龐庭才，鐘秋平，胡上英，徐淑慶，李創(chuàng)蓮

（欽州學(xué)院食品工程學(xué)院，廣西欽州535099）

響應(yīng)面分析法優(yōu)化堿蓬黃酮提取工藝

龐庭才，鐘秋平，胡上英，徐淑慶，李創(chuàng)蓮

（欽州學(xué)院食品工程學(xué)院，廣西欽州535099）

利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化堿蓬黃酮的提取工藝。以黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取溫度進(jìn)行考察，優(yōu)選出最佳堿蓬黃酮提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)89.0%，料液比1∶35（g∶mL），提取時(shí)間3.1 h，提取溫度67.0℃，堿蓬黃酮得率理論值為3.52%。在此最佳工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，堿蓬黃酮得率實(shí)際值為3.50%，說(shuō)明該優(yōu)化方法合理可行。

響應(yīng)面法；堿蓬；黃酮；提取

堿蓬（Suaeda salsaL.）屬藜科，為一年生草本植物，一般生于海濱、湖邊、荒漠等處的鹽堿荒地上，是一種典型的鹽堿地指示植物[1]。在我國(guó)分布廣泛，堿蓬莖葉和種籽營(yíng)養(yǎng)成分完整齊全，除富含脂肪、蛋白質(zhì)外，礦物質(zhì)元素和維生素的含量也很豐富[2-4]。隨著對(duì)野生植物資源開(kāi)發(fā)研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)堿蓬是一種優(yōu)質(zhì)蔬菜、經(jīng)濟(jì)作物和具有醫(yī)療保健價(jià)值的植物資源[5]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)鹽地堿蓬的研究集中于植物生理、耐鹽性以及土壤改良等方面[6-8]。而對(duì)于堿蓬中黃酮類化合物的提取與分析方面的研究還比較少。而對(duì)于黃酮類化合物提取的方法主要有：水提取法、乙醇-水溶劑提取法、超聲波法、微波法、大孔樹(shù)脂吸附分離法、乙醇-水溶液加微波和樹(shù)脂提取分離法等。葉春等[9]采用微波法提取魚(yú)腥草葉總黃酮，提取率可達(dá)95%以上；滕海鵬等[10]研究了超聲波法提取菊米黃酮類化合物的工藝，最終總黃酮得率可達(dá)16.96%；王蕙等[11]采用添加纖維素酶提取銀杏葉總黃酮，提取量為6.367 6 mg/g；又以乙醇-水為提取液采用半仿生法提取，最終總黃酮提取量為6.459 8 mg/g。本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對(duì)堿蓬中黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，探索堿蓬黃酮的最佳提取工藝條件，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用堿蓬資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

堿蓬：采集于廣西欽州港沙質(zhì)鹽沼濕地；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99%）：上海金穗生物科技有限公司；乙酸乙酯、石油醚、丙酮、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉等（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

EL204電子天平：梅特勒-托利多（上海）有限公司；UV-3200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；H1850臺(tái)式離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 堿蓬黃酮提取工藝

操作要點(diǎn)：

a.預(yù)處理：將堿蓬莖葉清洗干凈，晾干后置于干燥箱中50℃烘干，粉碎過(guò)60目篩，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

b.脫脂：取10.0 g堿蓬粉末置于50 mL石油醚中浸泡2.5 h后過(guò)濾，濾渣烘干備用。

c.浸提：稱取2.0 g脫脂后的堿蓬粉末，加入60 mL體積分?jǐn)?shù)85%乙醇溶液，60℃水浴浸提3h，濾液定容至100mL，即為黃酮待測(cè)液。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法[12]測(cè)定黃酮的含量。

精確吸取0.1mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5mL、1.0mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL，分別置于25 mL比色管中，加入體積分?jǐn)?shù)85%乙醇溶液至10.0 mL，再加入5%NaNO20.8 mL，搖勻，靜置5min后，加入10%Al（NO3）30.8 mL，再靜置5min后，加入4%NaOH溶液10 mL，搖勻后定容至比色管刻度，搖勻，靜置15 min。在波長(zhǎng)249 nm處測(cè)吸光度值[9]，以蘆丁質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出線性回歸方程為：Y=46.366X+0.005 3（R2=0.999 3）。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算堿蓬中黃酮的含量及黃酮得率，黃酮得率計(jì)算公式如下：

式中：C為測(cè)量液中黃酮含量，mg/mL；V1為測(cè)量液的定容體積，mL；V2為測(cè)量時(shí)量取的體積，mL；V3為提取液的定容體積，mL；m為堿蓬樣品的質(zhì)量，mg。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

