曹玉婷，王珊珊，楊德宣，李琳娜，袁守軍

?

◇基礎(chǔ)醫(yī)學研究◇

重組抗人表皮生長因子受體人源化單克隆抗體注射液對Bcap37人乳腺癌細胞生長的抑制作用

曹玉婷1,2，王珊珊2，楊德宣2，李琳娜2，袁守軍1,2

目的 觀察重組抗人表皮生長因子受體人源化單克隆抗體注射液(MIL41)對Her2高表達人乳腺癌細胞體內(nèi)外的抑制作用。方法 通過流式細胞儀分析人乳腺癌細胞Bcap37中Her2受體的表達量，CCK8法測定MIL41在體外對乳腺癌細胞Bcap37生長的抑制作用；在體內(nèi)研究中采用人乳腺癌細胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立評價MIL41對腫瘤生長的抑制作用。結(jié)果 體外實驗表明Bcap37為Her2受體過表達的人乳腺癌細胞，CCK8法檢測結(jié)果顯示MIL41對受試細胞Bcap37的生長有較強抑制作用。體內(nèi)實驗表明受試藥MIL41對受試的人乳腺癌細胞Bcap37的裸鼠皮下移植瘤的生長有明顯的抑制效應，同時呈現(xiàn)出良好的濃度依賴關(guān)系。分別給予3、6、12 mg/kg不同濃度的受試藥，其瘤體積抑制率分別為33.7%、47.8%、59.0%，瘤重抑制率分別為29.6%、44.7%、55.6%。結(jié)論 MIL41對Bcap37人乳腺癌細胞在體內(nèi)外的生長有較強的抑制作用。

表皮生長因子；單克隆抗體；Her2；Bcap37；乳腺癌;抗腫瘤活性

在女性群體中乳腺癌是所有惡性腫瘤中發(fā)病率及死亡率極高的癌癥[1]，其中20%～30%的乳腺癌患者的表皮生長因子受體2(human epidermalgrowth factor receptor-2,Her2)為陽性[2-4]。對于Her2陽性乳腺癌患者，惡性程度高、易發(fā)生轉(zhuǎn)移、復發(fā)率高、預后較差。Her2受體是有受體酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，屬于表皮生長因子受體家族[5]，研究[6]表明其在多數(shù)惡性腫瘤細胞的轉(zhuǎn)化中起關(guān)鍵性作用,以表皮生長因子受體Her2為單克隆抗體作用靶點的藥物在臨床中已成功運用，但是Her2其他抗原表位的單克隆抗體仍是研究中所關(guān)注的熱點。北京天廣實生物技術(shù)股份有限公司研發(fā)的重組抗人表皮生長因子受體人源化單克隆抗體注射液(MIL41)是靶向Her2受體新型抗原表位的單克隆抗體，其作用機制與Pertuzumab較為相似。該研究以Trastuzumab、Pertuzumab為陽性藥，對MIL-41作用于Her2過表達乳腺癌細胞的體外及體內(nèi)抗腫瘤作用進行藥效學評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 MIL-41購于北京天廣實生物技術(shù)股份有限公司；Trastuzumab(上海羅氏制藥有限公司，批號：B3457，稀釋批號：B2040，分濾批號：SH0006)；Pertuzumab(規(guī)格：30 mg/瓶，北京天廣實生物技術(shù)股份有限公司無菌分裝)。RPMI 1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；Her2/NEU PE熒光單克隆抗體[美國碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司)]；CCK8檢測液(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.1.2 主要儀器 CO2氣體培養(yǎng)箱(德國賀立氏儀器公司)；倒置顯微鏡(重慶重光食品公司)；流式細胞檢測儀(美國Beckman Coulter公司)；Multiskan Ascent酶標儀(芬蘭Thermo Labsystems公司)。

1.1.3 實驗動物 6～8周齡BALB/c裸鼠，SPF級，17.0～22.0 g，雌性，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。受試動物飼養(yǎng)于無菌的獨立送風IVC籠中，飼以專門為小鼠配制的消毒飼料，自由飲用純凈水。動物實驗室內(nèi)溫度約25 ℃，相對濕度40%～70%，每日光照12 h。

