葉　青 綜述　江澤飛 審校

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院乳腺腫瘤科，北京 100071

循環(huán)腫瘤DNA檢測(cè)在乳腺癌診斷中的臨床應(yīng)用

葉青 綜述江澤飛 審校

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院乳腺腫瘤科，北京 100071

隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)檢測(cè)在乳腺癌中的應(yīng)用得到越來(lái)越多的關(guān)注。目前國(guó)內(nèi)外大量研究顯示ctDNA檢測(cè)技術(shù)在監(jiān)測(cè)腫瘤負(fù)荷、療效預(yù)測(cè)、早期診斷、預(yù)后分析等方面具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。在乳腺癌診療走向個(gè)體化精準(zhǔn)的時(shí)代，ctDNA檢測(cè)能夠?yàn)榛颊咛峁└鼮榫珳?zhǔn)的診斷，指導(dǎo)臨床治療。

循環(huán)腫瘤DNA；乳腺癌；診斷；臨床應(yīng)用

早在1948年，Mandel和Metais就在人的血漿中檢測(cè)出細(xì)胞外游離DNA的存在，由此拉開了游離DNA研究的序幕；1965年，Bendich的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)腫瘤與循環(huán)游離DNA(circulating cell-free DNA，cfDNA)存在相關(guān)性；1977年，Leon等人通過(guò)放射免疫測(cè)定法對(duì)比了正常人和腫瘤患者血中游離DNA的表達(dá)，表明血中游離DNA水平與腫瘤病程及療效相關(guān)；隨后更多證據(jù)表明血中游離DNA與原發(fā)腫瘤基因突變存在一致性［1］；2010年，García-Olmo等［2］的研究確定了游離DNA的致癌性。近幾年循環(huán)DNA的研究已成為癌癥診斷的熱門研究領(lǐng)域，在腫瘤負(fù)荷監(jiān)測(cè)、藥物療效預(yù)測(cè)、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)、早期診斷及預(yù)后分析等方面具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1　　循環(huán)腫瘤DNA (circulating tumor DNA，ctDNA)

1.1cfDNA與ctDNA

cfDNA是由正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤細(xì)胞等凋亡、壞死后釋放到血管中的游離的DNA片段組成的。這些DNA片段通常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核小體游離于循環(huán)中［3］。其中ctDNA特指能夠反映腫瘤基因組信息的cfDNA［4］。

關(guān)于ctDNA的釋放、降解機(jī)制目前尚無(wú)定論。目前認(rèn)為，ctDNA來(lái)源于壞死、凋亡的腫瘤細(xì)胞，或是腫瘤細(xì)胞的外排體［5］。而ctDNA的降解可能與肝臟和腎臟代謝相關(guān)，根據(jù)不同DNA片段大小、結(jié)構(gòu)其半衰期差異較大，范圍從10 min至2 h不等。

1.2ctDNA的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)及困難

組織學(xué)活檢能夠提供疾病的初始狀態(tài)，為疾病的診斷、治療提供重要的信息。盡管組織學(xué)檢測(cè)目前是臨床和科研測(cè)序的金標(biāo)準(zhǔn)，但是組織獲取、樣本保存、腫瘤異質(zhì)性等局限性限制了腫瘤組織測(cè)序的發(fā)展。因此，為了彌補(bǔ)組織活檢的局限性，研究者開展“液體活檢”工作。因能反映與組織相同的基因組信息，ctDNA成為補(bǔ)充替代組織學(xué)測(cè)序的最佳來(lái)源。相對(duì)無(wú)創(chuàng)的ctDNA檢測(cè)不僅能夠反映短時(shí)間體內(nèi)瘤負(fù)，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)藥物療效，而且在保證較高敏感性和特異性的同時(shí)能夠提早預(yù)測(cè)病情變化。

