梁爽爽，冀美超，胡曉晴，付成華，朱長(zhǎng)軍，董智雄

（天津師范大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院；b.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.分子細(xì)胞系統(tǒng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

核糖體蛋白R(shí)PL15多克隆抗體的制備與細(xì)胞內(nèi)定位

梁爽爽，冀美超，胡曉晴，付成華，朱長(zhǎng)軍，董智雄

（天津師范大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院；b.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.分子細(xì)胞系統(tǒng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

為了解核糖體大亞基蛋白R(shí)PL15在細(xì)胞中的定位和功能，設(shè)計(jì)并合成了RPL15蛋白的多肽，作用于抗原免疫兔子，使其產(chǎn)生特異性多克隆抗體，利用蛋白免疫印跡和免疫熒光方法檢測(cè)RPL15抗體的特異性.結(jié)果證實(shí)本研究成功制備并純化了RPL15的多克隆抗體，且該抗體可以特異性識(shí)別RPL15蛋白.免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明RPL15定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，主要定位于核仁并呈點(diǎn)狀分布，且與UBF、FBL和C23存在部分共定位.

RPL15；核糖體；多克隆抗體；免疫熒光；細(xì)胞內(nèi)定位

核糖體大亞基蛋白R(shí)PL15（ribosomal protein L15）隸屬于Pfam00827家族，其cDNA包含759個(gè)核苷酸，能夠編碼204個(gè)氨基酸，蛋白分子質(zhì)量約為24×103（24 kDa）[1].關(guān)于RPL15蛋白在細(xì)胞中的定位，Simoff等[2]和Klein等[3]發(fā)現(xiàn)在酵母細(xì)胞中該蛋白與Nop1蛋白共定位于核仁，且60%以上的部分與核仁的23S rRNA核苷酸序列結(jié)合，表明RPL15蛋白可能參與酵母細(xì)胞核糖體的早期組裝過(guò)程；Wang等[4]研究發(fā)現(xiàn)食道癌細(xì)胞中RPL15蛋白存在過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，且參與47S prerRNA中ITS1位點(diǎn)的有效切割過(guò)程，從而也證實(shí)了該蛋白參與核糖體RNA的加工過(guò)程.RPL15蛋白與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān).Landowski等[5]發(fā)現(xiàn)在先

天再生障礙性貧血癥細(xì)胞中RPL15基因缺失；Wang等[6]發(fā)現(xiàn)在多個(gè)胃癌細(xì)胞株（AGS、MKN45、MKN28、SGC7901和KATOⅢ）中RPL15的表達(dá)量較高，抑制RPL15的表達(dá)就可以抑制SGC7901細(xì)胞株的生長(zhǎng)[7]，RPL15蛋白這種促進(jìn)癌細(xì)胞增殖的作用使其有可能成為抗癌治療的潛在靶標(biāo).

RPL15蛋白在核糖體生物合成及疾病發(fā)生過(guò)程中具有多種重要功能，但其具體作用機(jī)制尚不清楚，該蛋白在細(xì)胞對(duì)內(nèi)外刺激應(yīng)答過(guò)程中的作用也需闡明.本研究將RPL15抗原注入兔子體內(nèi)提取RPL15多克隆抗體，并且明確其在細(xì)胞內(nèi)的定位.這有助于闡明該蛋白分子的生物學(xué)功能及分子機(jī)制，為其作為疾病的診斷蛋白標(biāo)記物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人宮頸癌細(xì)胞株HeLa為天津師范大學(xué)分子細(xì)胞系統(tǒng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室所有.

1.1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清，美國(guó)Hyclone公司；特異性單克隆鼠抗Tubulin抗體，美國(guó)Sigma公司；特異性單克隆鼠抗UBF抗體，美國(guó)Santa Cruz公司；特異性單克隆鼠抗Nucleolin（C23）和Fibrillarin（FBL）抗體，英國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠，美國(guó)Immuno公司；Opti-MEM、Tuberfect和抗體純化試劑盒，美國(guó)Thermo Scientific公司.

