王園園，張麗靜，韓曉東，翟叢劼，杜志堅(jiān)，張　軍，趙增仁

河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普外科，河北 石家莊 050031

miR-31在結(jié)直腸癌患者血清中的表達(dá)及對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖及凋亡的影響

王園園，張麗靜，韓曉東，翟叢劼，杜志堅(jiān)，張軍，趙增仁

河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普外科，河北 石家莊 050031

背景與目的：microRNA與腫瘤關(guān)系密切，血清miRNAs可以作為篩選和監(jiān)測結(jié)直腸癌的有效指標(biāo)。該研究旨在檢測結(jié)直腸癌患者血清中miR-31的表達(dá)水平，并分析miR-31對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響。方法：收集40例結(jié)直腸癌患者和35例健康人群作為對(duì)照，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)，檢測其血清miR-31的表達(dá)水平，并分析結(jié)直腸癌患者血清miR-31的表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將miR-31模擬物(miR-31 mimics)和抑制劑(miR-31 inhibitor)轉(zhuǎn)染到HCT116細(xì)胞，采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡及周期改變。結(jié)果：結(jié)直腸癌患者血清中miR-31的表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組，miR-31表達(dá)與結(jié)直腸癌分化程度有關(guān)。轉(zhuǎn)染miR-31mimics組HCT116細(xì)胞生長增快，而轉(zhuǎn)染miR-31抑制劑后細(xì)胞增殖能力明顯降低(P＜0.01)；同時(shí)miR-31mimics組細(xì)胞凋亡所占比例較miR-31抑制劑組和陰性對(duì)照組(miR-control，NC)明顯減少，尤其是晚期凋亡細(xì)胞減少為著；轉(zhuǎn)染miR-31抑制劑組，G1期細(xì)胞較miR-31 mimics組和NC組明顯增多。結(jié)論：miR-31在結(jié)直腸癌患者血清中表達(dá)顯著上調(diào)，miR-31可能通過促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡而參與了結(jié)直腸癌的發(fā)展進(jìn)程，有望成為結(jié)直腸癌診斷的標(biāo)志物。

大腸癌；microRNA-31(miR-31)；血清；細(xì)胞增殖；凋亡

結(jié)直腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，早期可以通過手術(shù)取得很好的療效。由于大多數(shù)患者早期缺乏特異性癥狀和體征，患者就診時(shí)多數(shù)已處于中晚期。因此，臨床迫切需要尋找有效的方法在早期發(fā)現(xiàn)腫瘤。血漿miRNA作為一種非侵入性的腫瘤診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)的標(biāo)志物正顯示出良好的應(yīng)用前景。本研究的前期研究結(jié)果顯示，通過miRNA芯片技術(shù)能發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織中miR-31的表達(dá)明顯上調(diào)。本研究旨在探討血清 miR-31的表達(dá)并分析miR-31對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

1　　資料和方法

1.1研究對(duì)象

收集河北醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科2011年1月—2012年6月原發(fā)性結(jié)直腸癌手術(shù)患者40例(經(jīng)術(shù)后病理切片證實(shí))的臨床資料，術(shù)前均未接受過放化療和生物治療。其中男性25例，女性15例，平均年齡64.2歲。同時(shí)收集35例同期年齡匹配的健康體檢人群的外周血，且證實(shí)無腫瘤病史，其中男性19例，女性16例；年齡37～78歲，平均年齡63.4歲。結(jié)直腸癌患者和健康查體人群的年齡和性別匹配(P>0.05)。所有樣本的采集均獲得參與者本人的知情同意，本研究獲得河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2主要試劑

McCoys 5A培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司。TRIzol LS、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，miRNeasy迷你試劑盒購自美國Qiagen公司，Allin-One?miRNA qRT-PCR檢測試劑盒、miR-31及內(nèi)參U6的引物均購自廣州復(fù)能基因有限公司。miR-31mimics、抑制劑及miR-對(duì)照購自廣州市銳博生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)試劑購自同仁化學(xué)研究所；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(AnnexinⅤ-FITC)購自深圳欣博盛生物科技有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1RNA 的提取

