羅 亮，趙炫仲，李昕珊，岳毅剛

（1.桂林醫(yī)學(xué)院 廣西 桂林 541000；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 廣西 桂林 541000）

人參皂苷Rb1注射對(duì)兔耳增生性瘢痕中PCNA表達(dá)的影響

羅 亮1，趙炫仲2，李昕珊2，岳毅剛2

（1.桂林醫(yī)學(xué)院 廣西 桂林 541000；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 廣西 桂林 541000）

目的：建立兔耳增生性瘢痕模型，通過局部注射人參皂苷Rb1，觀察增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen PCNA）的表達(dá)變化。方法：取8只新西蘭白兔，每只兔耳6處創(chuàng)面，建立增生性瘢痕模型，設(shè)空白組，地塞米松組，生理鹽水組，人參皂苷Rb1組。待傷口上皮化后，局部注射藥物，每3d 1次，共三次，空白組不予處理。給藥后第1、2、4、8周切除標(biāo)本行MASSON染色觀察瘢痕情況及瘢痕增生高度,免疫組化法檢測(cè)PCNA表達(dá)。結(jié)果：注射后4、8周，與生理鹽水組比較，地塞米松及人參皂苷Rb1組瘢痕均改善明顯，瘢痕增生高度降低（P＜0.05），PCNA表達(dá)降低（P＜0.05）。結(jié)論：人參皂苷Rb1可有效抑制細(xì)胞增殖，改善兔耳增生性瘢痕增生。

增生性瘢痕；人參皂苷Rb1；增殖細(xì)胞核抗原；兔耳增生性瘢痕模型；成纖維細(xì)胞；瘢痕增生指數(shù)

當(dāng)各種創(chuàng)傷愈合過程中出現(xiàn)成/肌成纖維細(xì)胞活性增強(qiáng)并異常增殖，細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）大量合成并沉積且無(wú)法吸收，則出現(xiàn)病理性瘢痕，可出現(xiàn)局部癥狀、影響容貌美觀、造成功能障礙。防治策略多為抑制活性細(xì)胞增殖、促其凋亡、調(diào)節(jié)膠原代謝，治療方法多樣[1]然而效果各異，與其發(fā)生機(jī)制不十分明確有關(guān)。近年來(lái)，中國(guó)傳統(tǒng)中藥治療增生性瘢痕研究顯示效果良好。本實(shí)驗(yàn)以兔耳增生性瘢痕模型[2]為研究對(duì)象，局部注射人參皂苷Rb1，觀察其治療效果及細(xì)胞增殖情況變化。

1　材料和方法

1.1材料：新西蘭白兔，8只，公兔，體重1.9～2.7kg。Rb1由上海源葉生物科技有限公司提供。Masson染色試劑盒購(gòu)自Solarbio LIFE，SCIENCES. Anti-PCNA antibody購(gòu)自abcam。兔超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1建立模型：兔耳腹側(cè)面造圓形創(chuàng)面，每耳6處，直徑1cm，間隔1cm，深達(dá)軟骨。1周后同方法再次原位造創(chuàng)，待其上皮化，模型建立。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法：分生理鹽水組、Rb1組、地塞米松組及空白組，每組24個(gè)樣本?？瞻捉M不予處理； Rb1組及地塞米松組藥物濃度均為1mg/ml，局部注射給藥量每次0.3ml，3天1次，共3次。給藥后1、2、4、8周隨機(jī)處死2只兔子，切取樣本（含軟骨及周邊正常皮膚組織0.5cm）。經(jīng)瘢痕最高處一分為二，置入10%甲醛固定行Masson染色及免疫組化。

1.2.3Masson染色：標(biāo)本包埋固定切片后行Masson染色（按說明書進(jìn)行），計(jì)算瘢痕增生最高處及周圍正常皮膚到軟骨的垂直距離比值。

1.2.4PCNA免疫組化：組織切片常規(guī)脫蠟、水化，98℃水浴法PH=6.0枸櫞酸鈉抗原修復(fù)20min，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，5%BSA封閉，一抗孵育37℃孵育1h，Polymer Helper室溫孵育20min，poly-HRP anti-Rabbit IgG室溫孵育30min，DAB顯色，鏡下確定顯色時(shí)間，蘇木素復(fù)染。鏡下觀察PCNA表達(dá)，隨機(jī)選擇3處高倍視野測(cè)定細(xì)胞陽(yáng)性率及染色強(qiáng)度，采用H-score法評(píng)分，取均值。

