姜辰一，俞俊杰，阮　淵，趙　煒，韓邦旻，夏術(shù)階，趙福軍

1.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院泌尿外科，上海 200080；2.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬蘇北人民醫(yī)院泌尿外科，江蘇 揚(yáng)州225001；

LMO2蛋白在前列腺基質(zhì)細(xì)胞中介導(dǎo)的IL-11、FGF-9旁分泌促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖與侵襲

姜辰一1，俞俊杰2，阮淵1，趙煒1，韓邦旻1，夏術(shù)階1，趙福軍1

1.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院泌尿外科，上海 200080；2.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬蘇北人民醫(yī)院泌尿外科，江蘇 揚(yáng)州225001；

背景與目的：前列腺癌多發(fā)生于前列腺外周帶，前列腺增生多發(fā)于前列腺移行帶。前列腺疾病的帶性差異機(jī)制可能與前列腺組織微環(huán)境有關(guān)。該研究的前期研究提示，不同區(qū)帶來源的前列腺基質(zhì)細(xì)胞對上皮細(xì)胞的作用存在明顯差異，基因芯片篩查發(fā)現(xiàn)LMO2蛋白在前列腺外周帶基質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。該研究旨在分析前列腺基質(zhì)細(xì)胞LMO2基因的表達(dá)對前列腺癌細(xì)胞系增殖、侵襲能力的影響及其機(jī)制。方法：分別應(yīng)用慢病毒過表達(dá)載體和短發(fā)卡RNA(shRNA)建立過表達(dá)和低表達(dá)LMO2的前列基質(zhì)細(xì)胞，利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)、蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)分別檢測LMO2 mRNA和蛋白的表達(dá)；將不同處理的前列腺基質(zhì)細(xì)胞分別同PC-3細(xì)胞共培養(yǎng)，利用CCK-8檢測PC-3的增殖能力，利用基質(zhì)膠侵襲實驗檢測PC-3的侵襲能力；利用生物素標(biāo)記的人蛋白抗體芯片檢測過表達(dá)LMO2的前列腺基質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基中蛋白因子表達(dá)變化。結(jié)果：成功建立過表達(dá)及低表達(dá)LMO2的前列腺基質(zhì)細(xì)胞；CCK-8實驗及基質(zhì)膠實驗提示，與過表達(dá)LMO2的前列腺WPMY-1基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后，PC-3細(xì)胞的增殖和侵襲能力增強(qiáng)；與低表達(dá)LMO2的CAFs細(xì)胞共培養(yǎng)后，PC-3細(xì)胞的增殖和侵襲能力降低；蛋白芯片檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)LMO2后，前列腺外周帶基質(zhì)細(xì)胞分泌白介素-11(interleukin-11，IL-11)和成纖維細(xì)胞生長因子-9(fibroblast grouth factor-9，F(xiàn)GF-9)增多。結(jié)論：LMO2基因在前列腺外周基質(zhì)細(xì)胞中的高表達(dá)可能與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)；過表達(dá)LMO2的前列腺基質(zhì)細(xì)胞通過旁分泌IL-11、FGF-9等細(xì)胞因子促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖與侵襲。

前列腺腫瘤；基質(zhì)細(xì)胞；LMO2基因；旁分泌

在前列腺中，由成纖維細(xì)胞、炎性細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞與腺上皮細(xì)胞共同組成了前列腺組織微環(huán)境，同時微環(huán)境中各種細(xì)胞之間通過復(fù)雜的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行信息交流。前列腺基質(zhì)細(xì)胞主要由成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞組成，在正常前列腺的生長、發(fā)育過程中，基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間存在復(fù)雜但平衡的信息交流；然而，當(dāng)前列腺癌(prostate cancer，PCa)發(fā)生后，既定的信息交流平衡被打破，癌細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子至細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，創(chuàng)造有利于自身生長的腫瘤微環(huán)境，正常的基質(zhì)細(xì)胞受到微環(huán)境變化的刺激后會發(fā)生基質(zhì)反應(yīng)，部分細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblast，CAFs)，CAFs對癌細(xì)胞生長起到多方面的作用，主要包括促進(jìn)癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移。