在原理上，ctDNA測(cè)序簡(jiǎn)單易懂，但該技術(shù)用于臨床仍面臨著許多技術(shù)難點(diǎn)和現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。首先是對(duì)于大部分腫瘤患者而言，在全部的血漿游離DNA中，ctDNA只占很小的一部分，大約只有千分之幾［6］，因此，目標(biāo)突變信號(hào)相對(duì)與背景信號(hào)其強(qiáng)度極低。其次，因每毫升血漿中僅有幾十至幾百納克(ng)的游離DNA，分離樣本量極少的cfDNA難度大。傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法提取效率低，而商業(yè)試劑盒簡(jiǎn)便易行，且可以針對(duì)不同目標(biāo)檢測(cè)設(shè)計(jì)專門的試劑盒。Kuang等［7］對(duì)比了以下3種商業(yè)試劑盒分離cfDNA的效能：QIAamp DNA Micro 試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)、NucleoSpin Plasma XS(德國(guó)Macherey-Nagel公司)和Wizaed(美國(guó)Promega公司)，結(jié)果顯示QIAamp DNA Micro試劑盒更適用于ctDNA的檢測(cè)。此外，由于ctDNA檢測(cè)技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室和操作人員要求較高，檢測(cè)設(shè)備昂貴，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)不一，也難以在短時(shí)間內(nèi)推廣至臨床應(yīng)用。

1.3ctDNA檢測(cè)方法

理論上，所有檢測(cè)基因組信息的手段都可以檢測(cè)ctDNA，但是由于以sanger測(cè)序?yàn)榇淼囊淮鷾y(cè)序方法檢測(cè)敏感性不高，長(zhǎng)久以來(lái)一直限制著ctDNA檢測(cè)的發(fā)展。隨著二代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，使cfDNA的檢測(cè)成為可能。目前，常用的方法包括實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)、BEAMing(beads，emulsion，amplification, and magnetics)技術(shù)［6］、基因芯片技術(shù)和二代測(cè)序技術(shù)等，這些檢測(cè)各有其優(yōu)缺點(diǎn)(表1)。

表1　常用循環(huán)腫瘤DNA檢測(cè)技術(shù)比較Tab. 1 Commonly used technologies to analyze cell-free DNA

2　　ctDNA檢測(cè)在乳腺癌中的臨床應(yīng)用

關(guān)于乳腺癌ctDNA的研究，可以追溯到1977年，Leon等人發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者的血液中游離DNA水平顯著上升，通過(guò)放射免疫檢測(cè)法他們檢測(cè)到這些游離DNA范圍在0～2 000 ng/mL間波動(dòng)［1］。此后，大量乳腺癌的ctDNA臨床應(yīng)用的文獻(xiàn)被報(bào)道，這些應(yīng)用主要集中在ctDNA與腫瘤負(fù)荷監(jiān)測(cè)、藥物療效預(yù)測(cè)、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、早期診斷及預(yù)后分析等方面。

2.1ctDNA與腫瘤負(fù)荷監(jiān)測(cè)

腫瘤負(fù)荷監(jiān)測(cè)是指對(duì)腫瘤危害機(jī)體程度的監(jiān)測(cè)，包括腫瘤大小、活躍程度、轉(zhuǎn)移情況等，是乳腺癌患者管理的重要內(nèi)容之一。臨床實(shí)踐中，一般通過(guò)影像、蛋白質(zhì)類生物標(biāo)志物(CEA、CA15-3和CA-125)來(lái)監(jiān)測(cè)腫瘤負(fù)荷。而影像學(xué)檢查有時(shí)難以區(qū)分腫瘤輕微的變化，腫瘤標(biāo)志物(如CA15-3)監(jiān)測(cè)雖便捷但前期研究表明其敏感性僅為60%～70%［8］。ctDNA因其特有的優(yōu)勢(shì)，有望成為監(jiān)測(cè)腫瘤負(fù)荷的特異性標(biāo)志物。

