景亞青，劉 義，韓 菲，袁晶華，李克秋，李 光

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肝竇內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫耐受

景亞青1，劉 義1，韓 菲2，袁晶華1，李克秋1，李 光1

目的 探討肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSEC)對T細(xì)胞的耐受作用。方法 CD3和CD28抗體活化的人T細(xì)胞和人LSEC混合培養(yǎng)，檢測48 h時(shí)單獨(dú)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)T細(xì)胞的凋亡情況和細(xì)胞因子白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素4(IL-4)和白細(xì)胞介素10(IL-10)的表達(dá)量及分泌量。結(jié)果 和LSEC混合培養(yǎng)的T細(xì)胞凋亡率顯著高于單獨(dú)培養(yǎng)的T細(xì)胞，混合培養(yǎng)的T細(xì)胞中IL-2的表達(dá)量沒有發(fā)生明顯變化，IL-4的表達(dá)量顯著升高，IL-2/IL-4的值降低，IL-10的表達(dá)量增加。IL-2、IL-4和IL-10細(xì)胞因子分泌情況和表達(dá)量一致。結(jié)論 LSEC可通過降低T細(xì)胞數(shù)目和改變細(xì)胞因子分泌兩種途徑誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生耐受。

LSEC；T細(xì)胞耐受；混合培養(yǎng)；凋亡檢測；細(xì)胞因子

肝臟是人體最大的有消化和排毒功能的臟器，容易受到傷害。肝臟功能失調(diào)會導(dǎo)致各種并發(fā)癥的產(chǎn)生。目前，肝移植是治療各種終末期肝病(肝癌、肝硬化)最重要的手段[1]。和其他器官移植相比，肝臟更容易產(chǎn)生耐受。肝是人體重要的免疫器官，人的肝臟有兩個血液供應(yīng)途徑：門靜脈和肝動脈[2]，分別含有胃腸道和系統(tǒng)免疫的抗原，環(huán)境的復(fù)雜性要求肝臟既可以抵御外來抗原還可以防止肝臟細(xì)胞被破壞。肝臟可通過外周耐受途徑，防止免疫細(xì)胞(特別是T細(xì)胞)對肝造成損傷。肝的免疫耐受作用主要由非實(shí)質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮[3]，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver simusoidal endothelial cell, LSEC)是肝臟內(nèi)含量最多的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，其功能與移植物的存活狀態(tài)有關(guān)[4-5]。本研究通過LSEC對體外活化的T細(xì)胞凋亡情況和細(xì)胞因子分泌情況進(jìn)行分析，探討其對活化T細(xì)胞的耐受作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人原代LSEC株購自上海復(fù)蒙生物科技有限公司。富含血小板的白膜購自天津市血液中心。

1.2 主要試劑 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(endothelial cell medium, ECM)購自美國Sciencell公司；淋巴細(xì)胞分離液購自天津市灝洋生物技術(shù)公司；CD3免疫磁珠購自德國Miltenyi公司；AnnexinV/7-AAD凋亡檢測試劑盒購自美國eBioscience公司；IL-2、IL-4和IL-10 ELISA檢測試劑盒購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；TRIzol、MLV-cDNA合成試劑盒和Real-time PCR檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.3 方法

1.3.1 LSEC復(fù)蘇 將1 ml 10 μg/ml纖連蛋白溶液加到10 cm培養(yǎng)皿中，輕輕晃動使液體均勻附在培養(yǎng)皿底，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育過夜。將含有105個LSEC的凍存管放置到37 ℃恒溫水浴鍋中，緩慢轉(zhuǎn)動凍存管至完全融化，將液體移至已包被好的培養(yǎng)皿中，并加入ECM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h后進(jìn)行細(xì)胞換液，并繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至覆蓋90%培養(yǎng)皿時(shí)，進(jìn)行胰酶消化傳代培養(yǎng)。

1.3.2 T細(xì)胞分離活化 將人白膜細(xì)胞和生理鹽水等體積混合并吹打均勻，輕輕加入到含等體積淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，使分離液和細(xì)胞層界限清晰，2 000 r/min室溫離心20 min，吸出中間的細(xì)胞層，PBS清洗2次，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