1.1.4 腫瘤細胞株 Bcap37人乳腺癌細胞，購自中國醫(yī)學科學院細胞中心，由軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所腫瘤藥理室傳代、保存。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 接種細胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中(補充青、鏈霉素各100 μl/ml)，置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中，每隔1～2 d換液1次，0.25%胰蛋白酶消化，傳代和收集細胞。

1.2.2 流式細胞儀檢測 Her2受體將待檢細胞用胰蛋白酶消化，取105～106個細胞1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，收集細胞。PBS洗2遍，用0.05 ml PBS將細胞混懸備用。將Her-2 PE熒光素標記抗體5 μl加入細胞懸液中，室溫下孵育30 min。將孵育好的細胞懸液3 000 r/min離心10 min，棄上清液，用0.05 ml PBS混懸檢測。

1.2.3 CCK8法檢測細胞增殖 將對數(shù)生長期細胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640細胞培養(yǎng)液配制成2.5×104/ml的細胞懸液，按每孔2 000～4 000個細胞(100 μl)加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，每孔加入含有不同濃度(1 500、750、375、187.5、93.75、46.875、23.437 5 μg/ml)受試藥物的培養(yǎng)基100 μl，每個濃度設(shè)4個平行孔。培養(yǎng)72 h后，每孔加入10 μl CCK8檢測液，37 ℃培養(yǎng)2～4 h后用酶標儀檢測吸光度(optical density,OD)值，檢測波長為450 nm。按方法進行一次重復性實驗。

1.2.4 皮下移植瘤實驗 將對數(shù)生長期的Bcap37細胞用胰酶消化收集，并用PBS洗滌重懸，懸液濃度>5×107個細胞/ml，將0.2 ml的腫瘤細胞懸液注射于裸鼠右腋皮下，建立傳代荷瘤鼠模型。傳代保種裸鼠皮下腫瘤生長體積至1 000～1 500 mm3時,無菌條件下取出瘤塊，將其切成約(1.0×1.0×1.0) mm3，并接種于裸鼠右前肢腋部皮下。待皮下移植瘤體積達到100～150 mm3時，按照腫瘤體積隨機分組。

MIL41對人乳腺癌細胞Bcap37細胞系裸鼠皮下移植瘤生長的影響，各受試藥組藥劑量為3、6 、12 mg/kg，尾靜脈注射給藥，每周給藥2次，連續(xù)給藥3周。每2～3 d測定動物體重及腫瘤體積，記錄腫瘤體積變化。腫瘤瘤重生長抑制率(%)=(對照組瘤重-給藥組瘤重)/對照組瘤重×100%。腫瘤體積=0.5ab2(a=腫瘤長徑；b=腫瘤短徑)

2 結(jié)果

2.1 流式檢測Her2表達量結(jié)果 實驗結(jié)果表明經(jīng)過抗體標記Bcap37細胞的Her2表達量為95.0%；與Her2高表達細胞BT474相比，人乳腺癌細胞Bcap37為Her2受體表達量較高的細胞。見圖1。

圖1 流式細胞術(shù)檢測Bcap37細胞Her2表達量

A：BT474細胞Her2受體表達量；B：Bcap37細胞Her2受體表達量

2.2 MIL41對Bcap37細胞增殖的影響 CCK8法實驗結(jié)果表明MIL41對Her2受體過表達的細胞Bcap37的生長抑制作用呈現(xiàn)良好的濃度依賴關(guān)系，受試藥物設(shè)置濃度基本涵蓋了藥物效應窗口。通過比較發(fā)現(xiàn)，MIL41對腫瘤細胞增殖抑制率與陽性藥相當，差異無統(tǒng)計學意義。同時，MIL41對腫瘤細胞增殖的抑制呈現(xiàn)劑量依賴性。見表1。