1.1.3 主要儀器

蛋白電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司；激光共聚焦顯微鏡，日本Nikon公司.

1.2 方法

1.2.1 RPL15抗原多肽序列的設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)RPL15抗原的多肽序列：Cys-Ser-Arg-Arg-Ala-Ala-Trp-Arg-Arg-Arg-Asn-Thr-Leu-Gln-Leu-His-Arg-Tyr-Arg，由昂泰生物科技有限公司合成該多肽.

1.2.2 RPL15抗原的制備

在2 mL的PBS（pH6.0）中加入134 μL的鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH），邊攪拌邊緩慢加入200 μL的質(zhì)量濃度為30 mg/mL的乙酸湖泊亞胺酯（MBS），充分混勻.將提前準(zhǔn)備好的G-25交聯(lián)葡聚糖珠子加入Bio-Rad柱中，用50 mL的PBS（pH 7.4）平衡柱子.將KLH和MBS的混合液加入柱中，用pH 7.4的PBS洗脫，同時(shí)用1.5 mL的離心管收集液體，每管收集1 mL.用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度，選取濃度高的3管液體混合，與100 mg的RPL15抗原多肽交聯(lián)，攪拌1 h.用pH 7.4的PBS透析12 h，分裝液體，于-80℃下保存?zhèn)溆?

1.2.3 抗原免疫兔子和血清的制備

首先抽取兔子的免疫前血清（pre-bleed），1周后對(duì)其進(jìn)行免疫注射RPL15抗原.將RPL15抗原與弗氏完全佐劑（體積比為1∶1）充分混勻.每只兔子第1次免疫需200 μg，即2 mL（1 mL弗氏完全佐劑+1 mL RPL15抗原）抗原.將混勻的2 mL抗原在兔子背部進(jìn)行皮下注射（共12～15個(gè)點(diǎn)）.2周后進(jìn)行第2次免疫注射，從本次開(kāi)始抗原量降至100 μg，弗氏完全佐劑換為弗氏不完全佐劑.1周后進(jìn)行第3次免疫注射.從第4周開(kāi)始抽取血清，用10 mL注射器從兔子耳緣動(dòng)脈抽取血漿，置于15 mL離心管中，于4℃下放置2～3 d，10 621 r/min離心30 min，上清液即為血清，將其分裝在2 mL離心管中，于-80℃下保存.

1.2.4 RPL15血清抗體的純化

將5 mg的RPL15多肽溶解在100 μL的PBS中，取10 μL加入到1 mL的coupling buffer中，剩余部分加入50 μL的TCEP，室溫孵育30 min.將1 mL的coupling buffer過(guò)Bio-Rad柱，重復(fù)2次，加TCEP溶液到柱中，室溫孵育45 min，收集流下的液體.用1 mL的PBS洗柱，重復(fù)3次，用1 mL的coupling buffer洗柱，重復(fù)1次.向柱中加入1 mL的Cysein·HCl溶液，室溫混合15 min，棄去液體，用6 mL的PBS平衡Bio-Rad柱.用10 mL的PBS稀釋5 mL血清，于4℃、8 000 r/min下離心15 min，取上清.將上清過(guò)柱3次，用10 mL的PBS洗柱.用1 mL的elution buffer洗脫抗體，1.5 mL離心管收集，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的疊氮鈉后于4℃下保存.

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

采用含有10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人宮頸癌細(xì)胞株HeLa，培養(yǎng)溫度為37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%.HeLa為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，每周傳代2～3次，傳代時(shí)先用胰酶消化細(xì)胞，再擴(kuò)增細(xì)胞至新鮮培養(yǎng)基中.