取108個淋巴細(xì)胞懸液離心，加入800 μl預(yù)冷的磁珠緩沖液重懸細(xì)胞，4 ℃孵育15 min，加入12 ml磁珠緩沖液1 200 r/min離心10 min。用1 ml磁珠緩沖液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞過MS分離柱，1 000 r/min離心10 min，制備細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目。

吸取T細(xì)胞懸液50 μl放入1.5 ml離心管中，加入1 μl FITC標(biāo)記的CD3抗體，4 ℃避光孵育30 min。將細(xì)胞懸液1 000 r/min離心5 min，PBS清洗2次，并加入1 ml 4%多聚甲醛重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀(BD verse，美國BD公司)分析T細(xì)胞含量。

磁珠分選得到的T細(xì)胞加入含1 μg/ml CD3和1 μg/ml CD28抗體的1640培養(yǎng)基(包括15%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素抗生素溶液)中培養(yǎng)24 h。

1.3.3 LSEC和T細(xì)胞混合培養(yǎng) 生長狀況良好的LSEC進(jìn)行傳代，計(jì)數(shù)細(xì)胞，將105個LSEC接種到纖連蛋白包被的6孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。吸去ECM培養(yǎng)液，調(diào)整T細(xì)胞濃度，分別將2×105個T細(xì)胞接種到含或不含LSEC的6孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h。

1.3.4 AnnexinV/7-AAD凋亡檢測 將培養(yǎng)的T細(xì)胞吸出，1 100 r/min 離心4 min，吸去上清液，PBS清洗細(xì)胞。1 100 r/min 離心4 min后，吸去上清液，加入1 ml溶液懸浮細(xì)胞。單獨(dú)培養(yǎng)的T細(xì)胞和混合培養(yǎng)的T細(xì)胞進(jìn)行PE標(biāo)記的AnnexinV和7-AAD染色30 min，PBS清洗細(xì)胞2次，加入1 ml 4%多聚甲醛溶液重懸細(xì)胞，采用BD verse細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，F(xiàn)lowJo 7.6.1軟件分析T細(xì)胞凋亡情況。

1.3.5 mRNA表達(dá)水平 TRIzol法提取單獨(dú)培養(yǎng)48 h T細(xì)胞和混合培養(yǎng)48 h T細(xì)胞的mRNA，采用Nanodrop儀(Nanodrop 2000，美國Thermo公司)檢測mRNA的濃度和純度，選用MLV-cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用熒光定量PCR儀(7500 Fast，美國ABI公司)檢測IL-2、IL-4、IL-10的mRNA水平，引物序列見表1。根據(jù)擴(kuò)增的Ct值計(jì)算基因表達(dá)量，以48 h單獨(dú)培養(yǎng)的T細(xì)胞為參照計(jì)算ΔΔCt，基因相對表達(dá)量為2-ΔΔCt。

表1 Real-time PCR檢測mRNA表達(dá)情況引物序列

1.3.6 細(xì)胞因子含量測定 采用雙夾心酶標(biāo)法檢測細(xì)胞因子IL-2、IL-4和IL-10的分泌情況，按照ELISA檢測試劑盒說明書檢測單獨(dú)培養(yǎng)的LSEC、單獨(dú)培養(yǎng)的T細(xì)胞和混合培養(yǎng)細(xì)胞48 h時(shí)上清液中細(xì)胞因子的分泌情況。采用ELISACal軟件繪制細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本吸光度值計(jì)算細(xì)胞因子的分泌量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 LSEC和T細(xì)胞生長情況 LSEC解凍后均勻的懸浮在ECM中，經(jīng)過16 h的過夜培養(yǎng)，LSEC呈梭形貼附在培養(yǎng)皿底部生長，更換新的ECM培養(yǎng)48 h時(shí)LSEC貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)為鵝卵形或梭形，細(xì)胞表面光滑，折光率較強(qiáng)。CD3免疫磁珠分離得到1.5×107個T細(xì)胞，得率為15%，純化的T細(xì)胞比例由62.7%增加到98.3%，見圖1。培養(yǎng)24 h后的T細(xì)胞形態(tài)均一，大小一致，透光率較高。培養(yǎng)48 h的T細(xì)胞與LSEC混合培養(yǎng)，24 h后觀察T細(xì)胞貼附在LSEC細(xì)胞表面，兩者狀態(tài)較好，見圖2。

