凌　泓，胡　欣

復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

BRCA1相關A蛋白復合物基因單核苷酸多態(tài)性與三陰性乳腺癌易感性研究

凌泓，胡欣

復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

背景與目的：BRCA1突變與三陰性乳腺癌發(fā)病相關目前已得到學者公認。該研究旨在分析BRCA1相關A蛋白復合物相關基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)與三陰性乳腺癌發(fā)病風險的關系，尋找和確定與漢族人群三陰性乳腺癌遺傳易感性相關的基因型和單體型。方法：2008年—2011年間414例在復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院接受原發(fā)性乳腺癌手術的三陰性乳腺癌患者和354例健康婦女進入本病例對照研究。通過對Abraxas、BRE、Rap80、NBA1和BRCC36基因組DNA的37個SNP位點的檢測，分析它們與三陰性乳腺癌的相關性。研究者隨后檢測了652例其他類型乳腺癌和890例健康女性的DNA以證實發(fā)現的SNP是否為三陰性特有的遺傳相關位點。結果：該研究在第一步研究中發(fā)現，NBA1啟動子區(qū)rs7250266位點突變的G等位基因在三陰性乳腺癌患者中的頻率顯著低于在正常女性中的頻率(0.14 vs 0.19，P<0.01)。對rs7250266位點基因分型顯示：與攜帶CC基因型個體比較，攜帶GC型個體的三陰性乳腺癌的發(fā)病風險顯著降低(GC∶OR=0.70，95%CI：0.51～0.97；GG∶OR=0.48，95%CI：0.21～1.07，P=0.03)。單體型分析也證實NBA1基因的不同單體型間三陰性乳腺癌發(fā)病風險不同。第二步的研究結果顯示，rs7250266位點突變在非三陰性的乳腺癌與正常人群中差異無統計學意義(0.19 vs 0.18，P=0.85)。結論：NBA1基因的rs7250266位點的單核苷酸多態(tài)性與漢族女性的三陰性乳腺癌發(fā)病風險相關，其突變型等位基因攜帶者罹患三陰性乳腺癌的風險低于野生型等位基因攜帶者。

單核苷酸多態(tài)性；三陰性乳腺癌；BRCA1基因；BRCA1相關蛋白復合物A

乳腺癌易感基因1(breast cancer type 1 susceptibility protein，BRCA1)是乳腺癌中最為被熟知、也是最為被廣泛深入研究的腫瘤易感基因。分子流行病學的研究發(fā)現，BRCA1基因的突變與三陰性乳腺癌或基底細胞樣乳腺癌的發(fā)生密切相關［1-2］，提示BRCA1和其相關基因參與到了乳腺細胞的分化和惡性轉化過程［2-3］。

BRCA1蛋白通過與蛋白復合體結合，組成功能復合物發(fā)揮作用。BRCA1共可組成3個蛋白復合物，即BRCA1相關A、B和C蛋白復合物［4］。最新研究證實，BRCA1相關A蛋白復合物包含了5個蛋白亞基(Abraxas、Brcc36、Rap80、BRE和NBA1)，A復合物作為BRCA1的一個重要的蛋白復合物，能夠引導BRCA1蛋白定位于DNA損傷部位，啟動DNA修復［5］。其他文獻報道稱BRCA1的A復合物被發(fā)現也參與了細胞G2/M周期的調控［6-7］。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)指在基因組水平上由于單個核苷酸位置上存在轉換、顛換、插入、缺失等變異所引起的DNA序列多態(tài)性。國內外的許多研究已經證實，SNP與包括惡性腫瘤在內的多種疾病有顯著的相關性，而一些SNP的特定基因型與特定疾病的易感性密切相關［8-10］。由于BRCA1是通過與其他蛋白結合成蛋白復合物發(fā)揮作用的，因此結合蛋白的異常也可能引起整個蛋白復合物的功能異常。文獻也證實BRCA1相關A蛋白復合物的相關基因突變同樣與乳腺癌相關。對BRCA1的SNP的研究已經很多，但對BRCA1蛋白復合物的基因的SNP檢測并不多。特別是亞裔人群的相關報道更罕見。因此我們選擇對BRCA1相關A蛋白復合物的相關基因進行SNP檢測，希望找到中國漢族女性特有的遺傳相關的位點。

