蘇何玲，肖雅倫，譚燕蓮，梁 斌，谷云艷，劉永明，吳耀生

(1．廣西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣西南寧 530000；2．桂林醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)重點實驗室，廣西桂林 541004)

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佛手瓜鯊烯合酶基因克隆及酶分子結(jié)構(gòu)分析

蘇何玲1，2，肖雅倫2，譚燕蓮2，梁 斌2，谷云艷2，劉永明2，吳耀生1*

(1．廣西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣西南寧 530000；2．桂林醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)重點實驗室，廣西桂林 541004)

[目的]克隆佛手瓜鯊烯合酶(SQS)基因，并基于克隆的SQS序列分析該酶的分子結(jié)構(gòu)，為佛手瓜生物活性成分的利用提供理論依據(jù)。[方法]根據(jù)SQS基因 5′末端保守序列和3′race方法擴增的佛手瓜SQS基因3′末端序列設(shè)計佛手瓜SQS基因克隆引物。擴增的佛手瓜SQS基因片段插入pGEM-T Easy Vector后經(jīng)DNA測序。應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析克隆序列的開放閱讀框架(ORF)、酶蛋白的疏水性/親水性和蛋白質(zhì)磷酸化位點，預(yù)測酶蛋白的二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、三級結(jié)構(gòu)和跨膜區(qū)。以布朗葡萄藻為outgroup，應(yīng)用MEGA 5.0進行UPGMA算法構(gòu)建系統(tǒng)樹，并進行1 000次的Bootstrap 測試。[結(jié)果]佛手瓜SQS由417氨基酸殘基構(gòu)成，等電點為6.983。構(gòu)象預(yù)測提示該酶二級結(jié)構(gòu)以α螺旋為主，是一種只有三級結(jié)構(gòu)的單體酶，其活性中心是主要由幾個α螺旋圍繞形成的穴狀結(jié)構(gòu)，酶蛋白肽鏈中具有1個跨膜區(qū)。結(jié)構(gòu)域分析表明SQS屬于異戊二烯合酶家族。磷酸化位點分析顯示該酶共有17個磷酸化位點，其中，S48位于與酶活性中心相關(guān)模體中，而S196為陸生植物SQS基因的正選擇位點。以佛手瓜SQS基因ORF序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹得到的系統(tǒng)發(fā)生分類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致。[結(jié)論]佛手瓜SQS是由417氨基酸殘基構(gòu)成的單體酶，具有1個跨膜區(qū)和17個磷酸化位點，其中，S48和S196可能是佛手瓜SQS酶活性調(diào)節(jié)的關(guān)鍵性磷酸化位點。