Olumi等［1］研究發(fā)現(xiàn)，CAFs與正常前列腺來源基質(zhì)細(xì)胞在致腫瘤方面存在差異，CAFs能夠使正常前列腺上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，而正常組織來源的基質(zhì)細(xì)胞則不能。我們的前期研究也提示，正常前列腺外周帶來源的基質(zhì)細(xì)胞(peripheral zone derived stromal cell，PZSCs)和CAFs細(xì)胞之間除生物學(xué)功能存在差異［2］以外，基因表達(dá)譜也不盡相同，通過基因芯片篩查，我們發(fā)現(xiàn)LMO2基因表達(dá)在CAFs中高于PZSCs，這與Zhao等［3］的研究結(jié)果一致，于是我們進(jìn)一步研究了前列腺基質(zhì)細(xì)胞中LMO2在前列腺基質(zhì)-上皮對話中的作用。

1　　材料和方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

CAFs原代培養(yǎng)自上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院前列腺癌根治術(shù)獲得的組織標(biāo)本(前列腺癌經(jīng)病理證實)，培養(yǎng)時將組織切碎至約1 mm3大小，經(jīng)膠原酶消化后采用差異梯度離心法分離上皮細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞接種于含10%胎牛血清(美國Gibco公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)中，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)，每2天更換新鮮培養(yǎng)基，原代培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)代數(shù)不超過5代。本實驗已通過上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。WPMY-1前列腺基質(zhì)細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫；PC-3前列腺癌細(xì)胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。WPMY-1、PC-3細(xì)胞使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)，傳代時以0.25%胰蛋白酶-EDTA(美國Hyclone公司)消化。

1.2短發(fā)卡RNA(shRNA)質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

設(shè)計3條靶向抑制LMO2表達(dá)的shRNA以及陰性對照sh-NC(表1)，進(jìn)行BLAST分析，確保干擾位點的特異性。設(shè)計帶有shRNA正義鏈、反義鏈、酶切位點及環(huán)形序列的DNA鏈，插入酶切后的pGPHI/GFP/Neo質(zhì)粒，導(dǎo)入感受態(tài)大腸桿菌，篩選后挑取測序正確的單克隆菌群進(jìn)一步擴(kuò)增及質(zhì)粒抽提。利用LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)，將表達(dá)shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入CAFs細(xì)胞，培養(yǎng)6 h后換液。

表1　shRNA序列Tab. 1 shRNA sequences

慢病毒過表達(dá)載體構(gòu)建、包裝及轉(zhuǎn)染調(diào)取LMO2的cDNA序列，化學(xué)合成帶有酶切位點的LMO2全長cDNA，插入pLenti6.3/MCS/IRES2/ EGFP慢病毒質(zhì)粒，測序正確后擴(kuò)增并抽提質(zhì)粒，對Lenti6.3-LMO2質(zhì)粒及Lenti6.3空載體質(zhì)粒進(jìn)行慢病毒包裝。將細(xì)胞分為實驗組WPMY-1-LMO2(過表達(dá)LMO2的WPMY-1細(xì)胞)、陰性對照組WPMY-1-NC(空載體慢病毒轉(zhuǎn)染W(wǎng)PMY-1細(xì)胞)和空白對照組親本W(wǎng)PMY-1細(xì)胞。按照MOI=100稀釋慢病毒原液，分別加入各組細(xì)胞進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，利用含有殺稻瘟素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)