圖1 白膜和CD3磁珠分選后T細(xì)胞比例

A：T細(xì)胞在白膜淋巴細(xì)胞的比例；B：CD3磁珠分選后T細(xì)胞的比例

圖2 單獨(dú)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)下的LSEC

A：單獨(dú)培養(yǎng)的LSEC×100；B：T細(xì)胞和LSEC混合培養(yǎng)×200

2.2 LSEC促進(jìn)T細(xì)胞凋亡 由圖3可見，單獨(dú)培養(yǎng)的T細(xì)胞凋亡率為(9.70±0.36)%，與LSEC混合培養(yǎng)的T細(xì)胞早期凋亡率為(17.43±0.70)%，混合培養(yǎng)T細(xì)胞凋亡率明顯高于單獨(dú)培養(yǎng)的T細(xì)胞(t=9.76，df=4,P=0.000 6)，說明LSEC可有效誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。

2.3 細(xì)胞因子IL-2、IL-4及IL-10的mRNA表達(dá)水平 單獨(dú)培養(yǎng)的T細(xì)胞和混合培養(yǎng)的T細(xì)胞mRNA檢測結(jié)果表明：IL-2 mRNA的表達(dá)量兩者沒有明顯變化，混合培養(yǎng)的T細(xì)胞IL-4和IL-10 mRNA的表達(dá)量顯著高于單獨(dú)培養(yǎng)的T細(xì)胞，混合培養(yǎng)的T細(xì)胞IL-2和IL-4 mRNA的比值顯著低于單獨(dú)培養(yǎng)的T細(xì)胞(IL-2t=2.10, df=4，P=0.103 2; IL-4t=7.67, df=4,P=0.001 6; IL-2/IL-4t=16.22, df=4,P<0.000 1; IL-10t=12.43, df=4,P=0.000 2)，見圖4。

圖3 AnnexinV/7-AAD檢測T細(xì)胞凋亡情況

A：T細(xì)胞48 h凋亡情況；B：LSEC混合培養(yǎng)的T細(xì)胞凋亡情況

2.4 細(xì)胞因子IL-2、IL-4及IL-10的分泌情況 ELISA法檢測細(xì)胞因子的分泌情況，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示與LSEC共培養(yǎng)的T細(xì)胞，上清液中IL-4和IL-10的分泌量增加，IL-2的分泌量無明顯變化，表明LSEC可降低IL-2/IL-4的值并有效刺激IL-10的分泌，有利于誘導(dǎo)免疫偏離，與mRNA表達(dá)檢測結(jié)果一致，見圖5(FIL-2=157.60,P<0.000 1；FIL-4=88.54,P<0.000 1；FIL-10=30.47,P=0.007)。

3 討論

肝臟是實(shí)體器官移植中比較容易產(chǎn)生耐受的器官，其它器官(皮膚、心臟、腎)連同肝臟共同移植可降低排斥的發(fā)生率，從而增加器官存活時(shí)間[6]。LSEC屬于肝臟的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的組成部分，約占非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的50%，含量最多[7]。1970年，Eddie Wisse第一次有確信的證據(jù)指出LSEC是一種新的細(xì)胞類群。LSEC在肝竇腔內(nèi)將肝細(xì)胞和血液分開，內(nèi)皮層不含有序的基底細(xì)胞層，在肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞間形成一個空隙，稱為Disse間隙，可以防止肝細(xì)胞和竇腔直接接觸[8]。LSEC構(gòu)成了肝臟與外界接觸的第一道防線，可進(jìn)行物質(zhì)交換并參與免疫反應(yīng)，與肝臟的移植耐受過程有關(guān)。耐受大鼠血清中LSEC透明質(zhì)酸含量比排斥大鼠的低，大分子蛋白的攝取速度較快，表明LSEC在機(jī)體免疫耐受中可能發(fā)揮重要作用[9]。LSEC表面有清道夫受體、甘露糖受體，參與細(xì)胞的吞噬作用，表面分子MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ可將抗原呈遞給CD8+和CD4+T細(xì)胞，表面分子L-SIGN、ICAM可以將細(xì)胞黏附到LSEC。解剖學(xué)和分子生物學(xué)特征表明LSEC在免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮了作用。