1.2.6 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

在24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中以每孔5×104的數(shù)量鋪入HeLa細(xì)胞，24 h后轉(zhuǎn)染pEGFP和pEGFP-RPL15質(zhì)粒.將100 μL的Opti-MEM、200 ng質(zhì)粒和1 μL的Tuberfect混勻，15 min后將混合液加入到培養(yǎng)的細(xì)胞中，24 h后通過(guò)觀察熒光情況確定其轉(zhuǎn)染效率.

1.2.7 小分子干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染

在24孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中以每孔1×104的數(shù)量鋪入HeLa細(xì)胞，24 h后轉(zhuǎn)染RPL15的siRNA.將100 μL

的Opti-MEM、50 nmol/L的RPL15 siRNA和1 μL的Tuberfect混勻，15 min后將混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，72 h后收集細(xì)胞.利用蛋白免疫印跡（Western Blot，WB）檢測(cè)RPL15的干涉效率.

1.2.8 免疫共沉淀（immunoprecipitate，IP）實(shí)驗(yàn)

收集1×106個(gè)HeLa細(xì)胞，用冰冷的PBS洗1次，加500 μL的RIPA Buffer（體積分?jǐn)?shù)為1%的NP-40+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的脫氧膽酸鈉+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS+ 150 mmol/L的NaCl+10 mmol/L的Na3PO4+50 mmol/L的NaF+2 mmol/L的EDTA+0.2 mmol/L的Na3VO3）裂解細(xì)胞，冰上靜置1 h，4℃、20 817 r/min下離心30 min.取出上清，平均分為2管，一管中加0.5 μL的免疫前血清（pre-bleed serum），另一管中加0.5 μL的免疫后血清（anti-RPL15 serum），于4℃搖床上搖4 h.每管裂解液中分別加入10 μL的protein A beads混合液，于4℃搖床上搖2 h.4℃、15 294 r/min下離心2 min.棄去上清，用800 μL的RIPA Buffer洗beads，15 294 r/min離心2 min，重復(fù)2次.棄去上清，加入25 μL的SDS上樣緩沖液，進(jìn)行蛋白免疫印跡分析.

1.2.9 蛋白免疫印跡

細(xì)胞裂解液經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，將RPL15蛋白（一抗抗體）轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉/TBS封閉30 min，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的脫脂奶粉/TBST中孵育，室溫雜交2 h，TBST洗3次，每次5 min.再加入對(duì)應(yīng)的二抗抗體室溫雜交1 h，TBST洗3次，每次5 min，在PVDF膜上加ECL和H2O2，室溫孵育2 min，曝光.

1.2.10 細(xì)胞免疫熒光（immunofluorescence，IF）觀察

向鋪有細(xì)胞爬片的24孔板中以每孔3×104的數(shù)量接種細(xì)胞，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng).24 h之后，每孔用500 μL的PBS洗3次，每次5 min.棄去PBS，用500 μL的甲醇丙酮（甲醇和丙酮的體積比為1∶1）混合液固定細(xì)胞3 min.棄去固定液，用500 μL的PBS洗3次，每次5 min.將爬片小心取出后各加100 μL的封閉液（體積分?jǐn)?shù)為5%的山羊血清+體積分?jǐn)?shù)為0.4%的Triton X-100+PBS），室溫封閉30 min.棄去封閉液，用500 μL的PBS洗1次，5 min后棄去PBS，加入50 μL用PBS-TX（含體積分?jǐn)?shù)為0.4%的Triton X-100的PBS溶液）稀釋的一抗稀釋液（一抗和PBS-TX的體積比為1∶300），室溫孵育2 h.棄去一抗稀釋液，用200 μL的PBS-TX洗3次，每次5 min.棄去PBS-TX，加入50 μL用PBS-TX稀釋的熒光標(biāo)記的二抗稀釋液（二抗和PBS-TX的體積比為1∶500），室溫避光孵育1 h.棄去二抗稀釋液，加入50 μL用PBS-TX稀釋的DAPI（DAPI和PBS-TX的體積比為1∶600），染色3 min.棄去DAPI，用200 μL的PBS-TX洗3次，每次5 min.棄去PBS-TX，在載玻片上滴上4 μL抗淬滅劑，將片子取出后細(xì)胞面向下放在滴有抗淬滅劑的載玻片上，用指甲油封片，于熒光顯微鏡下觀察.