TRIzol(美國Invitrogen公司)法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，通過SYBR Green Ⅰ熒光法檢測各組LMO2 mRNA表達(dá)水平。每組分別設(shè)3個復(fù)孔，采ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)，以2-ΔΔCt計算相對表達(dá)倍數(shù)。LMO2上游引物序列：5’-CTGAAGGCCATCGACCAGTA-3’，下游引物序列：5’-TTGTCACAGGATG CGCAGAG-3’； GAPDH上游引物序列：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，下游引物序列：5’-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3’。

1.4蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測

RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。用RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，利用BCA法測定濃度，按每條泳道50 μg計算后上樣，于SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，LMO2一抗(購自美國Abcam公司)和GAPDH內(nèi)參一抗(購自美國Santa Cruz公司)按1∶1 000稀釋，4 ℃溫育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(購自美國Cell Signaling Technology公司)按1∶2 000稀釋，室溫溫育1.5 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.5CCK-8細(xì)胞增殖實驗

各組CAFs或WPMY-1細(xì)胞以每孔5×103個細(xì)胞接種于Transwell小室(6.5 mm直徑，0.4 μm孔徑，購自美國Corning公司)中，每組設(shè)3個復(fù)孔，每孔加入完全培養(yǎng)基200 μL；PC-3細(xì)胞以5×103個細(xì)胞/孔接種于24孔板上，每孔加入完全培養(yǎng)基500 μL；將Transwell小室嵌套于24孔板上建立共培養(yǎng)體系。檢測增殖時，丟棄上室，下室更換無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基500 μL，每孔加入50 μL CCK-8溶液(購自日本同仁化學(xué)株式會社)溫育3 h，吸取反應(yīng)液至96孔板，測定450 nm吸光度，連續(xù)5天分別檢測PC-3細(xì)胞的增殖情況。

1.6基質(zhì)膠細(xì)胞侵襲實驗

實驗前12 h使用Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)包被Transwell小室(6.5 mm直徑，8 μm孔徑)。以含1%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸PC-3細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，取200 μL共1×105個細(xì)胞加入Transwell小室，下室以每孔5×104個細(xì)胞分別加入各組CAFs或WPMY-1細(xì)胞，共培養(yǎng)24 h。檢測時以棉簽擦除上室Matrigel基質(zhì)膠及未侵襲的細(xì)胞，采用甲醛固定，結(jié)晶紫［生工生物工程(上海)股份有限公司］染色，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野計數(shù)，實驗獨(dú)立重復(fù)3次。

1.7生物素標(biāo)記的人蛋白抗體芯片檢測

人蛋白抗體芯片購自美國RayBiotech公司。待細(xì)胞生長至60 mm培養(yǎng)皿80%時更換無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每組取300 μL培養(yǎng)基，按照廣州瑞博奧生物科技有限公司蛋白提取操作說明提取培養(yǎng)基上清液中蛋白并測定濃度，對樣本進(jìn)行生物素標(biāo)記后，按照蛋白芯片檢測說明進(jìn)行封閉、雜交、洗滌操作，用芯片掃描儀(GenePix 4000B，美國Axon Instruments公司)掃描芯片，GenePix Pro 6.0軟件讀取原始數(shù)據(jù)。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理

2　　結(jié)果

2.1RTFQ-PCR檢測各組細(xì)胞LMO2 mRNA的表達(dá)

shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CAFs細(xì)胞 48 h后，提取RNA。用RTFQ-PCR檢測LMO2 mRNA的表達(dá)量。3條shLMO2干擾序列相對shNC序列均能抑制CAFs中LMO2的表達(dá)，其中CAFshLMO2-1組LMO2 mRNA表達(dá)是對照組的0.343倍，CAFshLMO2-2組LMO2表達(dá)是對照組的0.392倍，CAFshLMO2-3組LMO2表達(dá)是對照組的0.752倍(圖1A)?？梢妔hLMO2-1對LMO2 mRNA抑制效果最好，CAFshLMO2-1用于后續(xù)實驗。