200 μL低溫冷藏的血清，置于冰上融化，且充分混勻。加入3倍體積的TRIzol LS到樣本中，在震蕩器上充分混勻，室溫放置5～15 min進(jìn)行變性處理(為了控制提取過程中樣本間的差異，在變性處理之后加入內(nèi)參)。按等體積加入氯仿，震蕩器上充分混勻，室溫放置15 min，在4 ℃條件下，12 000×g離心15 min 抽提RNA。將上層水相迅速轉(zhuǎn)移到新管中，加入1.5倍體積的無水乙醇，兩者充分混勻。按照miRNeasy迷你試劑盒的操作手冊用吸附柱進(jìn)行RNA的富集。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)檢測血清miR-31的表達(dá)水平

取總RNA 0.5 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件：37 ℃×60 min，85 ℃×5 min。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 2 μL進(jìn)行RTFQ-PCR反應(yīng)。RTFQ-PCR按照All-in-One?miRNA qRT-PCR檢測試劑盒說明書操作，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，然后按95 ℃×10 s，60 ℃×30 s，72 ℃×10 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系及試劑用量均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。記錄每個(gè)標(biāo)本的Ct值，miR-31的相對(duì)表達(dá)量用2-△CT法計(jì)算。其中ΔCt＝CtmiR-31-CtU6。

1.3.3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

細(xì)胞培養(yǎng)：人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞用含10%胎牛血清的McCoys 5A培養(yǎng)液于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長狀況每2～3 d更換新鮮培養(yǎng)液1次。當(dāng)細(xì)胞融合率為70%～80%時(shí)，用胰蛋白酶消化并進(jìn)行細(xì)胞傳代或收集細(xì)胞。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染：收集處于對(duì)數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，重懸后接種于24孔板。然后采用LipofectamineTM2000將miR-31 mimics、抑制劑及miR-control轉(zhuǎn)染到HCT116細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后6 h，更換無血清培養(yǎng)液為新鮮完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4CCK-8法檢測不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖能力

將不同轉(zhuǎn)染組(miR-31mimics組、抑制劑組及miR-對(duì)照組)HCT116細(xì)胞于轉(zhuǎn)染后24 h消化細(xì)胞，接種于96孔板，按照CCK-8說明書分別于接種96孔板后第1、2、3和4 天向每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度(D450nm)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，D450nm為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡

收集轉(zhuǎn)染48 h后各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，用預(yù)冷PBS液充分洗滌細(xì)胞2次。按照Annexin Ⅴ-FITC試劑盒提供的說明書進(jìn)行溶液的配制，以250 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞并使其濃度至2×105個(gè)/mL～5×105個(gè)/mL，取195 μL的細(xì)胞懸液加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，輕輕混勻，間隔3 min后再加入10 μL濃度為20 μg/mL的碘化丙啶溶液，混勻后于室溫下避光溫育10 min，加入300 μL結(jié)合緩沖液，輕輕混勻后上流式細(xì)胞儀(BD Calibur，BD biosciences)進(jìn)行檢測分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s 表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)之間的差異采用單因素方差分析；大腸癌臨床病理特征與miR-31表達(dá)水平(-ΔCt)之間的關(guān)系分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　　結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌患者血清miR-31的表達(dá)

本研究收集了40例結(jié)直腸癌患者術(shù)前血清標(biāo)本，同時(shí)收集了35例健康人群(其性別、年齡構(gòu)成與結(jié)直腸癌患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)的血清標(biāo)本進(jìn)行miR-31檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者血清miR-31的表達(dá)顯著增加，結(jié)直腸癌患者血清miR-31的相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)為0.005 87，健康人群miR-31相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)為0.000 37，結(jié)直腸癌患者血清miR-31表達(dá)明顯高于正常健康人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 001，圖1)。

圖1　　結(jié)直腸癌和健康對(duì)照組血清miR-31的表達(dá)Fig. 1 Expression of serum miR-31 in colorectal cancer and the healthy control

2.2血清miR-31表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

血清miR-31表達(dá)和結(jié)直腸癌臨床病理特征間的關(guān)系見表1。miR-31在不同臨床分期，其表達(dá)水平不同。隨著病情進(jìn)展，血清miR-31有增高趨勢，Ⅲ期miR-31的表達(dá)較Ⅰ期和Ⅱ期增高，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在低分化結(jié)直腸癌中血清miR-31表達(dá)水平較高分化腺癌增高約2倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1　結(jié)直腸癌患者血清miR-31與臨床病理指標(biāo)關(guān)系Tab. 1 Relationship between the expression of serum miR-31 and clinicopathological features of colorectal carcinoma