2 結(jié)果

2.1 免疫共沉淀檢測(cè)RPL15抗體的特異性

用獲得的兔子免疫前血清和免疫后RPL15血清進(jìn)行免疫沉淀-免疫印跡檢測(cè)（IP-Western），結(jié)果如圖1所示.

圖1 蛋白免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RPL15抗體Fig.1 Detection of RPL15 antibody by immunoprecipitation experiment

由圖1可以看出，免疫前血清（prebleed）中未檢測(cè)到RPL15條帶；免疫后血清（anti-RPL15 serum）在分子質(zhì)量為24×103（24 kDa）的位置檢測(cè)到了特異性的RPL15條帶，證實(shí)本研究成功獲得了RPL15抗體.

2.2 RPL15 siRNA敲降后RPL15蛋白的表達(dá)

為了進(jìn)一步檢測(cè)RPL15抗體的特異性，本研究設(shè)計(jì)并合成了特異性靶向RPL15的小分子干擾RNA（siRNA）序列，通過(guò)轉(zhuǎn)染的方法敲降RPL15蛋白.對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行Western Blot分析，結(jié)果如圖2所示.

圖2 RPL15 siRNA敲降內(nèi)源RPL15蛋白Fig.2 Knockdown of RPL15 protein by RPL15 siRNA

由圖2可以看出，與對(duì)照組相比，RPL15的siRNA敲降后檢測(cè)不到RPL15條帶，即本研究獲得的RPL15抗體能夠被siRNA降解，從而驗(yàn)證了RPL15抗體具有特異性.

2.3 RPL15抗體對(duì)外源RPL15蛋白的識(shí)別

在人宮頸癌細(xì)胞株HeLa中轉(zhuǎn)染外源pEGFP-C1和pEGFP-RPL15質(zhì)粒.轉(zhuǎn)染24 h后，用全細(xì)胞裂解液裂解Hela細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行Western Blot（WB）分析，結(jié)果如圖3所示.由圖3可以看出，綠色熒光蛋白（GFP）抗體可以檢測(cè)到GFP和GFP-RPL15融合蛋白，本研究自制的RPL15抗體可以檢測(cè)到GFP-RPL15融合蛋白.由此確定RPL15抗體可以特異性地識(shí)別內(nèi)源和外源RPL15蛋白.

2.4 RPL15的細(xì)胞內(nèi)定位

對(duì)得到的RPL15抗體進(jìn)行純化，以核仁蛋白UBF、 FBL和C23為參照物，將其與RPL15共染色，免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示.

圖3 HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源pEGFP-C1和pEGFP-RPL15質(zhì)粒Fig.3 HeLa cells transfected with plasmids expressing pEGFP-C1 and pEGFP-RPL15

圖4 細(xì)胞免疫熒光技術(shù)鑒定RPL15蛋白的定位Fig.4 Appraisal RPL15 protein localization by cell immunofluorescence technique

由圖4可以看出，RPL15定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，主要定位于核仁并呈點(diǎn)狀分布，且與UBF、FBL和C23存在部分共定位.