1.2.5統(tǒng)計(jì)：各組瘢痕增生指數(shù)除以空白組增生指數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。軟件采用SPSS19.0，計(jì)量資料以“xˉ±s”表示，采用方差分析，若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性及方差齊性，改用非參數(shù)檢驗(yàn)。選α=0.05，當(dāng)P≤0.05，數(shù)據(jù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1肉眼觀察：傷口21d上皮化，局部隆起，呈“山丘樣”改變，色紅，質(zhì)硬。給藥后隨治療時(shí)間延長(zhǎng)，瘢痕隆起高度逐步降低，色澤變淡，質(zhì)地變軟，地塞米松及Rb1組較生理鹽水及空白組瘢痕改善明顯。

2.2Masson染色：早期，表皮增厚，真皮細(xì)胞、血管成分增多，膠原纖維排列紊亂，多見膠原結(jié)節(jié)、“渦旋狀結(jié)構(gòu)”，隨時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞、血管成分逐步減少，膠原纖維呈束狀，排列相互平行、較有規(guī)律。地塞米松組、Rb1組較鹽水組改善明顯（見圖1）。

圖1　第4周Masson染色×200組織結(jié)構(gòu)

2.3瘢痕增生指數(shù)：結(jié)果見表1，顯示第1、2周三組間比較（P＞0.05），第4、8周地塞米松組及Rb1組比較（P＞0.05），但與生理鹽水組比較（P＜0.05）。

表1　各組給藥后不同時(shí)間的瘢痕增生指數(shù)比較 (xˉ±s n=18）

2.4PCNA表達(dá)：PCNA定位于細(xì)胞核內(nèi)，顆粒狀，染色強(qiáng)度不一，早期密度高，隨治療時(shí)間延長(zhǎng)染色強(qiáng)度逐漸降低，表達(dá)多聚集于表皮基底部、血管內(nèi)皮、血管周邊、膠原結(jié)節(jié)周邊，此外，散在分布的成纖維細(xì)胞亦呈陽(yáng)性表達(dá)，隨治療時(shí)間延長(zhǎng)，PCNA表達(dá)量及染色強(qiáng)度均明顯減少（見圖2）。

圖2　第2周PCNA染色×400組織結(jié)構(gòu)

結(jié)果統(tǒng)計(jì)情況見圖3，分析顯示第1、2周三組間PCNA表達(dá)（P＞0.05），第4、8周地塞米松組及Rb1組PCNA表達(dá)（P＞0.05），但與生理鹽水組比較（P＜0.05）。

圖3　PCNA表達(dá)：#P＜0.05 地色米松組VS生理鹽水組；#P＜0.05 Rb1組VS生理鹽水組

3　結(jié)論

增殖細(xì)胞核抗原由Miyachi等[3]于1978年首次發(fā)現(xiàn)并命名。僅出現(xiàn)在增殖旺盛的細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞內(nèi)，是DNA聚合酶的輔助因子。其參與DNA的復(fù)制及修復(fù)[4]，細(xì)胞周期G1晚期開始增加，S期達(dá)到高峰，G2、M期明顯降低，到G0期最低，其濃度呈周期性波動(dòng)，與DNA合成變化一致，可用于評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)，為診斷及預(yù)后提供幫助。因此，其可能成為治療癌癥的潛在靶點(diǎn)[5]。

病理性瘢痕[6-7]是創(chuàng)面愈合失控的結(jié)果，是各種原因引起的組織病理上表現(xiàn)為活性細(xì)胞大量增殖，細(xì)胞外基質(zhì)大量合成并沉積且無(wú)法吸收所致。其形成與許多細(xì)胞的數(shù)量及功能狀態(tài)有關(guān)，其中，成纖維細(xì)胞[8-10]是主要的修復(fù)細(xì)胞，其數(shù)量及功能狀態(tài)是瘢痕形成過程的關(guān)鍵因素。

人參皂苷Rb1研究主要集中于心血管等方面。瘢痕治療方面已有研究[11-14]顯示人參皂甙Rbl可促血管生成、可抑制活性氧物質(zhì)產(chǎn)生及減少ECM分泌、減少促纖維化相關(guān)因子的表達(dá)、誘導(dǎo)凋亡產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與生理鹽水組比較，隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)Rb1組及地塞米松組活性細(xì)胞及血管成分逐漸減少，PCNA表達(dá)的量及強(qiáng)度逐漸減少，改善了瘢痕的增生，可能與藥物抑制了成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等活性細(xì)胞的增殖有關(guān)。但亦有研究[15]顯示瘢痕增生是由于凋亡太少所致，結(jié)果不一致可能因其檢測(cè)凋亡對(duì)象為肌成纖維細(xì)胞。在防治策略上，抑制活性細(xì)胞增殖和/或調(diào)控細(xì)胞凋亡均可能成為新的治途徑。

[1]Gold MH,McGuire M,Mustoe TA,et al.Updated international clinical recommendations on scar management:part2-algorithms for scar prevention and treatment[J].Dermatol Surg,2014,40:825-831.