對(duì)于晚期乳腺癌患者，有研究報(bào)道顯示，ctDNA能夠監(jiān)測(cè)實(shí)體瘤患者的腫瘤負(fù)荷，ctDNA的水平與臨床療效是顯著相關(guān)的。Dawson等［9］動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)了30例晚期乳腺癌患者的ctDNA、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)和CA15-3水平。研究者將循環(huán)中攜帶與組織相同的乳腺癌相關(guān)體細(xì)胞突變(其檢測(cè)了PIK3CA和TP53兩個(gè)基因)認(rèn)定為ctDNA。結(jié)果顯示，與CA15-3、CTC相比，在治療期間患者特異性ctDNA水平變化與療效相關(guān)性最強(qiáng)，具有更高的敏感性和特異性；并且ctDNA水平的增高平均能早于臨床影像檢查5個(gè)月提示疾病進(jìn)展。提示了對(duì)于晚期乳腺癌患者，ctDNA是監(jiān)測(cè)腫瘤負(fù)荷敏感、特異的生物標(biāo)志物，其水平變化提示腫瘤負(fù)荷變化從而反映藥物療效。在臨床療效評(píng)價(jià)不確定如疾病穩(wěn)定，或是病灶分離情況出現(xiàn)時(shí)，ctDNA檢測(cè)可能更有優(yōu)勢(shì)。

對(duì)于早期乳腺癌患者，ctDNA的檢測(cè)同樣能提示腫瘤的負(fù)荷。Tangvarasittichai等［10］研究了cfDNA水平與乳腺癌臨床分期間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Ⅱ～Ⅳ期患者cfDNA濃度顯著高于術(shù)后患者和健康對(duì)照組，并且腫塊大小、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與cfDNA濃度是顯著相關(guān)的。另外，Umetani等［11］同樣發(fā)現(xiàn)Ⅱ～Ⅳ期乳腺癌患者血漿DNA完整性顯著高于健康女性，ROC曲線分析顯示以cfDNA完整性診斷Ⅱ期以上乳腺癌患者的AUC值為0.79，診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌的AUC值為0.81。另外，近期發(fā)布的一項(xiàng)研究入組了87例接受新輔助治療的乳腺癌患者，分別在新輔助治療前、治療后和術(shù)后1年監(jiān)測(cè)ctDNA的甲基化(met-ctDNA)。結(jié)果顯示，新輔助治療后的met-ctDNA與殘留腫瘤負(fù)荷顯著相關(guān)(P=0.008)［12］。

ctDNA濃度、完整性的檢測(cè)均能夠間接反映腫瘤負(fù)荷。對(duì)于晚期乳腺癌通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)這些指標(biāo)能夠早于影像檢查判斷疾病進(jìn)展，為患者及時(shí)調(diào)整治療方案創(chuàng)造機(jī)會(huì)；對(duì)于早期乳腺癌患者通過(guò)檢測(cè)這些指標(biāo)能夠協(xié)助臨床診斷，提供更為全面的診斷信息，為治療方案的制定提供補(bǔ)充信息。

2.2ctDNA與藥物療效預(yù)測(cè)

乳腺癌治療已經(jīng)進(jìn)入分子分型指導(dǎo)下的個(gè)體化治療的時(shí)代，通過(guò)檢測(cè)一些指標(biāo)能很好地預(yù)測(cè)患者對(duì)某些治療的反應(yīng)，這些指標(biāo)包括：激素受體狀況、HER-2基因擴(kuò)增、Ki-67基因表達(dá)等。但這些預(yù)測(cè)指標(biāo)現(xiàn)行的檢測(cè)重復(fù)性較差，無(wú)法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤治療過(guò)程中的變化，而ctDNA的檢測(cè)因能特異性地反應(yīng)腫瘤基因組狀況并且無(wú)需通過(guò)組織活檢，在腫瘤療效預(yù)測(cè)方面(特別是預(yù)測(cè)耐藥)具有潛在應(yīng)用前景。