佛手瓜；鯊烯合酶；基因克??；結(jié)構(gòu)分析

佛手瓜(SechiumeduleSwartz)為葫蘆科多年生宿根性草質(zhì)藤本植物，其果實肉質(zhì)細嫩，富含蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、胡蘿卜素及鈣、磷、鐵、硒等營養(yǎng)物質(zhì)，是具有保健作用的珍稀蔬菜[1]。研究表明，佛手瓜根、莖、葉和果實含有葉酸、泛酸、煙酸、黃酮類和皂甙類等生物活性物質(zhì)[2-3]。與甜瓜和羅漢果等其他葫蘆科植物含有四環(huán)三萜的葫蘆素(Cucurbitacins)不同，佛手瓜不含葫蘆素而含有五環(huán)三萜類化合物(Pentacyclic Triterpenoids)齊墩果酸型皂甙[4]，具有抗腫瘤[5-8]、抗炎[9-11]、調(diào)節(jié)血糖和降血壓[12-16]等藥理功效。植物中五環(huán)三萜類化合物的生物合成主要通過甲羥戊酸(Mevalonic Acid Pathway，MVA)途徑，即首先由兩分子乙酰輔酶A在乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶的作用下形成乙酰乙酰輔酶A，再經(jīng)由3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A、甲羥戊酸、異戊烯二磷酸及鯊烯等中間產(chǎn)物最終合成五環(huán)三萜類化合物。在MVA途徑中，鯊烯合酶(Squalene Synthase，SQS)催化合成的產(chǎn)物鯊烯是三萜、甾醇和膽固醇等物質(zhì)生物合成的重要共同前體，是該途徑的關(guān)鍵酶。因此，SQS活性與佛手瓜五環(huán)三萜類化合物的含量密切相關(guān)。目前關(guān)于佛手瓜SQS分子結(jié)構(gòu)和酶活性調(diào)節(jié)機制尚不明確。筆者克隆了佛手瓜SQS基因開放閱讀框架(Open Reading Frame，ORF)，并應(yīng)用生物信息學(xué)方法對該酶的分子結(jié)構(gòu)進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料 供試材料為2015年6月購自駐馬店市志海種業(yè)有限公司的佛手瓜一代大田用種，將種子于溫室種植至發(fā)芽10 cm后，取其葉片在液氮中保存?zhèn)溆?。T4DNA連接酶和TaqDNA聚合酶購自大連寶生物公司，2×TaqPCR MasterMix、核酸電泳Marker DL 2000、質(zhì)粒小提試劑盒和大腸桿菌DH5α購自天根生化科技有限公司，X-gal、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、異硫氰酸胍粉劑及引物購自上海生工生物工程股份有限公司，3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase購自日本TaKaRa公司，pGEM-T Easy Vector連接試劑盒購自美國Promega公司?？寺y序送上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄。佛手瓜葉片中的總RNA采用改進異硫氰酸胍法提取。取葉片0.01～0.02 g，剪成碎片置于2 mL凍存管底部，存入液氮罐，過夜。次日取出凍存管，立即加入異硫氰酸胍提取緩沖液(25 mmol/L檸檬酸鈉，0.5%十二烷基肌氨酸鈉(pH 7.0)，4 mol/L異硫氰酸胍，用前加β-巰基乙醇至總濃度2%)，用手提式S10高速勻漿機勻漿。加入200 μL氯仿，100 μL 2 mol/L NaAc(pH 4.0)，800 μL飽和酚，漩渦振蕩混勻，置于冰上5 min，4 ℃、15 000 r/min 離心10 min。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，加入2/3體積的5 mol/L KAc，混勻，置于冰上5 min，4 ℃、15 000 r/min 離心10 min。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，加入1/2體積的異丙醇，混勻。-20 ℃冰浴10 min，4 ℃、15 000 r/min 離心10 min。棄上清，加入70%乙醇洗沉淀后用無RNA酶水溶解沉淀，-80 ℃保存?zhèn)溆?。? μg總RNA，用Oligo(dT)為引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為擴增佛手瓜SQS的ORF模板。取1 μg總RNA，按3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase說明書操作，反轉(zhuǎn)錄為模板后用于擴增佛手瓜SQS基因的3′末端序列。

1.2.2 佛手瓜SQS基因部分片段的擴增及3′端序列的擴增。參照NCBI上GenBank中其他葫蘆科植物SQS序列中的高度保守序列，設(shè)計引物P1：5′-CAACAACGTTGAAG-TCTTCAGGGG-3′，P2：5′-CCGACTGCTCGCATGTTTTC-3′，擴增佛手瓜SQS基因部分片段，擴增長度為302 bp，擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司測序，并證實所得序列為佛手瓜SQS基因部分序列。根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計佛手瓜SQS基因3′末端特異性內(nèi)部引物P3：5′-GGTCAACAGTGATCCTAATGC-3′及特異性外部引物P4：5′-CGATTGCGGATGTCTATGGAGC-3′。佛手瓜SQS基因3′末端的克隆按3′-FullRACECoreSetwithPrimeScriptTMRTase說明書操作，將克隆菌液送上海生工生物工程股份有限公司進行測序，并證實所得序列為佛手瓜SQS基因 3′末端序列。

1.2.3 佛手瓜SQS基因ORF的克隆。鑒于SQS基因5′末端高度保守，根據(jù)NCBI上GenBank中其他葫蘆科植物SQS基因序列及上述所得的佛手瓜SQS基因3′末端序列設(shè)計擴增佛手瓜SQS基因ORF的引物P5：5′-GATTGAGAGCGA-GAAATGGG-3′，P6：5′-GGCTAACCAACCTGTATGA-3′。擴增條件：94 ℃ 預(yù)變性5min；94 ℃ 30s，51 ℃ 30s，72 ℃ 60s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5min。將PCR擴增產(chǎn)物膠回收，并將回收后的產(chǎn)物按美國Promega公司的pGEM-TEasyVector試劑盒克隆佛手瓜SQS基因ORF，將獲得的質(zhì)粒送上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析。將獲得的佛手瓜SQS基因序列置于NCBI上，通過OpenReadingFrameFinder(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)尋找ORF，并以DNASTAR將獲得的序列ORF翻譯為氨基酸序列，運用NetPhos2.0Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對蛋白質(zhì)磷酸化位點進行預(yù)測，以ProtParam(http：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)及ProtScale(http：//web.expasy.org/protscale/)分析佛手瓜SQS蛋白的疏水性/親水性。運用DNASTART軟件中的protean以及在線網(wǎng)站NPS@(/https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)分析其二級結(jié)構(gòu)；在NCBICD-Search(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)網(wǎng)站上進行結(jié)構(gòu)域預(yù)測。運用TMHMMServerv.2.0分析跨膜區(qū)。