2.3miR-31對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖活性的影響

使用CCK-8檢測不同組別HCT116細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞生長情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-31mimics組與miR對(duì)照組相比，細(xì)胞生長活力增加，而轉(zhuǎn)染miR-31抑制劑組細(xì)胞生長活力顯著降低(P<0.01，圖2)。

2.4miR-31對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞凋亡的影響

本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同組別HCT116細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，miR-31mimics組HCT116細(xì)胞的早期凋亡細(xì)胞所占比例為(1.80±0.73)%，晚期凋亡細(xì)胞為(6.01±0.61)%，活細(xì)胞數(shù)為(91.72±1.26)%；miR-31抑制劑組早期凋亡細(xì)胞為(3.31±0.38)%，晚期凋亡細(xì)胞所占比例為(14.19±2.72)%，活細(xì)胞數(shù)為(77.92±1.94)%；miR對(duì)照組早期凋亡細(xì)胞為(3.69±0.12)%，晚期凋亡細(xì)胞所占比例為(15.25±2.62)%，活細(xì)胞數(shù)為(75.06±1.88)%。3組之間早期凋亡細(xì)胞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而晚期凋亡細(xì)胞差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。miR-31mimics組晚期凋亡細(xì)胞較miR-31抑制劑組及miR對(duì)照組明顯減少，而miR-31抑制劑組和miR對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3)。

圖2　　miR-31 對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig. 2 Effects of miR-31 on cell proliferation

圖3　　miR-31對(duì)細(xì)胞凋亡的影響Fig. 3 Effects of miR-31 on cell apoptosis The miR-31 mimics compared with miR-31 inhibitor, P<0.05; The miR-31 mimics compared with negative control, P<0.05

2.5miR-31對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞周期的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同組別HCT116細(xì)胞周期分布情況。結(jié)果顯示，miR-31抑制劑組G1期細(xì)胞較miR-31 mimics和miR對(duì)照組細(xì)胞明顯增多，S期細(xì)胞明顯減少(P<0.05，圖4)。

圖 4　miR-31對(duì)細(xì)胞周期的影響Fig. 4 Effects of miR-31 on cell cycle distribution The miR-31 mimics compared with miR-31 inhibitor, P＜0.05; miR-31 inhibitor compared with negative control, P＜0.05

3　　討論

microRNA(miRNA)是一類長18～22 nt的單鏈非編碼RNA，通過特異性識(shí)別并結(jié)合靶mRNA的3’-UTR區(qū)，促進(jìn)靶mRNA降解和(或)阻礙翻譯過程而發(fā)揮作用［1］。越來越多的證據(jù)表明，miRNA參與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)，如結(jié)直腸癌中miR-139-5p低表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤與轉(zhuǎn)移有關(guān)［2］。本課題組前期采用miRNA芯片篩選發(fā)現(xiàn)，miR-31在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)增加［3］，提示miR-31可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

人miR-31首先在HeLa細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，研究證實(shí)，miR-31在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常且存在組織差異性。有研究表明，其可以作為癌基因(oncomiR)，如miR-31通過調(diào)控LATS2和PPP2R2A導(dǎo)致肺癌細(xì)胞生長加快［4］；miR-31可以通過阻抗或抑制缺氧誘導(dǎo)因子增加頭頸鱗癌細(xì)胞的進(jìn)展［5］；在結(jié)直腸癌，miR-31通過激活RAS信號(hào)通路，通過抑制RASA1翻譯，增加結(jié)腸癌細(xì)胞生長，促進(jìn)腫瘤生成［6］。相反，miR-31也可作為腫瘤抑制因子，如miR-31表達(dá)和乳腺癌的轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，miR-31通過介導(dǎo)的ITGA5、RDX和RhoA抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移［7］。miR-31通過調(diào)控細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白如E2F1、E2F2、FOXM1和MCM2等破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展［8］。另外有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，miR-31作為一個(gè)腫瘤抑制因子，通過直接調(diào)控HDAC2和CDK2表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移［9］。