利用過表達(dá)LMO2的慢病毒感染W(wǎng)PMY-1細(xì)胞建立過表達(dá)LMO2蛋白的WPMY-1-LMO2細(xì)胞系，空載體慢病毒感染W(wǎng)PMY-1細(xì)胞建立陰性對照組WPMY-1-NC細(xì)胞系，未經(jīng)處理的WPMY-1細(xì)胞作為空白對照，細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)并提取RNA，RTFQ-PCR檢測各組LMO2 mRNA表達(dá)情況。WPMY-1-NC細(xì)胞的LMO2 mRNA表達(dá)量是空白對照組細(xì)胞的1.08倍，WPMY-1-LMO2細(xì)胞LMO2 mRNA表達(dá)量是空白對照組細(xì)胞的1209.37倍(圖1B)。慢病毒浸染前列腺基質(zhì)細(xì)胞WPMY-1細(xì)胞后，目的基因LMO2 mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)。

2.2Western blot檢測各組細(xì)胞LMO2蛋白的表達(dá)

檢測不同shRNA轉(zhuǎn)染CAF細(xì)胞48h后各組細(xì)胞LMO2蛋白的表達(dá)水平，shLMO2-1和shLMO2-2均能有效干擾LMO2蛋白的表達(dá)(圖1C)。檢測慢病毒感染各組WPMY-1細(xì)胞后LMO2蛋白的表達(dá)水平，WPMY-1-LMO2細(xì)胞的LMO2蛋白表達(dá)量明顯高于WPMY-1-NC陰性對照組和WPMY-1空白對照組(圖1D)。

2.3CCK-8實驗檢測各組基質(zhì)細(xì)胞對PC-3細(xì)胞增殖能力的影響

PC-3單獨(dú)培養(yǎng)以及同CAFshLMO2-1、CAFshNC分別共培養(yǎng)5天。第1、2和3天，各組間細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計學(xué)意義；在第4、5天時PC-3/ CAFshLMO2-1共培養(yǎng)組與PC-3/CAFshNC共培養(yǎng)組相比，PC-3細(xì)胞增殖能力降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2A)?？梢姡种艭AF細(xì)胞LMO2表達(dá)后，PC-3細(xì)胞增殖能力降低。

PC-3單獨(dú)培養(yǎng)及同WPMY-1-LMO2、WPMY-1-NC分別共培養(yǎng)5天。第1、2、5天，組間細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在第3、4和5天時PC-3/WPMY-1-LMO2共培養(yǎng)組的PC-3細(xì)胞增殖速度快于PC-3/WPMY-1-NC共培養(yǎng)組及PC3單獨(dú)培養(yǎng)組(P<0.05，圖2B)?？梢?，過表達(dá)WPMY-1細(xì)胞LMO2表達(dá)可促進(jìn)PC-3細(xì)胞增殖。

2.4基質(zhì)膠侵襲實驗檢測各組基質(zhì)細(xì)胞對PC-3細(xì)胞侵襲能力的影響

PC-3/CAFshLMO2-1共培養(yǎng)組PC-3細(xì)胞侵襲數(shù)為(33±5)個；PC-3/CAFshNC共培養(yǎng)組PC-3細(xì)胞侵襲數(shù)為(22±6)個；實驗組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2C)。PC-3/WPMY-1-LMO2共培養(yǎng)組PC-3細(xì)胞侵襲數(shù)為(38±5)個；PC-3/WPMY-1-NC共培養(yǎng)組PC-3細(xì)胞侵襲數(shù)為(23±4)個；實驗組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2D)。

圖1　　低表達(dá)和過表達(dá)LMO2的前列腺基質(zhì)細(xì)胞系的建立Fig. 1 Construction of LMO2 overexpressed and LMO2 low-expressed prostate stromal cells. A: LMO2 mRNA expression in CAFs after shRNA plasmids transfection; B: LMO2 mRNA expression in WPMY-1 after lentivirus transfection; C: LMO2 protein levels in CAFs after shRNA plasmids transfection; D: LMO2 protein levels in WPMY-1 after lentivirus transfection