通過在線軟件SWISS-MODEL對佛手瓜SQS蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，RASTOP2.0軟件進行編輯。從GenBank中下載植物SQS基因，布朗葡萄藻為outgroup，以Clustalx1.8對已報道的絞股藍、香瓜、黃瓜、人參、丹參、擬南芥、甘草、番茄、馬鈴薯、煙草、玉米等物種的SQS氨基酸序列進行比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，在MEGA5.0軟件上進行UPGMA算法，并進行1 000次的Bootstrap測試。

2 結(jié)果與分析

2.1 佛手瓜總RNA提取結(jié)果 提取的佛手瓜子葉總RNA用Nanodrop2000檢測，其A260/280均在1.8～2.0，A260/230也均大于2.0，且瓊脂糖凝膠電泳顯示，28SrRNA與18SrRNA的亮度接近2∶1，表明所提取的總RNA質(zhì)量良好。

2.2 佛手瓜SQS基因的擴增結(jié)果 參照NCBI上GenBank中其他葫蘆科植物SQS基因序列中的高度保守序列，設(shè)計引物P1及P2，擴增佛手瓜SQS基因部分片段，擴增長度與預(yù)期相符，測序結(jié)果在NCBI的BLASTRefSeqGene上進行比對，結(jié)果獲得SQS基因部分序列。按3′-FullRACECoreSetwithPrimeScriptTMRTase說明書克隆佛手瓜SQS基因 3′末端，擴增結(jié)果與預(yù)期相符。將PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-TEasy載體中，測序結(jié)果在NCBI的BLASTRefSeqGene上比對，結(jié)果獲得佛手瓜SQS基因 3′末端序列。

2.3 佛手瓜SQS 基因的克隆 根據(jù)獲得的序列設(shè)計擴增佛手瓜SQS基因ORF的引物P5和P6，并擴增佛手瓜SQS基因ORF片段，擴增結(jié)果與預(yù)測相符。將PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-T Easy 載體中，將測序結(jié)果于NCBI的BLAST RefSeqGene上進行比對，結(jié)果獲得佛手瓜SQS基因ORF序列。

2.4 生物信息學(xué)分析

2.4.1 佛手瓜SQS核苷酸序列分析。將獲得的佛手瓜基因序列傳至NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)Analyz中的ORF Finder(Open Reading Frame Finder),并對佛手瓜SQS基因ORF 核苷酸序列進行分析，結(jié)果顯示，佛手瓜SQS基因ORF編碼417個氨基酸，等電點為 6.983。將佛手瓜SQS基因ORF與其他植物SQS基因進行核苷酸序列比對構(gòu)建系統(tǒng)樹，顯示系統(tǒng)發(fā)生分類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致(圖1)。

圖1 佛手瓜SQS 基因與其他植物SQS基因序列比對構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree constructed by comparing the nucleotide sequence of Sechium edule Swartz SQS with those of the SQS genes from other plants

2.4.2 佛手瓜SQS氨基酸序列分析。結(jié)合NCBI中的ORF Finder工具以及DNASTART軟件，將佛手瓜SQS基因ORF 核苷酸序列推衍出其氨基酸序列，佛手瓜SQS與葫蘆科其他植物氨基酸序列比對，結(jié)果見圖2。由圖2可知，與酶活性中心相關(guān)的47VSRSF52、Y70、R74、77DTVED81、Y164、G202、L205、212RDYLED217、R225均高度保守。ProtParam分析結(jié)果表明，佛手瓜SQS為親水性蛋白，多肽鏈中包含50個堿性氨基酸、52個酸性氨基酸。極性氨基酸91個，疏水性氨基酸163個，GRAVY值為-0.024。NetPhos 2.0 Server分析表明，佛手瓜SQS共有17個磷酸化位點，其中，絲氨酸磷酸化位點6個，分別為S48、S196、S249、S349、S358、S407;蘇氨酸磷酸化位點6個，分別為T78、T144、T161、T318、T325、T366;酪氨酸磷酸化位點5個，分別為 Y15、 Y165、Y236、Y245、Y273。