miR-31在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，且能促進(jìn)腫瘤生長提示miR-31可能是一種腫瘤標(biāo)志物。許多研究表明，腫瘤患者血液中可檢測到miRNA異常表達(dá)［10-11］。食管鱗癌患者血清miR-31的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增高，且高表達(dá)miR-31者，無瘤生存期和總生存期均縮短［12］。另有學(xué)者檢測了結(jié)直腸癌患者血清中包括miR-31在內(nèi)的6個(gè)miRNA(包括miR-21、let-7g、miR-31、miR-92a、miR-181b和miR-203)的表達(dá)，證實(shí)在結(jié)直腸患者和正常對(duì)照組有顯著差異，且其表達(dá)和結(jié)直腸癌的進(jìn)展有關(guān)，而且同時(shí)檢測這6種miRNA可以很好的區(qū)分結(jié)直腸癌患者和非患者，其靈敏度和特異度分別高達(dá)90%和92.3%［13］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者血清miR-31表達(dá)明顯高于正常健康人群，并且在低分化腺癌中的表達(dá)水平高于高分化腺癌，提示miR-31可能參與了結(jié)直腸癌的進(jìn)展過程。另外本研究發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤分期升級(jí)，血清miR-31的表達(dá)有增高的趨勢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析其原因可能與我們納入研究的樣本量太少有關(guān)。

同時(shí)，本研究將人工合成的miR-31mimics和抑制劑轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步研究了miR-31的功能。結(jié)果證實(shí)，miR-31過表達(dá)組細(xì)胞生長明顯增快，且細(xì)胞凋亡減少；抑制miR-31表達(dá)可以降低細(xì)胞活力，同時(shí)可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯。細(xì)胞生長和侵襲是腫瘤細(xì)胞的重要特征，抑制細(xì)胞生長可以有效阻止腫瘤進(jìn)展。

本實(shí)驗(yàn)不足之處是需要加大研究的樣本量，同時(shí)可以聯(lián)合其他miRNA檢測，分析其聯(lián)合表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理資料間的關(guān)系，同時(shí)分析其用于結(jié)直腸癌診斷的靈敏性和特異性，以將其用于臨床，對(duì)結(jié)直腸癌患者的早期、無創(chuàng)診斷提供更好的參考價(jià)值。

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Expression of serum miR-31 in colorectal cancer patients and its effect on cell proliferation and apoptosis

WANG Yuanyuan, ZHANG Lijing, HAN Xiaodong, ZHAI Congjie, DU Zhijian, ZHANG Jun,ZHAO Zengren

(Department of General Surgery, First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China)
Correspondence to: ZHAO Zengren E-mail: zzr-doctor@163.com

Background and purpose: miRNA plays important roles in tumorigenesis. It has been reported that many kinds of serum miRNA serve as markers for tumor diagnosis and screening. This study aimed to detect the expression of serum miRNA-31 (miR-31) in colorectal cancer patients and to explore the effect of miR-31 on cell proliferation, apoptosis and cell cycle distribution. Methods: The expressions of miR-31 in 40 cases of colorectal cancer serum and 35 cases of the healthy control were examined by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (RTFQ-PCR). The correlation between miR-31 expression and clinicopathological features of colorectal cancer (including age, gender, depth of infiltration, lymph node metastasis, clinical stage) were further analyzed. The miR-31 mimics, inhibitor and miR-control (negative control) were transfected into HCT116 cells. The effect of miR-31 on cell proliferation was evaluated by CCK-8 method. Flow cytometry was used to examine the change of cell apoptosis and cell cycle. Results: Relative expression of serum miR-31 was significantly increased in cancer patients compared with healthy controls (P<0.01). Expression of serum miR-31 was higher in poorly differentiated carcinoma than that in well or moderately differentiated carcinoma (P<0.05). No correlation was found between serum miR-31 expression and otherclinicopathological variables. CCK-8 assay showed that after transfection with miR-31 mimics, the cell proliferation was increased, compared with miR-31 inhibitor and negative control group. Meantime, the apoptotic cell number was significantly decreased, particularly in late apoptosis. The cell number of G1stage was remarkably increased in miR-31 inhibitor group, compared with miR-31mimics and negative control group. Conclusion: The expression of serum miR-31 is higher in colorectal cancer. miR-31 can promote cell proliferation and inhibit the apoptosis of HCT116 cells. It might be a potential biomarker for colorectal cancer.

Colorectal cancer; miRNA-31(miR-31); Serum; Cell proliferation; Apoptosis

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.11.002

R735.3

A

1007-3639(2016)11-0888-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81072034)；河北省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(20110284)。

趙增仁E-mail：zzr-doctor@163.com

（2015-07-30

2016-01-15）