圖2　　細(xì)胞增殖與侵襲實驗Fig. 2 Cells proliferation and invasion assay A: PC-3 proliferation reduced after co-culture with CAFshLMO2-1; B: PC-3 proliferation increased after co-culture with WPMY-1-LMO2 cells; C: PC-3 invasive down-regulated after knockdown of LMO2 in co-culture system; D: WPMY-1-LMO2 cells promoted PC-3 invasive after coculturing

2.5蛋白芯片檢測WPMY-1-LMO2分泌細(xì)胞因子含量的變化

分別提取WPMY-1-LMO2、WPMY-1-NC細(xì)胞培養(yǎng)上清液并進(jìn)行蛋白芯片檢測，共檢測出507種蛋白信號，去除背景信號，根據(jù)各組內(nèi)參均一化數(shù)據(jù)，計算組間蛋白表達(dá)量比值。在WPMY-1-LMO2細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中，28種細(xì)胞因子與對照組上調(diào)大于2倍，20種細(xì)胞因子下調(diào)大于2倍，其中兩個重要的細(xì)胞因子IL-11和FGF-9表達(dá)量較對照組分別上調(diào)21.99倍和20.49倍，122種蛋白因子可能在WPMY-1-LMO2細(xì)胞中特異性表達(dá)(圖3)。

圖3　　蛋白芯片檢測結(jié)果Fig. 3 The concentration of IL-11 and FGF-9 up-regulated in supernatant of LMO2 overexpressed WPMY-1-LMO2 cells compared with that in supernatant of WPMY-1-NC cells

3　　討論

前列腺組織微環(huán)境由腺上皮細(xì)胞及多種基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，其中基質(zhì)細(xì)胞主要包括成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞。正常前列腺的生長、發(fā)育依賴組織微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)：基質(zhì)細(xì)胞能促使上皮細(xì)胞分化，腺腔形成，而上皮細(xì)胞則介導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞向成熟基質(zhì)細(xì)胞分化。而當(dāng)前列腺癌發(fā)生后，基質(zhì)-上皮間穩(wěn)定的信息交流被打破，癌細(xì)胞釋放多種物質(zhì)刺激基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)變，癌細(xì)胞旁的基質(zhì)細(xì)胞受到“激活”而轉(zhuǎn)化為CAFs，它們通過分泌生長因子、蛋白酶及激素等活性產(chǎn)物，以旁分泌的方式廣泛影響前列腺癌的生長。研究發(fā)現(xiàn)，CAFs與正常前列腺來源的基質(zhì)細(xì)胞在致腫瘤方面存在差異，CAFs能夠使正常前列腺BPH-1上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，而正常組織來源的基質(zhì)細(xì)胞則不能［1，4］；此外，不同來源的前列腺基質(zhì)細(xì)胞對前列腺癌細(xì)胞的作用也存在明顯差異［2］?；|(zhì)-上皮之間復(fù)雜的信號通路是當(dāng)今前列腺癌研究的重點之一，其中，CAFs異常分泌的TGF、IGF、CXCL等多種細(xì)胞因子已被證實與前列腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)［5］，隨著人們對前列腺癌相關(guān)微環(huán)境研究的深入，以基質(zhì)-上皮間信號交流為靶點的治療研究開始受到人們的重視［6］。CAFs與正常前列腺PZSCs除了在形態(tài)和功能上有明顯的區(qū)別外，在基因表達(dá)譜也存在差異。我們前期利用基因芯片篩選了正常前列腺移行帶來源的基質(zhì)細(xì)胞(TZSCs)、PZSCs和CAFs之間的差異基因，發(fā)現(xiàn)了LMO2基因在CAFs中表達(dá)明顯高于PZSCs和TZSCs。Zhao等［3］也通過cDNA芯片篩查了CAFs與正常基質(zhì)細(xì)胞之間的差異基因，其中LMO2的差異表達(dá)與我們的結(jié)果一致。因此我們推測，前列腺基質(zhì)細(xì)胞中的LMO2差異性表達(dá)對前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展可能產(chǎn)生重要影響。