分別選取不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)（75%、80%、85%、90%、95%和100%）、料液比（1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45和1∶50（g∶mL））、提取溫度（45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃）和時(shí)間（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h和3.5 h）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)堿蓬黃酮得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用DesignExpert8.0.5軟件，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理[13]，選取料液比（X1）、提取溫度（X2）、提取時(shí)間（X3）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X4）為4個(gè)試驗(yàn)因素，以黃酮得率（Y）為響應(yīng)值，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)對(duì)堿蓬黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響

考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol content on the yield of flavonoids

由圖1可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%～85%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，黃酮得率也隨之增大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到85%時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大值，為3.12%；但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＞85%時(shí)黃酮得率又有所下降。這可能是因?yàn)楫?dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較高時(shí)，一些醇溶性雜質(zhì)的溶出量增加，與黃酮類化合物競(jìng)爭(zhēng)乙醇，從而導(dǎo)致總黃酮得率下降[14]。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)85%為宜。

2.1.2 料液比對(duì)黃酮得率的影響

考察不同料液比對(duì)黃酮得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)黃酮得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of flavonoids

由圖2可知，當(dāng)料液比＜1∶30（g∶mL）時(shí)，隨著料液比的增大，黃酮得率也呈上升趨勢(shì)；當(dāng)料液比為1∶30（g∶mL）時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大，為3.15%；但是隨著料液比的增大，黃酮得率反而呈下降趨勢(shì)。主要的原因是料液比影響溶劑的極性，從而影響不同極性黃酮類化合物的溶解性；當(dāng)液料比增大時(shí)，乙醇中提取出的總黃酮含量相對(duì)較小，傳質(zhì)阻力較小，利于樣品中黃酮類化合物的溶出，但是當(dāng)料液比太大時(shí)，在較長(zhǎng)的后續(xù)處理加熱過(guò)程中對(duì)熱不穩(wěn)定的黃酮可能被氧化分解等，從而黃酮得率降低[15]。因此，選擇料液比1∶30（g∶mL）為宜。

2.1.3 提取溫度對(duì)黃酮得率的影響

考察不同提取溫度對(duì)黃酮得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 提取溫度對(duì)黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of flavonoids

由圖3可知，在45～60℃范圍內(nèi)，隨著提取溫度的升高，黃酮得率也隨之增加，當(dāng)提取溫度為60℃時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大值，為3.20%；當(dāng)提取溫度＞60℃時(shí)，黃酮得率卻逐漸降低。這可能是因?yàn)闇囟壬吣苁怪参锝M織軟化膨脹，增加可溶性成分的溶解和擴(kuò)散速度，加熱溫度越高，溶劑的粘度越小，植物有效成分的擴(kuò)散速度越快[16]。但由于植物有效成分大多是不耐熱的，生物活性極易受到破壞，過(guò)高的浸取溫度會(huì)使之分解、變質(zhì)或揮發(fā)散失[17]。因此，選擇提取溫度60℃為宜。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

考察不同提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of flavonoids

由圖4可知，在提取時(shí)間為1.0～3.0 h時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮得率顯著增加；當(dāng)提取時(shí)間為3.0 h時(shí)，黃酮得率達(dá)到最大值，為3.11%；之后隨提取時(shí)間的增加，黃酮得率卻有所下降，這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，醇溶性物質(zhì)溶出率增加，部分黃酮可能被氧化使黃酮提取率下降。因此，選擇提取時(shí)間3.0 h為宜。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)料液比、提取溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，以堿蓬中黃酮得率為響應(yīng)值（Y），響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design Expert 8.0.5.0軟件對(duì)表2中試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到黃酮得率Y與4個(gè)因素X1、X2、X3、X4之間的二次回歸方程為：Y= 3.47-0.052X1+0.12X2+0.080X3-0.15X4-0.028X1X2+0.17X1X3-0.13X1X4+0.18X2X3-0.18X2X4-0.070X3X4-0.17X12-0.27X22-0.37X32-0.48X42。