3 討論與結(jié)論

在很多癌癥中，核糖體蛋白除參與蛋白質(zhì)合成外還具有其他功能，包括抑制或誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生、調(diào)節(jié)基因特異性表達(dá)、參與DNA修復(fù)、凋亡或促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和產(chǎn)生抗藥性等[8-12].如在非小細(xì)胞肺癌中，RPS29通過(guò)下調(diào)Bcl-2、Bcl-XL、survivin和上調(diào)p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13].與正常細(xì)胞比較，在癌細(xì)胞中一些核糖體蛋白的表達(dá)量出現(xiàn)變化，如在直腸癌中，S8、S12、S18、S24、L13a、L18、L28、L32和L35a表達(dá)量降低，而S11和L7的表達(dá)量明顯上調(diào)[14]；在肝癌中，S8、L12、L23a、L27和L30的mRNA表達(dá)水平上調(diào)；在肺癌和口腔癌中，RPL14蛋白的表達(dá)失效[15].這些結(jié)果表明在癌癥發(fā)生過(guò)程中核糖體蛋白的表達(dá)量出現(xiàn)變化是一個(gè)普遍現(xiàn)象.在腫瘤細(xì)胞中很多核糖體蛋白在p53-HDM2路徑中發(fā)揮作用，如RPL5、RPL11或RPL23等過(guò)表達(dá)，這些核糖體蛋白與E3泛素連接酶MDM2結(jié)合，阻止后者對(duì)p53的降解作用，造成p53的積累和活化[16-20]，最終導(dǎo)致細(xì)胞周期的G1期出現(xiàn)阻滯[21].

本研究制備了核糖體大亞基蛋白R(shí)PL15的多克隆抗體，免疫熒光方法表明該蛋白主要定位于細(xì)胞核的核仁部位，呈點(diǎn)狀分布，并且與UBF、FBL和C23有部分共定位.RPL15在核仁中的定位有利于核仁結(jié)構(gòu)的形成和維持，也可能參與成熟rRNA的形成過(guò)程. RPL15可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此可作為胃癌診斷的潛在標(biāo)記物.RPL15影響細(xì)胞生長(zhǎng)的具體分子機(jī)制尚沒(méi)有明確報(bào)道，因此需要進(jìn)一步對(duì)RPL15進(jìn)行功能研究，探討RPL15是否也是通過(guò)RPs-MDM2-p53路徑影響細(xì)胞生長(zhǎng).

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（責(zé)任編校 紀(jì)翠榮）

Preparation and localization of ribosomal protein RPL15 polyclonal antibody

LIANG Shuangshuang，JI Meichao，HU Xiaoqing，F(xiàn)U Chenghua，ZHU Changjun，DONG Zhixiong
（a.College of Life Sciences，b.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，c.Key Laboratory of Molecular and Cellular Systems Biology，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）

To learn the location and function of the ribosomal large subunit protein RPL15 in cells，the peptide of RPL15 protein acting as the antigen to immune rabbit was designed and synthesized to produce the polyclonal antibody.The specificity of RPL15 antibody was detected by Western blot and immunofluorescence.The results confirmed that the RPL15 polyclonal antibody was prepared and purified successfully，and the antibody can identify RPL15 protein specifically.Immunofluorescence showed that RPL15 protein was located in cytoplasm and nuclei，mainly in the nucleolus and dotted distribution. Furthermore，the partially co-localization was obtained between RPL15 with UBF，F(xiàn)BL and C23.

RPL15；ribosome；polyclonal antibody；immunofluorescence；localization in cell

Q291

A

1671-1114（2016）05-0055-05

2016-02-15

國(guó)家自然科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目（31271485）；2011年教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”資助項(xiàng)目（NCET-11-1066）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目（31301138）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃重點(diǎn)資助項(xiàng)目（12JC2DJC21400）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃一般資助項(xiàng)目（14JCYBJC24200）；天津市中小企業(yè)科技創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目（14ZXCXSY00121）；天津師范大學(xué)中青年教授學(xué)術(shù)創(chuàng)新推進(jìn)計(jì)劃資助項(xiàng)目（52XC1001）；天津師范大學(xué)“渤海學(xué)者”基金資助項(xiàng)目（5RL092）；天津師范大學(xué)博士基金資助項(xiàng)目（52XB1104）.

梁爽爽（1990—），女，碩士研究生.

董智雄（1984—），男，講師，主要從事分子細(xì)胞生物學(xué)方面的研究.