LMO2基因是LIM-only(LMO)家族的一個成員，首先發(fā)現(xiàn)于攜帶t(11;14)(p13;q11)易位的急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)［7］。LMO2蛋白屬于鋅指結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能與GATA1、E47、TAL1和Ldb1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成復(fù)合體，識別DNA上相鄰的GATA和E-box序列，對下游基因的轉(zhuǎn)錄起到調(diào)控作用［8］。有研究發(fā)現(xiàn)，LMO2在T-ALL染色體易位的發(fā)生中起到重要的作用，因此被認(rèn)為是一種重要的癌基因［9-10］。LMO2在血細(xì)胞分化［11］及血液系統(tǒng)腫瘤［12］中的機(jī)制研究較為透徹，近幾年也有研究發(fā)現(xiàn)，LMO2在前列腺癌［13］、胃癌［14］、血管瘤［15］中對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也可能發(fā)揮重要的作用，然而，LMO2在前列腺癌CAFs中通過基質(zhì)-上皮對話作用于癌細(xì)胞的機(jī)制尚未見報道。

本研究首先利用shRNA特異性的抑制了前列腺癌相關(guān)CAFs中LMO2的表達(dá)，建立了低表達(dá)LMO2蛋白的CAFshLMO2基質(zhì)細(xì)胞；利用慢病毒過表達(dá)載體成功建立了穩(wěn)定過表達(dá)LMO2的前列腺基質(zhì)細(xì)胞株WPMY-1-LMO2；然后分別將各組不同處理的前列腺基質(zhì)細(xì)胞與前列腺癌PC-3細(xì)胞建立體外共培養(yǎng)系統(tǒng)；通過CCK-8細(xì)胞增殖實驗及基質(zhì)膠侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，LMO2在前列腺基質(zhì)細(xì)胞中過表達(dá)能促進(jìn)PC-3細(xì)胞增殖與侵襲，抑制LMO2的表達(dá)，基質(zhì)細(xì)胞對PC-3增殖、侵襲能力有所降低。由于Transwell雙室共培養(yǎng)體系是一種非直接接觸的共培養(yǎng)系統(tǒng)，基質(zhì)細(xì)胞對PC-3細(xì)胞增殖侵襲能力的影響必然通過旁分泌細(xì)胞因子實現(xiàn)，因此我們利用蛋白芯片分析了過表達(dá)LMO2的WPMY-1-LMO2細(xì)胞與對照組培養(yǎng)基上清中細(xì)胞因子表達(dá)量的差異，發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞因子上調(diào)(圖3)，另有多種細(xì)胞因子可能在WPMY-1-LMO2細(xì)胞特異表達(dá)。其中，白介素-11(interleukin-11，IL-11)和成纖維細(xì)胞生長因子-9(fibroblast growth factor-9，F(xiàn)GF-9)兩種細(xì)胞因子的分泌量在WPMY-1-LMO2細(xì)胞培養(yǎng)基上清中顯著增加。IL-11是IL-6家族的成員之一，可特異性結(jié)合其受體IL-11Rα，繼而通過與IL-11Rα結(jié)合的gp130蛋白激活細(xì)胞內(nèi)JAK/STAT3、PI3K/mTOR等重要信號通路，促進(jìn)細(xì)胞生長。Putoczki等［16］研究發(fā)現(xiàn)，IL-11在胃腸道腫瘤中促進(jìn)癌細(xì)胞生長的作用較IL-6更加重要；Onnis等［17］研究發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下前列腺癌細(xì)胞分泌IL-11增加，通過自分泌作用促進(jìn)自身生長；Marusyk等［18］建立了過表達(dá)不同細(xì)胞因子的乳腺癌細(xì)胞，通過建立不同的共培養(yǎng)體系發(fā)現(xiàn)IL-11在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。FGF-9是FGFs家族成員之一，主要與FGF受體-2/3(FGFR-2/3)結(jié)合，進(jìn)而激活RAS/ RAF/MAPK、PI3K/AKT等信號通路，廣泛調(diào)節(jié)細(xì)胞活性。FGF-9作為性別決定的重要信號分子，對胚胎期睪丸的形成和發(fā)育也起到重要作用［19］；在前列腺癌中，Teishima等［20］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-9能促進(jìn)前列腺癌增殖與侵襲，Li等［21］研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌細(xì)胞旁分泌的FGF-9在骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境中發(fā)揮重要的成骨作用?？梢?，IL-11和FGF-9兩種細(xì)胞因子在腫瘤微環(huán)境中都起到重要作用，因此，我們認(rèn)為過表達(dá)LMO2的前列腺基質(zhì)細(xì)胞主要通過旁分泌以上兩種細(xì)胞因子促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖與侵襲；LMO2在不同來源前列腺基質(zhì)細(xì)胞中的差異表達(dá)及相關(guān)信號通路可能成為以前列腺微環(huán)境為靶向治療前列腺癌的潛在靶點，然而，對于前列腺基質(zhì)細(xì)胞中LMO2的上調(diào)機(jī)制及其對下游靶基因的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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LMO2 in prostate stromal cells promotes prostate cancer cells proliferation and invasion through paracrine of IL-11 and FGF-9