Stoetzer等［13］發(fā)現(xiàn)，新輔助化療不敏感組患者治療前cfDNA顯著高于治療獲益的患者。提示，治療前cfDNA水平可能預(yù)測(cè)新輔助化療獲益程度。Gevensleben等［14］利用數(shù)字PCR方法檢測(cè)乳腺癌患者cfDNA中HER-2基因拷貝數(shù)目的情況。驗(yàn)證組58例晚期乳腺癌患者，64%的HER-2陽(yáng)性患者血漿HER-2檢測(cè)為陽(yáng)性，94%的HER-2陰性患者的血漿HER-2檢測(cè)為陰性，其陽(yáng)性、陰性預(yù)測(cè)值分別為70%和92%。證明了cfDNA檢測(cè)乳腺癌患者HER-2基因擴(kuò)增情況的可行性。但Bechmann等［15］的結(jié)果卻完全不同，其前瞻性研究結(jié)果提示，采用RTFQ-PCR技術(shù)檢測(cè)cfDNA和HER-2基因擴(kuò)增情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組織學(xué)HER-2基因擴(kuò)增并未觀察到患者血漿HER-2基因拷貝數(shù)目的差異。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異可能是由于檢測(cè)技術(shù)敏感性、入組人群、操作規(guī)范、陽(yáng)性預(yù)測(cè)閾值的不同而引起的。因此采用cfDNA檢測(cè)技術(shù)評(píng)估部分患者HER-2基因擴(kuò)增情況，以此預(yù)測(cè)靶向治療的敏感性仍需要大型臨床研究證實(shí)。

另外一些小樣本研究結(jié)果顯示，cfDNA檢測(cè)能早于臨床預(yù)測(cè)獲得性耐藥的發(fā)生。對(duì)于內(nèi)分泌治療，已有研究表明ESR1配體結(jié)合域的活化是乳腺癌內(nèi)分泌耐藥的主要原因。Guttery等［16］檢測(cè)48例激素受體陽(yáng)性晚期乳腺癌患者cfDNA的ESR1突變情況，初步探索了利用cfDNA技術(shù)預(yù)測(cè)乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥的可行性。Murtaza等［17］利用全外顯子測(cè)序技術(shù)檢測(cè)ctDNA用于獲得性耐藥預(yù)測(cè)的可行性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6個(gè)與不同藥物耐藥相關(guān)的基因突變，該研究首次證明全外顯子測(cè)序技術(shù)檢測(cè)ctDNA提早預(yù)測(cè)治療耐藥發(fā)生的可行性。

2.3ctDNA與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

目前認(rèn)為，晚期乳腺癌是不可治愈的，原因可能與臨床診斷滯后相關(guān)。因此尋找早期、特異的指標(biāo)檢測(cè)微小轉(zhuǎn)移灶，預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)對(duì)于治愈腫瘤十分重要；既能通過(guò)治療提早干預(yù)臨床轉(zhuǎn)移灶的出現(xiàn)，又能避免部分術(shù)后治愈的患者接受過(guò)度的輔助治療。

Shaw等［18］通過(guò)分析輔助階段乳腺癌患者cfDNA水平，探究該方法用于篩選經(jīng)輔助治療治愈的患者、避免其接受過(guò)度治療的可能性。Olsson等［19］通過(guò)全基因組測(cè)序篩選出20例乳腺癌患者原發(fā)灶可信的特異腫瘤相關(guān)染色體重排，之后采用高度敏感的微滴數(shù)字PCR方法，連續(xù)監(jiān)測(cè)這20例輔助治療階段患者循環(huán)血與原發(fā)灶中相同的特異性DNA的重排情況，發(fā)現(xiàn)其預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移敏感變?yōu)?9%，且平均早于臨床復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移11個(gè)月。首次證明了ctDNA用于乳腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)的可能性。隨后Garcia-Murillas等［20］檢測(cè)55例接受新輔助化療患者原發(fā)灶腫瘤DNA突變情況，其中43例患者存在至少1個(gè)體細(xì)胞突變，通過(guò)個(gè)體化設(shè)計(jì)的數(shù)字PCR技術(shù)監(jiān)測(cè)這43例乳腺癌患者新輔助化療前、術(shù)后2～4周內(nèi)、輔助治療期間游離血漿中每個(gè)腫瘤特異性體細(xì)胞突變的情況。結(jié)果顯示，80%的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者在輔助治療連續(xù)隨訪期間檢測(cè)到ctDNA，50%的復(fù)發(fā)患者在術(shù)后首次血液檢測(cè)中就能檢測(cè)到ctDNA，并能平均早于臨床影像檢查7.9個(gè)月預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移發(fā)生。一系列的研究結(jié)果表明ctDNA檢測(cè)技術(shù)監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移可能較影像、癌標(biāo)等傳統(tǒng)手段更為特異，敏感。