圖2 佛手瓜SQS磷酸化位點分析Fig.2 Prediction analysis of the phosphorylation sites in Sechium edule Swartz SQS

2.4.3 佛手瓜SQS蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)分析。二級結(jié)構(gòu)分析顯示，該蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α螺旋占66.91%，β折疊占7.67%，延伸主鏈占8.87%，無規(guī)則卷曲占16.55%，佛手瓜SQS主要由α螺旋構(gòu)成(圖3A)。結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，佛手瓜SQS蛋白質(zhì)屬于異戊二烯合酶家族，含結(jié)合鎂離子及法呢酰基二磷酸的結(jié)合位點，以及富含天冬氨酸模體(圖3B)。跨膜區(qū)分析提示，佛手瓜鯊烯合酶具一個跨膜區(qū)，為386～408氨基酸，1～385氨基酸位于膜外側(cè)，409～417氨基酸位于膜內(nèi)側(cè)(圖4)。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測提示，佛手瓜SQS為單體蛋白結(jié)構(gòu)(圖5)，其活性中心主要由幾個α螺旋圍繞形成一穴狀活性中心結(jié)構(gòu)，其17個磷酸化位點均位于蛋白質(zhì)的表面。

3 結(jié)論與討論

SQS是齊墩果酸型皂甙生物合成的關(guān)鍵酶，其活性對齊墩果酸型皂甙的生物合成具有關(guān)鍵性作用。因此，對佛手瓜SQS進行酶分子結(jié)構(gòu)分析，了解該酶活性調(diào)節(jié)的分子基礎(chǔ)，可為佛手瓜齊墩果酸型皂甙生物合成調(diào)節(jié)研究提供理論依據(jù)。

注：A.佛手瓜SQS二級結(jié)構(gòu)；B.佛手瓜SQS結(jié)構(gòu)域。Note：A.The result of the secondary structure prediction of Sechium edule Swartz SQS.B.The result of the domain prediction of Sechium edule Swartz SQS.圖3 佛手瓜SQS二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.3 Prediction analysis of the secondary structure and domain of Sechium edule Swartz SQS

圖4 佛手瓜SQS跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析Fig.4 Transmembrane segments structure prediction of Sechium edule Swartz SQS

圖5 佛手瓜SQS 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析Fig.5 Tertiary structure prediction of Sechium edule Swartz SQS

基于克隆的佛手瓜SQS基因ORF，推導(dǎo)出佛手瓜SQS的氨基酸序列。序列分析表明，佛手瓜SQS是由417氨基酸殘基構(gòu)成的單體酶。佛手瓜SQS與甜瓜SQS的結(jié)構(gòu)相似[22]，二級結(jié)構(gòu)以α螺旋為主，活性中心為穴狀結(jié)構(gòu)，主要由幾個α螺旋的肽段圍繞形成。但與甜瓜SQS具有2個跨膜區(qū)序列不同，佛手瓜SQS僅有一段跨膜區(qū)序列，為386～408氨基酸，1～385氨基酸位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜外側(cè)，409～417氨基酸位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)。從GenBank下載葫蘆科的絞股藍、羅漢果及黃瓜SQS序列，推衍出相應(yīng)氨基酸序列之后分析其跨膜區(qū)，發(fā)現(xiàn)絞股藍、羅漢果的SQS有2個跨膜區(qū)而黃瓜SQS僅有一個跨膜區(qū)。

佛手瓜SQS分子中與酶活性密切相關(guān)的47VSRSF52、Y70、R74、77DTVED81、Y164、G202、L205、212RDYLED217和R225關(guān)鍵氨基酸位點均位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜外側(cè)。此外，該酶共有17個磷酸化位點，除磷酸化位點S407位于酶蛋白的跨膜區(qū)外，其他16個磷酸化位點均位于酶蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜外側(cè)。其中，磷酸化位點S48位于與酶活性中心相關(guān)的47VSRSF52模體中，而磷酸化位點S196是陸生植物SQS的正選擇位點，提示S48和S196可能是佛手瓜SQS酶活性調(diào)節(jié)的關(guān)鍵性磷酸化位點。佛手瓜SQS這些酶分子結(jié)構(gòu)特點與甜瓜SQS相似。