由表3回歸模型進(jìn)行方差分析可知，模型P＜0.000 1，表明回歸模型達(dá)到顯著水平。失擬項(xiàng)P=0.188 1，并無(wú)顯著性影響，表明數(shù)據(jù)沒(méi)有異常點(diǎn)，不需要分析更高次數(shù)的項(xiàng)，模型適當(dāng)。由于相關(guān)系數(shù)為R2=97.52%，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有97.52%來(lái)源于所選變量，說(shuō)明回歸方程擬合度良好，回歸方程極顯著（P＜0.01）。由P值可知，方程的X2、X3、X4、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4、X12、X22、X32、X42對(duì)黃酮得率Y值影響極顯著（P＜0.01），X1、X1X2、X3X4對(duì)黃酮得率Y值影響顯著（P＜0.05），表明該方程并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，交互作用對(duì)響應(yīng)值影響很大，方程二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值影響也很大。由F值可知，各因素對(duì)堿蓬黃酮得率影響的主次為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞提取時(shí)間＞料液比。

根據(jù)回歸方程得出不同因素的響應(yīng)面分析圖及相應(yīng)等高線圖結(jié)果見(jiàn)圖5。響應(yīng)面斜度相對(duì)陡峭，表明響應(yīng)值受提取條件的改變的影響很大，反之如果響應(yīng)面斜度相對(duì)較平，表明響應(yīng)值受提取條件的改變的影響很小[18]。由等高線圖可以看出橢圓越密集，說(shuō)明響應(yīng)值受提取條件的影響就越大。由圖5可知，響應(yīng)面開(kāi)口向下，隨著每個(gè)因素的增大，響應(yīng)值增大，當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后，隨著因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小。該模型有穩(wěn)定點(diǎn)，且穩(wěn)定點(diǎn)是最大值。從其等高線圖可看出，等高線為橢圓形，證明各因素之間交互作用顯著。

圖5 料液比、提取溫度、提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用對(duì)黃酮得率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between solid-liquid ratio,temperature, time and ethanol content on flavonoids yield

2.3 最佳提取工藝的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)二次多項(xiàng)回歸的預(yù)測(cè)，得出堿蓬中黃酮的最佳提取工藝條件為料液比1∶35.12（g∶mL），提取溫度66.85℃，提取時(shí)間3.11 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)88.77%，在此條件下，堿蓬黃酮得率的預(yù)測(cè)值為3.52%?？紤]到試驗(yàn)操作的可行性，將最優(yōu)提取條件修正為料液比1∶35（g∶mL），提取溫度67.0℃，提取時(shí)間3.1 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)89.0%，在此條件下所測(cè)得黃酮得率為3.50%，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值偏差為0.02%，說(shuō)明該回歸方程能夠比較真實(shí)地反應(yīng)各因素對(duì)堿蓬黃酮得率的影響，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化的提取條件真實(shí)可靠。

3 結(jié)論

本研究利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化堿蓬黃酮的提取工藝。以黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素和響應(yīng)面分析法對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間和提取溫度進(jìn)行考察，得出各因素對(duì)堿篷黃酮得率影響的主次為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞提取時(shí)間＞料液比，最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)89.0%，料液比1∶35（g∶mL），提取時(shí)間3.1 h，提取溫度67.0℃，在此條件下，堿蓬黃酮得率為3.50%，說(shuō)明該優(yōu)化方法合理可行。目前，黃酮類物質(zhì)在醫(yī)療保健、生物工程、食品等方面的應(yīng)用日益引起人們重視，其抗氧化活性也已成為重要的研究方向。本試驗(yàn)可為開(kāi)發(fā)黃酮類物質(zhì)在抗癌、抗衰老、食品保健等方面提供相應(yīng)的技術(shù)支持和參考。

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Optimization of extraction process of flavonoids fromSuaeda salsaby response surface methodology

PANG Tingcai,ZHONG Qiuping,HU Shangying,XU Shuqing,LI Chuanglian
(College of Food Engineering,Qinzhou University,Qinzhou 535099,China)

The extraction conditions of flavonoids fromSuaeda salsawere optimized by response surface methodology.Using the flavonoids yield as evaluation index,the ethanol content,solid-liquid ratio,extraction time and temperature were researched by single factor experiments and response surface methodology.The optimal extraction conditions of flavonoids fromSuaeda salsawere ethanol content 89.0%,solid-liquid ratio 1∶35(g∶ml), extraction time 3.1 h and temperature 67.0℃.Under the conditions,the theoretical value and actual value ofS.salsaflavonoids yield was 3.52%and 3.50%,respectively,which showed that the optimal method was reasonable and feasible.

response surface methodology;Suaeda salsa;flavonoids;extraction

TS201.1

0254-5071（2016）11-0140-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.029

2016-07-06

欽州學(xué)院校級(jí)科研項(xiàng)目（2013XJKY-09B）

龐庭才（1985-），男，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)橹参镉行С煞痔崛∨c分析。