1　　資料和方法

1.1臨床資料

研究經復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準后開展。納入自2008年—2011年在復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科就診的漢族原發(fā)性乳腺癌患者，入組條件包括：經病理證實為乳腺浸潤性導管癌；年齡小于65歲；無其他原發(fā)腫瘤病史；所有患者都有原發(fā)灶的病理組織可供進一步檢查。所有的血樣都是在患者初次接受治療前采集的。研究入組的對照組成員為同期接受檢查的沒有腫瘤史的正常婦女。第一部分研究入組了414例三陰性乳腺癌患者和354例健康對照者，第二部分入組652例非三陰性乳腺癌患者和890例健康對照者。所有入組對象在采集血樣前都簽署了知情同意書。血樣中的基因組DNA被抽提。

1.2SNP位點的選取

選擇SNP位點參考國際人類基因組單體型圖計劃提供的SNP公共數據庫(http://hapmap.ncbi.nlm. nih.gov/)，從所檢測基因5’端上游2 kb起到基因結束，除內含子外全部MAF>5%的SNP。并包含標簽SNP(tSNP)。根據HapMaP的tagger算法，限制條件為MAFs>0.05且r2>0.8。最終有37個SNP位點接受了檢測。

1.3基因型檢測

本項目第一部分研究采用Sequenom公司MassARRAY平臺iPLEX Gold Assay方法進行基因分型檢測。第二部分采用的是TaqMan assays(Applied Biosystems，Foster City，USA)進行基因分型檢測。

1.4統計學處理

Hardy-Weinberg平衡采用卡方檢驗，應用Haploview軟件進行計算。對MAF、各位點比較、基因分型比較及LD-plot圖繪制均使用Haploview軟件。各基因的單體型分析采用了在線軟件SNPstats(http://bioinfo.iconcologia.net/SNPstats)進行。兩組人群的基本信息的分析采用SPSS 17.0統計學軟件。P<0.05為差異有統計學意義。

2　　結果

2.1rs7250266位點突變與漢族女性三陰性乳腺癌遺傳易感相關

在第一部分研究中，各SNP在患者和正常人群中出現頻率的比較見表1。位于NBA1啟動子的rs7250266位點，其突變型等位基因G在三陰性乳腺癌患者中的出現頻率(14%)顯著小于正常人群(19%，P<0.01)。檢測各位點中的成功率都大于95%，除去MAF等于零的位點，所有的位點經哈迪-溫伯格平衡檢驗都大于0.05，進入下一步基因分型研究。

基因分型與疾病相關性分析顯示，rs7250266在患者和正常女性中的基因分型差異有統計學意義(表2)。進一步分析顯示，rs7250266的突變堿基作為顯性基因時，顯示出與三陰性乳腺癌的相關性——攜帶突變型等位基因的婦女發(fā)病風險小于攜帶野生型的婦女(OR=0.67，P=0.01)。

表1　患者和正常人群中SNP出現頻率的比較Tab. 1 Allele frequencies of each SNPs in patients and controls

表2　基因分型與疾病相關性分析Tab. 2 Associations between each SNPs genotypes and TNBC risk

圖1　　5個檢測基因SNP的連鎖不平衡分析Fig. 1 Linkage disequilibrium analysis of the BRCA1-A complex genes SNPs A: Rap80; B: BRCC36; C: Abraxas; D: BRE; E: NBA

5個研究基因的連鎖不平衡分析見圖1。

NBA1基因的兩個位點rs2278256和rs7250266有很強的連鎖相關性(D’值為0.99，r2值為0.37)。單體型分析顯示：乳腺癌患者和健康人群的

Abraxas、Brcc36、Rap80和BRE這4個基因的單體型間差異無統計學意義。NBA1基因中有5個SNP(rs7250266、rs2278256、rs144376330、rs10403581和rs3745185)的MAF超過0.01，進入單體型分析。其中主要單體型為野生型的rs7250266(C)/rs2278256(A)/rs144376330(C)/ rs10403581(A)/rs3745185(G)，占全部人群的52.8%。和這個主要單體型相比，單體型rs7250266(G)/rs2278256(G)/rs144376330(C)/ rs10403581(C)/rs3745185(G)攜帶者及單體型rs7250266(G)/rs2278256(G)/rs144376330(C)/ rs10403581(A)/rs3745185(G)攜帶者的三陰性乳腺癌患病風險較低(表3)。