2.4ctDNA與早期診斷

早期診斷是降低乳腺癌死亡率的最重要方法之一?，F(xiàn)行篩查手段主要依靠影像學(xué)方法，但影像學(xué)檢查的分辨率有限，有時(shí)難以區(qū)分良惡性，并且難以實(shí)現(xiàn)群體間的篩查。cfDNA檢測(cè)因取樣方便、檢測(cè)結(jié)果判讀客觀可能成為乳腺癌早診篩查的有力工具。

Gong等［21］分析了乳腺良、惡性疾病患者、健康者cfDNA濃度，ROC曲線分析結(jié)果提示cfDNA用于診斷3組人群的特異性均大于0.9，提示cfDNA濃度的檢測(cè)能夠用于早期診斷。近期發(fā)布的一項(xiàng)研究納入了749例早期乳腺癌、良性疾病和健康者，僅檢測(cè)6個(gè)基因的甲基化情況診斷乳腺癌的特異性和敏感性分別達(dá)到78.1%和82.4%，提示血漿中的表觀遺傳學(xué)的生物標(biāo)志物具有潛在診斷價(jià)值［22］。

2.5ctDNA與預(yù)后分析

目前關(guān)于ctDNA的預(yù)后價(jià)值尚存在爭(zhēng)議，各實(shí)驗(yàn)室間的結(jié)論并不一致，原因可能是多方面的，包括樣本處理、操作規(guī)范、DNA提取、檢測(cè)技術(shù)、入組人群等差異。

Madic等［23］納入40例三陰性乳腺癌患者，采用NGS平臺(tái)檢測(cè)26例腫瘤組織存在TP53體細(xì)胞突變，并且在21例匹配的血樣樣本中檢測(cè)相同TP53突變即ctDNA，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)這21例患者ctDNA的水平與疾病進(jìn)展時(shí)間(time to progression，TTP)和總生存期(overall survival，OS)的相關(guān)性。而Madhavan等［24］的研究結(jié)果卻截然不同。他們通過(guò)定量PCR方法檢測(cè)了晚期乳腺癌患者cfDNA完整性及水平，結(jié)果顯示cfDNA完整性與水平都能預(yù)測(cè)晚期乳腺癌無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)和OS。另外，Dawson等［9］的結(jié)果提示乳腺癌患者ctDNA水平與預(yù)后密切相關(guān)，含量越高5年生存率越低。Oca?a等［25］近期發(fā)布的一項(xiàng)入組了31項(xiàng)實(shí)驗(yàn)包括4 052例實(shí)體瘤患者的Meta分析結(jié)果也提示高水平的cfDNA和ctDNA與實(shí)體瘤患者的不良預(yù)后是顯著相關(guān)的。

3　　結(jié)語(yǔ)

隨著精準(zhǔn)醫(yī)療概念的提出，乳腺癌診療將從個(gè)體化走向精準(zhǔn)；以基因檢測(cè)為代表的精準(zhǔn)診斷模式，將會(huì)是未來(lái)乳腺癌精準(zhǔn)診療的重要組成部分。ctDNA檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展正是邁向精準(zhǔn)診斷重要的一步。但目前該領(lǐng)域研究仍處于起步階段，ctDNA研究還處于科研階段，其臨床應(yīng)用仍然任重道遠(yuǎn)。

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Clinical utility of circulating tumor DNA detection for diagnosis of breast cancer

YE Qing, JIANG Zefei
(Department of Breast Cancer, Affiliated Hospital of Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China)
Correspondence to: JIANG Zefei E-mail: jiangzf@hotmail.com

With the development of the next generation sequencing technology, considerable attention has been paid to the utility of circulating tumor DNA (ctDNA) detection in breast cancer. There are many clinical trials showed the ctDNA detection is a potential biomarker for the diagnosis, management and prognosis of breast cancer. ctDNA detection can provide a more accurate diagnosis for patients to guide clinical treatment in precision medicine era.

Circulating tumor DNA; Breast cancer; Diagnosis; Clinical utility

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.11.012

R730.43

A

1007-3639(2016)11-0947-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81472477)。

江澤飛E-mail:jiangzf@hotmail.com

（2015-12-10

2016-03-10）