenin family, Delta-catenin protein could promote proliferation and invasion of tumor cells, but the accurate mechanism of Delta-catenin promoting cell proliferation is not clear. In the present study, we illustrated that Delta-catenin’s effect on cell apoptosis and their relationship with mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway, and the possible mechanism was also explored for Deltacatenin promoting invasion and proliferation of tumor cells. Methods: The alterations of p38 and c-jun N-terminal rinasel JNK protein activity were detected in SPC and SK lung cancer cell lines with Delta-catenin overexpression or not, by Western blot method. At the same time, the apoptotic number of tumor cells was also examined by FCM method. Furthermore, the number of invasive tumor cells was examined by Matrigel invasive experiment. Results: Compared with untreated group and empty vector group, the activity of p38 protein was unchanged in lung cancer cell lines with Delta-catenin overexpressed (P>0.05), but the activity of JNK protein was decreased significantly (P<0.05),meanwhile, apoptotic proportion of tumor cells were also reduced (P<0.05), and invasive ability of tumor cells was enhanced significantly (P<0.05). Conclusion: Delta-catenin probably decreases apoptosis number of lung cancer cells via inhibiting the activity of JNK pathway, and then promotes invasive ability of tumor cells.

Delta-catenin; Lung cancer; Cell apoptosis; c-jun N-terminal kinase pathway

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.11.004

R734.2

A

1007-3639(2016)11-0902-06

國家自然科學(xué)基金(81201844)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金(2014MS0869)；內(nèi)蒙古衛(wèi)計(jì)委醫(yī)療衛(wèi)生科研計(jì)劃項(xiàng)目(201303156)。

張俊毅E-mail：zhangjunyi77@sina.com

（2015-11-11

2016-03-07）