圖4 IL-2、IL-4和IL-10的mRNA表達(dá)含量

圖5 IL-2、IL-4和IL-10分泌情況

器官移植后免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生主要是由細(xì)胞免疫反應(yīng)造成的，活化的T細(xì)胞可識別外來的移植物抗原，對移植物發(fā)生免疫反應(yīng)造成移植物喪失功能[10]。移植耐受患者中，免疫反應(yīng)性T細(xì)胞含量減少，而可誘導(dǎo)免疫耐受的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞含量增加[11]。在本實(shí)驗(yàn)中LSEC可促進(jìn)CD3抗體和CD28抗體聯(lián)合活化的T細(xì)胞凋亡，減少T細(xì)胞數(shù)量，降低免疫反應(yīng)。T細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌發(fā)生改變是T細(xì)胞耐受的形成途徑之一。在T細(xì)胞耐受中，主要通過Th1和Th2細(xì)胞因子的比例決定[12]。Th細(xì)胞是T細(xì)胞的一種重要的細(xì)胞亞群，可以通過分泌細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、γ-干擾素及腫瘤壞死因子，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，在抗感染、器官移植排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病的誘導(dǎo)過程中起重要作用。Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13，介導(dǎo)體液免疫。有研究[13-14]表明，在器官移植中，長期存活的移植患者可檢測到高表達(dá)的IL-10，而在發(fā)生急性排斥反應(yīng)的移植患者中，幾乎檢測不到IL-10。Th1和Th2細(xì)胞所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)能互相調(diào)節(jié)或產(chǎn)生交叉調(diào)節(jié)作用[15-16]，其動態(tài)平衡對誘導(dǎo)和維持免疫耐受十分重要。Th2可下調(diào)Th1誘發(fā)的排斥反應(yīng)，消除損傷效應(yīng)，從而有助于建立移植免疫耐受。本實(shí)驗(yàn)中和LSEC混合培養(yǎng)的T細(xì)胞IL-2/IL-4的比值降低，Th1細(xì)胞功能受到抑制，Th2細(xì)胞功能增強(qiáng)，Th2分泌的免疫抑制因子IL-10增多[12]。T細(xì)胞因子分泌的改變也表明LSEC可促進(jìn)T細(xì)胞耐受。本研究結(jié)果表明，LSEC可通過促進(jìn)T細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子分泌兩種方式誘導(dǎo)T耐受。

[1] Bosch A,Dumortier J,Maucort-Boulch D,et al.Preventive administration of UDCA after liver transplantation for primary biliary cirrhosis is associated with a lower risk of disease recurrence[J]. J Hepatol, 2015, 63(6):1449-58.

[2] DeLeve L D. Liver sinusoidal endothelial cells and liver regeneration[J]. J Clin Invest,2013,123(5):1861-6.

[3] Spiering R,Margry B,Keijzer C.DEC205+ dendritic cell-targeted tolerogenic vaccination promotes immune tolerance in experimental autoimmune arthritis[J]. J Immunol,2015,194(10):4804-13.

[4] Jenne C N,Kubes P. Immune surveillance by the liver[J].Nat Immunol,2013,14(10):996-1006.

[5] Karimi M H,Geramizadeh B,Malek-Hosseini S A.Tolerance induction in liver[J]. Int J Organ Transplant Med, 2015, 6(2):45-54.

[6] Topilsky Y,Raichlin E,Hasin T,et al.Combined heart and liver transplant attenuates cardiac allograft vasculopathy compared with isolated heart transplantation[J]. Transplantation, 2013, 95(6):859-65.