以獲得的佛手瓜ORF基因序列與其他植物SQS基因進行核苷酸序列比對構(gòu)建系統(tǒng)樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)發(fā)生分類結(jié)果與目前形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致。該結(jié)果為葫蘆科的分類系統(tǒng)提供分子生物學(xué)依據(jù)。但就葫蘆科的種屬分類系統(tǒng)而言，基因序列數(shù)據(jù)過少，種類不多，不足以對整個葫蘆科的植物進行種屬的系統(tǒng)發(fā)生分析。邱明華等[23]以葫蘆科植物所含的化合物對葫蘆科植物進行分類，結(jié)果表明，單獨以葫蘆科植物的化學(xué)證據(jù)還很難支持整個科的某一個系統(tǒng)，應(yīng)綜合細胞、胞粉、染色體、分子生物學(xué)等結(jié)果進行分析。

該研究在克隆葫蘆科植物佛手瓜SQS基因的基礎(chǔ)上，應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析佛手瓜SQS的分子結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該酶是由417氨基酸殘基構(gòu)成的單體酶，分子中僅具一個跨膜區(qū)。綜合跨膜區(qū)、酶活性相關(guān)模體、磷酸化位點及正選擇位點分析結(jié)果，提示S48和S196可能是佛手瓜SQS酶活性調(diào)節(jié)的關(guān)鍵性磷酸化位點。

[1] 關(guān)佩聰.佛手瓜[M]//中國農(nóng)業(yè)百科全書總編輯地蔬菜卷編輯委員會，中國農(nóng)業(yè)百科全書編輯部.中國農(nóng)業(yè)百科全書：蔬菜.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1990：77.

[2] 張奇志，鄧歡英，林丹瓊，等.佛手瓜果實中營養(yǎng)保健成分的分析研究[J].食品研究與開發(fā)，2007，28(8)：139-142.

[3] SICILIANO T，DE TOMASSI N，MORELLI I，et al.Study of flavononids ofSechiumedule(Jacq)Swartz(Cucurbitaceae)different edible organs by liquid chromatography photodioide array mass spectrometry[J].J Agric Food Chem，2004，52(21)：6510-6515.

[4] CASTRO V H，RAMIREZ E，MORA G A，et al.Structures and antip roliferative activity of saponins fromSechiumpittieriandS.talamancense[J].Chem Pharm Bull，1997，45(2)：349-358.

[5] YAN S L，HUANG C Y，WU S T，et al.Oleanolic acid and uraolic acid induce apoptosis in four human liver cancer cell lines[J].Toxicol In Vitro，2010，24(3)：842-848.

[6] RAWENDRA R D，LIN P Y，CHANG C D，et al.Potentiation of acute promyelocytic leukemia cell differentiation and prevention of leukemia development in mice by oleanolic acid[J].Anticancer Res，2015，35(12)：6583-6590.

[7] 溫少瑾，郝敬全，江勁波.中藥誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡機制的研究進展[J].湖南中醫(yī)雜志，2013，29(5)：125-127.

[8] HUANG Z，F(xiàn)U J，LIU L，et al.Glycosylated diazeniumdiolate-based oleanlic acid derivatives：Synthesis，invitroandinvivobiological evaluation as anti-human hepatocellular carcinoma agents[J].Organic & biomolecular chemistry，2012，10(19)：3882-3891.

[9] 張明發(fā)，沈雅琴.甘草酸及其衍生物的抗炎和抗變態(tài)反應(yīng)研究進展[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2011，26(5)：359-364.

[10] HSU H Y，YANG J J，LIN C C.Effects of oleanolic acid and ursolic acid on inhibiting tumor growth and enhancing the recovery of hematopoietic system postirradiation in mice[J].Cancer Lett，1997，111(1/2)：7-13.

[11] 王會敏，田煒，喇孝瑾，等.葛根素、齊墩果酸及其配伍對 T2DM 大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19(15)：174-177.

[12] GAO D W，LI Q W，LI Y，et al.Antidiabetic potential of oleanolic acid fromLigustrumlucidumAit[J].Can J Physiol Pharmacol，2007，85(11)：1076-1083.

[14] SOMOVA L I，SHODE F O，RAMNANAN P，et al.Antihypertensive，antiatherosclerotic and antioxidant activity of triterpenoids isolated fromOleaeuropaea，subspecies africana leaves[J].J Ethnopharmacol，2003，84(2/3)：299-305.

[15] WEN X A，SUN H B，LIU J，et al.Naturally occurring pentacyclic triterpenes as inhibitors of glycogen phosphorylase：Synthesis，structure-activity relationships，and X-ray crystallographic studies[J].J Med Chem，2008，51(12)：3540-3554.