JIANG Chenyi1, YU Junjie2, RUAN Yuan1,3, ZHAO Wei1, HAN Bangmin1,XIA Shujie1, ZHAO Fujun1

(1. Department of Urology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200080, China; 2. Department of Urology, Subei People’s Hospital, Medical School of Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China)
Correspondence to: ZHAO Fujun E-mail: drzhaofujun@yahoo.com

Background and purpose: The previous research has found that the prostate stromal cells derived from different prostate zones have distinct effect on prostate epithelial cells. We also revealed that LMO2 protein was highly expressed in PZ stromal cells (PZSCs) and prostate cancer associated fibroblasts (CAFs) compared with TZ stromal cells. This study investigated the effect of LMO2 protein in prostate stromal cells on proliferation and invasion of prostate cancer PC-3 cells and its mechanisms. Methods: Lentivirus overexpression vectors were used to establish LMO2-overexpressed prostate WPMY-1 stromal cell line. shRNA plasmids were used to suppress LMO2 in CAFs. LMO2 mRNA and protein level of both WPMY-1 and CAFs were evaluated by real-time fluorescent quantitativepolymerase chain reaction (RTFQ-PCR) and Western blot. Then, PC-3 cells were co-cultured with different prostate stromal cells and the in vitro proliferation and invasion of PC-3 were measured by CCK-8 and matrigel invasion assays respectively. Results: When co-cultured with LMO2-overexpressed prostate stromal cells, both proliferation and invasion of PC-3 were improved. However, when co-cultured with CAFs which have inhibited expression of LMO2, the proliferation and invasion of PC-3 were reduced. The protein array profiling found that both interleukin-11 (IL-11) and fibroblast growth factor-9 (FGF-9) were enhanced extensively in the supernatant collected from LMO2-overexpressed WPMY-1 cells. Conclusion: The expression of LMO2 in prostate stromal cells could be responsible for development of prostate cancer. Paracrine of cytokines, such as IL-11 and FGF-9, from LMO2-overexpressed stromal cells had effects on the proliferation and invasion of prostate cancer cells.

Prostatic neoplasms; Stromal cells; LMO2 gene; Paracrine

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.11.003

R737.25

A

1007-3639(2016)11-0894 -08

國家自然科學(xué)基金(81072114, 81300625)。

趙福軍E-mail: drzhaofujun@yahoo.com

（2015-09-05

2016-11-29）