2.3 MIL41抑制Bcap37細胞裸鼠皮下移植瘤生長 實驗結(jié)果顯示，MIL41對人乳腺癌Bcap37裸鼠皮下移植瘤生長有明顯抑制作用。從體內(nèi)的藥效結(jié)果可以看出，在相同劑量情況下，MIL41在體內(nèi)的抗腫瘤藥效略高于陽性藥組。在試驗中動物未出現(xiàn)死亡，說明MIL41無毒性。見表2、圖2～4。

3 討論

人表皮生長因子受體Her2是有酪氨酸激酶活性的表皮生長因子家族中的一員，其受體的聚合作用會導致酪氨酸殘基的磷酸化，啟動多種信號通路導致細胞的增生和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Her2在25%的乳腺癌患者體內(nèi)為高表達[7]，Her2可以通過下游靶點來增加癌細胞的轉(zhuǎn)移能力使得Her2陽性的乳腺癌更有侵襲能力[8]以及參與細胞的生長、增殖和凋亡等功能性調(diào)節(jié)[9]。隨著分子生物學的發(fā)展，抗癌靶向藥物成為研究的熱點。在乳腺癌治療中，除了傳統(tǒng)的手術(shù)、放化療等治療方法外，靶向治療成了一種新型的治療手段[10]，靶向藥物也相繼問世，如通過與HER2受體結(jié)合后干擾其自身磷酸化及阻礙相應異源二聚體形成的Trastuzumab，以及第一個被稱作“HER二聚化抑制劑”的單克隆抗體Pertuzumab。因此在臨床中凡檢測到Her2過表達的患者都應接受抗Her2的治療[11]。

表1 MIL41對細胞生長的抑制效應

表2 MIL41對人乳腺癌細胞Bcap-37裸鼠皮下移植瘤生長抑制影響

與空白對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖2 MIL41對人乳腺癌細胞Bcap37裸鼠皮下移植瘤生長的抑制作用

A：空白對照；B：Trustuzumab；C：Pertuzumab；D：MIL41 3 mg/kg；E：MIL41 6 mg/kg；F：MIL41 12 mg/kg

圖3 MIL41對人乳腺癌細胞Bcap-37裸鼠皮下移植瘤生長抑制作用

圖4 MIL41對人乳腺癌細胞Bcap-37裸鼠皮下移植瘤體積生長的影響

本研究中將MIL41對乳腺癌Bcap37細胞體外及體內(nèi)進行系統(tǒng)的藥效評價。以Her2受體高表達細胞BT474作為檢測Bcap37細胞Her2表達量的對照發(fā)現(xiàn)，Bcap37細胞中Her2高表達。體外實驗結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加對Bcap37細胞生長抑制作用明顯增強，體現(xiàn)出濃度依賴性。在體內(nèi)實驗中，荷瘤鼠給予MIL41藥物治療后，腫瘤生長明顯緩解，通過瘤重抑制率來看，存在明顯的統(tǒng)計學差異。實驗結(jié)果表明MIL41對Her2過表達乳腺癌Bcap37的生長有較好的抑制作用，體現(xiàn)了良好的抗癌活性，為相關(guān)的基礎(chǔ)研究提供了藥效數(shù)據(jù)，同時也為臨床研究提供依據(jù)。目前，MIL41已被批準進入臨床階段研究，有望成為治療腫瘤中HER2高表達新型靶向藥物。

[1] 周佳麗，顏蘊文，江巧玲，等. 全反式維甲酸及其衍生物對乳腺癌細胞株MDA-MB-231凋亡的影響[J]. 安徽醫(yī)科大學學報，2015,50(2)：154-7.

[2] Yin K, Cao Y J. Study on efficacy and safety of trastuzumab chemotherapy for the treatment of human epidermal growth factor receptor-2 positive breast cancer[J]. Chin J Clin Pharmacol, 2015, 31(9):725-7.

[3] Zhong A S. Clinical application of second-line scheme containing trastuzumab in HER2-positive breast cancer and security analysis[J].Practical J Cancer,2014, 29(9):1121-3.