[7] Igarashi Y, Onoe T, Ohdan H. The role of liver sinusoidal endothelial cells in induction of carbohydrate reactive B cells tolerance through the programmed death 1/programmed death ligand 1 pathway[J]. Transplantation, 2015, 99(11):2325-36.[8]DeLeveLD.Liversinusoidalendothelialcellsinhepaticfibrosis[J].Hepatology, 2015, 61(5):1740-6.

[9]GeX,NowakG,EriczonBG.Liversinusoidalendothelialcellfunctioninrejectedandspontaneouslyacceptedratliverallografts[J].TransplInt,2008, 21(1):49-56.

[10]MatignonM,AissatA,Canoui-PoitrineF,etal.Th-17alloimmuneresponsesinrenalallograftbiopsiesfromrecipientsofkidneytransplantsusingextendedcriteriadonorsduringacuteTcell-mediatedrejection[J].AmJTransplant,2015, 15(10):2718-25.

[11]DenneyHA,WhittleRJ,LaiJ,etal.RegulatoryTcellsinchronicGraft-Versus-Hostdiseaseafterextracorporealphotopheresis:correlationwithskinandglobalorganresponses,andabilitytotapersteroids[J].Transplantation, 2016:[Epubaheadofprint].

[12]LiB,TianL,DiaoY.ExogenousIL-10inducescornealtransplantationimmunetolerancebyamechanismassociatedwiththealteredTh1/Th2cytokineratioandtheincreasedexpressionofTGF-β[J].MolMedRep, 2014, 9(6):2245-50.

[13]IngelstenM,GustafssonK,OlaussonM,etal.Rapidincreaseofinterleukin-10plasmalevelsaftercombinedauxiliaryliver-kidneytransplantationinpresensitizedpatients[J].Transplantation, 2014, 98(2):208-15.

[14]ShouvalDS,BiswasA,GoettelJA,etal.Interleukin-10receptorsignalingininnateimmunecellsregulatesmucosalimmunetoleranceandanti-inflammatorymacrophagefunction[J].Immunity, 2014, 40(5): 706-19.

[15]ObremskiK.ChangesinTh1andTh2cytokineconcentrationsinilealPeyer′spatchesingiltsexposedtozearalenone[J].PolJVetSci, 2014, 17(1):53-9.

[16]HuA,LiQ,ShiH,etal.Donor-derivedbonemarrowtransfusionproducesmixedchimerismandpromotesaTh2shiftinTh1/Th2balanceinratheterotopicsmallboweltransplantation[J].DigLiverDis, 2012, 44(12):988-94.

T cell immune tolerance induced by LSEC

Jing Yaqing1, Liu Yi1, Han Fei2, et al

(1DeptofGenetics,SchoolofBasicMedicalSciences,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070;2DeptofClinicalLaboratory,TheSecondHospitalofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300211)

ObjectiveToexploretheroleofLSEConTcelltolerance. MethodsTcellapoptosis,cytokine(IL-2,IL-4andIL-10)expressionandsecretionofhumanTcellsactivatedbyCD3/CD28aloneandmixed-culturedwithhumanLSECweredetected.ResultsTheratioofcellapoptosiswashigherinmixed-culturedTcellsthanTcellsalone.ThegeneexpressionsofIL-4andIL-10werehigherinmixed-culturedTcellsthanTcellsalone,whilegeneexpressionofIL-2hadnosignificantdifferenceinmixed-culturedTcellsthanTcellsalone.ThecytokinesecretionofIL-2,IL-4andIL-10wasconsistentwithgeneexpression.ConclusionLSECcouldinduceTcelltolerancebydecreasingTcellnumberandalteringcytokinesecretion.

LSEC;Tcelltolerance;mixedculture;apoptosisdetection;cytokine

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(編號：2012AA021003)

1天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)系，天津 3000702天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300211

景亞青，女，助理實(shí)驗(yàn)師； 李 光，女，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail: lig@tmu.edu.cn

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.004.html

R 392

A

1000-1492(2016)11-1569-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.004

2016-06-27接收