2.2rs7250266位點突變與其他類型乳腺癌發(fā)病無關

在證實了rs7250266在三陰性乳腺癌和正常人群中表達有差異以后，我們設計了第二步研究。通過檢測其他類型乳腺癌和正常人群的rs7250266分型，以期分析該位點是否為三陰性乳腺癌特有的相關位點。本研究發(fā)現，rs7250266的表達在非三陰性乳腺癌患者和正常女性中差異無統計學意義(MAF：0.19 vs 0.18，P=0.85)。基因分型也顯示，rs7250266在非三陰性型乳腺癌和正常女性中差異無統計學意義。說明rs7250266為漢族女性三陰性乳腺癌特有的相關位點。

表3　NBA1基因的單體型分析Tab. 3 Haplotype analysis of NBA1 gene

3　　討論

乳腺癌依分子分型不同，可以被分成十余種亞型，目前公認為按照St. Gallen乳腺癌大會的專家共識，依患者的ER、PR、HER-2和Ki-67表達情況，分成Luminal A、Luminal B、HER-2和三陰性型［11］。而BRCA1和BRCA2突變的乳腺癌大多為三陰性乳腺癌。因此本課題在研究BRCA1相關A蛋白復合物的SNP位點時首先選擇了三陰性乳腺癌這個群體。

對BRCA1和BRCA2基因的SNP的研究報道很多，但對BRCA1蛋白復合物基因的SNP檢測并不多。對于BRCA1相關A蛋白復合物相關基因的SNP檢測發(fā)現的幾個與乳腺癌易感性相關的SNP都是在高加索人群中發(fā)現的［12-19］。Rebbeck等［12］報道，一個SNP位于BRE的內含子上，位點為rs11891642，但進一步的單體型分析沒有發(fā)現與乳腺癌發(fā)生相關的BRE的單體型。另有兩位作者報道了5個與乳腺癌相關的Rap80的位點［13-14］。但Akbari等［13］報道的4個SNP是完全連鎖的，也就是說這4個點實際上只用一個位點就可以代替其他4個位點了。研究中沒有分析Rap80的單體型與乳腺癌遺傳易感性的關系。Nikkila?等［14］報道了一個SNP位點，但沒有進行單體型分析。這些文獻報道的高加索人種的陽性位點在本研究中MAF都小于0.01或沒有突變。

有研究報道［15-17］，與乳腺癌發(fā)病風險相關的SNP均位于NBA1基因上，分別為rs8170、rs3745185和rs10406920。這些研究分別在BRCA1突變攜帶者和三陰性乳腺癌上證實了rs8170與罹患乳腺癌的風險相關。Stevens等［15］發(fā)現，雖然rs8170在高加索人群中與乳腺癌發(fā)病風險相關，但這個位點的突變型等位基因在亞洲人(臺灣和泰國)中的表達相當低，遠小于1%。因此Stevens等［15］在分析rs8170與三陰性乳腺癌發(fā)病風險相關性的時候，直接排除了研究入組的亞洲人群，只在高加索人群中進行了分析。本研究也證實了突變型的rs8170在中國人群中的表達極低。

與乳腺癌易感性相關的BRCA1相關A蛋白復合物相關基因的SNP還有NBA1基因上的rs3745185和rs10406920［15-17］。其中rs10406920位于8號內含子上，與在9號外顯子上的rs8170是完全連鎖的(r2=1)，也就是說rs10406920這個位點的基因型情況完全可以被rs8170的基因分型代替的。由于rs8170是與乳腺癌相關的，rs10406920也自然與乳腺癌相關的?？紤]到經濟的原因，許多SNP的研究中，所有的相連鎖的SNP只取了標簽SNP中的一個進行研究，因此處于內含子位置的rs10406920一般情況下會被處于外顯子的rs8170取代。本研究進行了rs10406920和rs8170的基因分型。結果顯示，這兩個位點在漢族人群中的表達是相當低，MAF小于0.01。