[4] 劉 君，楊艷芳，顧 林. 曲妥株單抗在HER-2陽性乳腺癌新輔助治療中的應用研究進展[J]. 中國腫瘤臨床,2014,41(16):1065-8

[5] Li W，Pan Y，Li X J. Research progresses in resistance mechanisms to trastuzumab for HER 2 positive breast cancer and novel molecular targeted therapeutic strategies[J]. Chin J Clin Pharmacol,2014,30 (1):48-51.

[6] Liu P P, Liao H H, Liu W X, et al. Development method for determination of biological activity of anti-epithelial growth factor receptor monoclonal antibody[J].Chin J Biologicals, 2015,28(4):414-7.

[7] Recondo G Jr, Dìaz Canton E, Vega M, et al. Therapeutic options for HER-2 positive breast cancer:Perspectives and future directions[J]. World J Clin Oncol，2014，5(3):440-54.

[8] Zhang L, Sullivan P S, Goodman J C, et al. MicroRNA-1258 suppresses breast cancer brain metastasis by targeting heparanase[J]. Cancer Res, 2011, 71(3):645-54.

[9] Ren Y X, Wang G L. The mechanism of HER2-amplified breast cancer with trastuzumab resistance and the research for novel therapy[J]. Chinese Bulletin Life Sci, 2012, 24(5):421-7.

[10]徐 璐，曾 雪，張志強，等. 乳腺癌分子靶向治療的現(xiàn)狀與展望[J].中國實用外科雜志,2015,35(7):790-3.

[11]Mukai H.Treatment strategy for HER2-positive breast cancer[J]. Int J Clin Oncol, 2010, 15(4):335-40.

Evaluation of anti-cancer effect of anti-epithelial growth factor receptor monoclonal antibody on human breast cancer Bcap37 cells

Cao Yuting1,2, Wang Shanshan2,Yang Dexuan2,et al

(1SchoolofGraduateStudies,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032;2DeptofPharmacologyandToxicology,BeijingInstituteofRadiationMedicine,Beijing100850)

ObjectiveToinvestigatetheinhibitoryeffectofanti-epithelialgrowthfactorreceptormonoclonalantibody(MIL41)onhumanbreastcancerBcap37celllinein vitroandin vivo.MethodsTheflowcytometryinstrumentwasusedtoevaluatethelevelofHer2expressioninBcap37cells,theanti-canceractivityofMIL41 in vitrobyCCK8inspection,whiletheactivityin vivowasevaluatedbysubcutaneousimplantedtumorsinnudemicemodel.Results In vitroexperimentsshowedtheover-expressionofHer2inhumanbreastcancerBcap37cells，meanwhile,thereplicatedCCK8inspectionshowedtheMIL41hadinhibitoryeffectinBcap37cells.TheresultsshowedthatMIL41hadstronginhibitoryeffectindose-dependentmanneronhumanbreastcancerBcap37xenotransplantedinnudemice.Theinhibitionratesoftumorvolumewere33.7%,47.8%and59.0%whentheadministratedconcentrationwas3,6,12mg/kg;moreover,theinhibitionratesoftumorweightwere29.6%,44.7%and55.6%.ConclusionMIL41couldefficientlyinhibittheproliferationofhumanbreastcancerBcap37 in vivoandin vitro.

epithelialgrowthfactorreceptor;monoclonalantibody;Her2;Bcap37;humanbreastcancer;anti-canceractivity

國家重大新藥創(chuàng)新科技重大專項綜合新藥研究開發(fā)技術(shù)大平臺項目(編號：2012ZX09301003-001)

1安徽醫(yī)科大學研究生院，合肥 2300322軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100850

曹玉婷，女，碩士研究生； 袁守軍，男，研究員，博士生導師，責任作者，E-mail：ysjyuan@139.com

時間：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.001.html

R 965.1

A

1000-1492(2016)11-1555-04

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.001

2016-07-10接收