[16] ORTIZ-ANDRADE R R，GARCA-JIMéNEZA P，et al.α-Glucosidase inhibitory activity of the methanolic extract from Tournefortia hartwegiana：An antihyperglycemic agent [J].J Ethnopharmacol，2007，109(1)：48-53.

[17] 戴云，董學(xué)暢.佛手瓜果脯系列食品的研制[J].食品科學(xué)，2001，1(3)：60-62.

[18] 黃麗，楊君，林丹瓊，等.醬制佛手瓜加工技術(shù)研究[J].中國調(diào)味品，2011，36(7)：69-73.

[19] 唐克華，喻世鋒，董愛文，等.佛手瓜脯真空浸糖加工工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2004，25(5)：80-82.

[20] 楊勝敖.佛手瓜酸奶生產(chǎn)工藝技術(shù)研究[J].中國乳品工業(yè)，2009，37(5)：58-60.

[21] 張建華，胡飛，陳火英.佛手瓜菜汁飲料和南瓜發(fā)酵飲料的研制[J].上海農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2000，18(2)：115-118.

[22] 黃海霞，蘇何玲，史云龍，等.甜瓜鯊烯合酶基因克隆及酶分子結(jié)構(gòu)分析[J].廣西植物(2016-03-24)[2016-07-15].http：//www.cnki.net/kcms/detail/45.1134.q.20160324.0938.002.html.DOI：10.11931/guihaia.gxzw201601035.

[23] 邱明華，陳書坤，陳劍超，等.葫蘆科化學(xué)分類學(xué)[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2005，11(6)：673-685.

Gene Cloning and Molecular Characterizations of Squalene Synthase fromSechiumeduleSwartz

SU He-ling1,2, XIAO Ya-lun2, TAN Yan-lian2, WU Yao-sheng1*et al

(1.Department of Biochemistry and Molecular Biology, Guangxi Medical University, Nanning ,Guangxi 530000; 2. Key Laboratory of Medicinal Biotechnology, Guilin Medical University, Guilin,Guangxi 541004)

[Objective] To clone the gene of squalene synthase (SQS) fromSechiumeduleSwartz and characterize the molecular structure of the enzyme, and thus provide the groundwork for exploiting the bioactive components ofSechiumeduleSwartz. [Method] Primers for cloning of theSQSgene fromSechiumeduleSwartz were designed according to the 5′ end conservative sequence ofSQSgenes and the 3′ end sequence of theSQSgene fromSechiumeduleSwartz obtained by 3′race amplification. The amplified fragment of theSQSgene fromSechiumeduleSwartz was inserted into the pGEM-T Easy Vector and verified by DNA sequencing. The analyses of the open reading frame (ORF) of theSechiumeduleSwartzSQSgene sequence cloned, the hydrophobicity/hydrophily and the phosphorylation sites of the zymoprotein, as well as the predictions of the secondary structure, domain, tertiary structure and transmembrane region of the enzyme were conducted using bioinformatics methods. The phylogenetic tress was constructed by performing the UPGMA of MEGA 5.0 and carrying out 1000 times of Bootstrap test, using botryococcus braunii as outgroup. [Result]SechiumeduleSwartzSQSis constituted of 417 amino acid residues with an isoelectric point of 6.983. Conformation prediction analyses suggested that α helix is the main kind of the secondary structure inSechiumeduleSwartzSQSzymoprotein, and the SQS is a monomeric enzyme with a cave-like activity center formed by α helixes. Domain analysis showed that the enzyme molecule possesses a transmembrane region and suggested that the SQS is belonged to the isoprenoid biosynthase superfamily. And the analysis of phosphorylation site indicated that there are 17 phosphorylation sites in the enzyme protein, among which the S48locates in the activity center-related motif and the S196is a positive selection site of theSQSgene. The result of phylogenetic classification based on the phylogenetic tress constructed with the ORF sequence of theSQSgene was in accordance with that of morphologic classification. [Conclusion]SechiumeduleSwartz SQS is a monomeric enzyme constituted of 417 amino acid residues and possesses a transmembrane region and 17 phosphorylation sites, among which the S48and S196may be the critical sites for the regulation of the SQS activity.

SechiumeduleSwartz; Squalene synthase; Gene cloning; Molecular structure analysis

國家自然科學(xué)基金項目(31260069)；廣西高等學(xué)校優(yōu)秀中青年骨干教師培養(yǎng)工程資助項目。

蘇何玲(1973- )，女，廣西桂林人，教授，碩士，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。*通訊作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。

2016-09-08

S 188；Q 946.83

A

0517-6611(2016)32-0142-05