[2]李薈元,劉建波,夏煒,等.增生性瘢痕動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⑴c應(yīng)用[J].中華整形外科雜志,2001,17:276-278.

[3]Miyachi K,Fritzler MJ,Tan EM.Autoantibody to a nuclear antigen in proliferating cells[J].J Immunol,1978,121(6):2228-2234.

[4]Essers J,Theil AF,Baldeyron C,et al.Nuclear Dynamics of PCNA in DNA Replication and Repair[J].Molecul Cell Biol,2005,25(21):9350-9359.

[5]Wang SC.PCNA:a silent housekeeper or a potential therapeutic target[J].Trends Pharmacol Sci,2014,35(4):178-186.

[6]Bran GM,Goessler UR,Hormann K,et al.Keloids:Current concepts of pathogenesis(review)[J].Int J Molecul Med,2009,24(3):283-293.

[7]van der Veer WM,Bloemen MC,Ulrich MM,et al.Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation[J]. Burns,2009,35(1):15-29.

[8]K?se O,Waseem A.Keloids and hypertrophic scars:are they twodifferent sides of the same coin?[J].Dermatol Surg,2008,34:336-346.

[9]Keeley EC,Mehrad B,Strieter RM.Fibrocytes:bringing new insights into mechanisms of inflammation and fibrosis[J].Int J Biochem Cell Biol,2010,42(4):535-542.

[10]Chun Q,ZhiYong W,Fei S,et al.Dynamic biological changes in fibroblasts during hypertrophic scar formation and regression[J].Int Wound J,2016,13(2):257-262.

[11]Kimura Y,Sumiyoshi M,Kawahira K,et al.Effects of ginseng saponins isolated from Red Ginseng roots on burn wound healing in mice[J].Br J Pharmacol,2006,148(6):860-870.

[12]XIE Xi-sheng,LIU Heng-chuan,FAN Jun-ming,et al.Effects of ginsenoside Rb1 on TGF-β1 induced p47phox expression and extracelluarmatrix accumulation in rat rental tubular epithelial cells[J].Sichuan Univ,Med Sci Edi,2009,1:106-110.

[13]Tark KC,Lee DW,Lew DH,et al.Effects of ginsenoside Rb1 on hypertrophic scar remodeling in rabbit model[J].Eur J Pharmacol,2015,750:151-159.

[14]李昕珊,岳毅剛,張克勤,等.人參皂苷Rb1對(duì)增生性瘢痕影響的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2014,26:1014-1020.

[15]汪琴,吳宗耀.細(xì)胞凋亡與肥厚性瘢痕發(fā)生關(guān)系的研究[J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,1999,21:223 -226.

編輯/張惠娟

Effect of Ginsenoside Rb1 on the expression of PCNA in rabbit ear hypertrophic scar

LUO liang1,ZHAO Xuan-zhong2,LI Xin-shan2,YUE Yi-gang2
(1 Guilin Medical University,Guilin 541000,Guangxi,China; 2.Affilicated Hospital of Guilin Medical University,Guilin 541000,Guangxi,China)

Objective To observe the effect of ginsenoside Rb1 on hypertrophic scars of rabbit`s ear and test the expression of Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Methods 8 rabbits were chosen randomly and 6 wounds were made in each rabbit ear to establish hypertrophic scars(HS).After the wounds epithelialization,the HS were separated into 4 groups: Blank group,Dexamethasone group,saline group,Ginsenoside Rb1 group. The administration was done once every 3 days for 3 times. On 1st,2nd,4th,8th weeks after the treatment,2 rabbits`s samples were resected randomly to test Masson staining and detect PCNA expression by immunohistochemistry. Results On 4th and 8th weeks after administration,compared with saline group,the scars of dexamethasone and ginsenoside Rb1 group were improved significantly,Scar elevation index reduced (P ＜0.05),the expression of PCNA decreased (P ＜0.05). Conclusion Ginsenoside Rb1 could effectively inhibit cell proliferation and improve scar hyperplasia.

hypertrophic scars;Ginsenoside Rb1;proliferating cell nuclear antigen;scar model of rabbit ear;fibroblast;scar elevation index

R619+.6

A

1008-6455（2016）11-0065-03

桂林市科學(xué)技術(shù)局科技攻關(guān)項(xiàng)目（20140120-1-4）

岳毅剛，男，1959.5，科室主任，教授，瘢痕的病因及治療；桂林市樂群路20號(hào)桂林附屬醫(yī)院整形外科，郵編：541001；E-mail：y.y.g@263.net

2016-07-22

2016-10-25