由于rs10406920與rs8170完全連鎖，因此實際上到目前為止，國外文獻只發(fā)現了兩個與乳腺癌遺傳易感性相關的NBA1上的SNP位點：rs8170和rs3745185。rs3745185位于內含子上，本研究中該位點在三陰性乳腺癌患者和正常婦女間的表達差異無統計學意義。

本研究發(fā)現了與疾病相關的S N P：rs7250266。突變型的rs7250266在三陰性乳腺癌患者中的比例低于正常女性。攜帶突變型rs7250266等位基因的婦女患癌風險低于攜帶野生型rs7250266等位基因的婦女。

rs7250266位于NBA1基因啟動子區(qū)域的。啟動子區(qū)域的SNP，其核苷酸的改變可能會引起轉錄因子結合部位或轉錄因子結合強度的改變，從而影響轉錄的起始和轉錄強度，進而影響蛋白的表達水平。通過使用RegulomDB和TFSEARCH進行預測后發(fā)現，當rs7250266發(fā)生堿基改變后，會新增多個轉錄因子結合位點，且這些新增的轉錄因子與啟動子的結合能力很強。

對BRCA1相關A蛋白復合物的單體型分析目前報道較少。Rebbeck等［12］發(fā)現了與乳腺癌發(fā)病相關的單體型，這些單體型中含有rs8170的突變型堿基和(或)rs3745185的突變堿基。本研究的單體型分析也發(fā)現了與三陰性乳腺癌相關的單體型，考慮可能是因為含有了突變型等位基因的rs7250266所致。

本研究發(fā)現了與三陰性乳腺癌易感性相關的位點：rs7250266。該位點位于NBA1基因的啟動子區(qū)域。經檢測，該位點等位基因的改變可能導致轉錄因子與啟動子結合的改變，進一步會影響該基因的轉錄和蛋白表達。該位點與乳腺癌的相關性在單體型分析中也得到證實。我們計劃在將來進行進一步的功能試驗來證實此位點的作用。

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Association between single nucleotide polymorphisms of BRCA1-A complex genes and susceptibility of triple-negative breast cancer

LING Hong, HU Xin
(Department of Breast Surgery, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)
Correspondence to: LING Hong E-mail: lingh1998@aliyun.com

Background and purpose: The mutation of BRCA1 gene is widely acknowledged to be related to the incidence of triple-negative breast cancer (TNBC). The aim of this study was to investigate the association between TNBC and single nucleotide polymorphisms (SNPs) of BRCA1-associated genes. Methods: This study investigated the associations between the BRCA1-A complex genes and risk of developing TNBC in a case-control study of Chinese Han Women population including 414 patients with TNBC and 354 cancer-free controls diagnosed in the Fudan University Shanghai Cancer Center during 2008-2011. This study also detected 37 common variants in Abraxas, BRE, Rap80, NBA1 and BRCC36 genes encoding the BRCA1-A complex and evaluated their genetic susceptibility to the risk of TNBC. An additional cohort with 652 other types of breast cancer (non-TNBC) cases and 890 controls were used to investigate the associations between TNBC-specific SNPs genotype and non-TNBCs susceptibility. Results: This study found that rs7250266 in the promoter region of NBA1 confers a decreased risk to TNBC (P<0.01). Compared with CC genotype, women with the GC genotype (OR=0.70, 95%CI: 0.51-0.97) and GG genotype (OR=0.48, 95% CI: 0.21-1.07) had a lower risk of developing TNBC (P=0.03). In addition, the haplotypes containing two polymorphisms rs7250266 and rs2278256 were associated with a lower chance of TNBC development. In the second part of the study, the resultshowed that there was no difference in rs7250266 expression between non-TNBC and normal people (0.19 vs 0.18, P=0.85).Conclusion: Genetic variants in NBA1 may be an important genetic determinant of TNBC susceptibility in Chinese women.

Single nucleotide polymorphisms; Triple-negative breast cancer; BRCA1 gene; BRCA1-A complex

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.11.001

R737.9

A

1007-3639(2016)11-0881-07

上海市自然科學基金資助(15ZR1407300)。

凌泓E-mail：lingh1998@aliyun.com

（2016-03-10

2016-09-12）