王 鵬，弓軍勝，李晉福，張寶林，鄭若楠

（1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院整形科 山西 太原 030001; 3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 上海 200011）

5-Fu作用于瘢痕疙瘩成纖維細胞后Caspase-3變化的研究

王 鵬1,2，弓軍勝2，李晉福1，張寶林2，鄭若楠3

（1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院整形科 山西 太原 030001; 3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 上海 200011）

目的：從蛋白層面證明瘢痕疙瘩、正常皮膚成纖維細胞中Caspase-3蛋白表達水平存在差異。通過5-fu(5-氟尿嘧啶)濃度梯度作用瘢痕疙瘩成纖維細胞后，觀察細胞中Caspase-3蛋白的表達，及細胞增殖、遷移和侵襲性變化。方法：臨床手術(shù)獲取瘢痕疙瘩、正常皮膚組織塊，培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞（keloid fibroblast KF）及正常皮膚成纖維細胞（normal skin fibroblast NSF），應(yīng)用免疫組織化學(xué)及Western blot檢測組織塊及細胞中Caspase-3蛋白的表達；將5-fu(5-氟尿嘧啶)濃度梯度作用瘢痕疙瘩成纖維細胞（KF）后，應(yīng)用Western blot檢測Caspase-3蛋白的表達；CCK-8法檢測KF細胞增殖情況；Trans-wells小室實驗檢測KF細胞的體外遷移和侵襲能力。結(jié)果：瘢痕疙瘩組織、正常皮膚組織、KF、NSF中均有Caspase-3蛋白的表達；KF中Caspase-3蛋白表達水平明顯低于NSF，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，瘢痕疙瘩組織塊中Caspase-3蛋白表達水平明顯低于正常皮膚組織，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；5-fu作用KF后，Western blot顯示隨著5-fu濃度的降低,KF中caspase-3蛋白表達減少,差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。CCK-8結(jié)果顯示，隨著5-fu濃度的降低,對KF增值活性的抑制不斷減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；Trans-well侵襲結(jié)果顯示侵襲到下室的KF數(shù)目隨5-fu濃度的不斷降低，而增多。結(jié)論：Caspase-3在KF中的表達明顯低于NS，同時是5-fu誘導(dǎo)KF凋亡的關(guān)鍵因子，5-fu以濃度依賴方式促進Caspase-3活性增高，同時抑制KF增值、侵襲、遷移等腫瘤特性。

瘢痕疙瘩成纖維細胞；正常皮膚成纖維細胞；5-氟脲嘧定子；Caspase-3蛋白；細胞凋亡

瘢痕疙瘩是人類特有的一種真皮的纖維增生性疾病，經(jīng)常發(fā)生在炎癥，創(chuàng)傷，燒傷或手術(shù)后。雖然它不是致命的，但會嚴重影響美觀，帶來瘙癢和疼痛感，這些都會影響到病人的正常生活。瘢痕疙瘩通常被稱為良性的真皮腫瘤，因為它超出了原來的傷口的界限，而且不能自發(fā)消退，手術(shù)切除后復(fù)發(fā)率大，而且往往會出現(xiàn)加劇的現(xiàn)象。

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進步，近年來腫瘤研究進展迅速，不但推動了腫瘤臨床診斷和防治水平的提高，并帶動了相關(guān)學(xué)科的發(fā)展。研究表明，瘢痕疙瘩在病因、病理機制、臨床表現(xiàn)、診斷和治療等方面均與腫瘤具有類似之處，在一定程度上具有腫瘤的生物學(xué)特性，是具有一定腫瘤特性的病變，為此蔡景龍教授首先提出了瘢痕疙瘩發(fā)生的腫瘤源性學(xué)說[1]，即瘢痕疙瘩與腫瘤具有相似的生物學(xué)特點。在瘢痕疙瘩的研究中，部分腫瘤相關(guān)因子表達異常，導(dǎo)致瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡異常，瘢痕疙瘩被認為是皮膚的良性腫瘤，借鑒腫瘤學(xué)研究成果開展瘢痕疙瘩的研究日益增多。目前5-氟尿嘧啶（5-Fu）在國內(nèi)外被廣泛用來作為治療腫瘤的化療用藥，同時5-fu也早已被廣泛應(yīng)用于瘢痕疙瘩的注射治療，但其在對抗瘢痕疙瘩方面的具體機制還不是很明確。研究表明Caspase家族廣泛存在于人體皮膚組織細胞中，可通過與眾多蛋白因子的相互作用調(diào)控細胞凋亡，而在其中分別扮演啟動者和執(zhí)行者角色的Caspase-8 mRNA和Caspase-3 mRNA顯得尤為重要。5-Fu在誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)，其能誘導(dǎo)caspase-3、caspase-8的表達增加，從而增加肝癌細胞的凋亡。所以探討應(yīng)用5-Fu作用瘢痕疙瘩成纖維細胞后Caspase-3變化的研究，尋找瘢痕疙瘩形成可能的分子機制以及5-fu治療瘢痕疙瘩的機制是很有必要的。

1　材料和方法

1.1材料：DMEM培養(yǎng)基、小牛血清蛋白BSA（10g/ L,Gibco公司，美國）；Trans-well小室（聚碳酸脂膜8.0um,Chemicon公司 ，美國），CCK8試劑盒。瘢痕疙瘩標本可以選自我院患者，除外結(jié)締組織、心、肝、腎、肺等疾患，且6個月內(nèi)未使用類固醇激素類藥物、抗腫瘤藥物等，未曾接受放療。術(shù)中切取瘢痕疙瘩20例。同時收集其他整形患者的正常皮膚組織20例，入選標準同瘢痕疙瘩。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)：①將切取的得瘢痕疙瘩標本除減去表皮和皮下組織，切成1.0～2.0mm3的組織塊，采用組織塊培養(yǎng)法進行瘢痕疙瘩成纖維細胞(keloid fibroblasts KF)的原代培養(yǎng);②切取的正常皮膚組織，應(yīng)用酶消化法原代培養(yǎng)正常皮膚成纖維細胞( normal skin fibroblasts NSF)。③.中國科學(xué)院細胞庫購買正常一代皮膚細胞，進行傳代培養(yǎng)，以含20%胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml的DMEM培養(yǎng)液，與37°C，5%二氧化碳、飽和濕度下培養(yǎng)。

1.2.2免疫組化染色：①瘢痕疙瘩和正常皮膚組織：將標本置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，流水沖洗過夜。乙醇梯度脫水后，將標本置于透明二甲苯中浸泡,浸蠟后，進行包埋，切片機切片后用載玻片每個標本撈片4張，將石蠟切片烤干后，脫蠟、水化，用封閉通透液浸潤切片后，0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖溶液（pH 6.0）進行抗原修復(fù)暴露抗原決定簇，用山羊血清封閉非特異性蛋白，加Caspase-3一抗（1:500）約50μl，放入濕盒中置于4℃冰箱過夜。2張片加二抗孵育和顯色（普通免疫組化），切片復(fù)染、脫水、透明、封片后倒置顯微鏡觀察。另外2張片加FITC熒光二抗孵育顯色封閉后，熒光顯微鏡觀察。②瘢痕疙瘩和正常皮膚成纖維細胞接種于放置圓形載破片的24孔板，培養(yǎng)24h，PBS沖洗后，多聚甲醛固定，PBS沖洗后，TBS洗滌，PBS沖洗后，用山羊血清封閉非特異性蛋白 ，加Caspase-3一抗（1:500）約50 μl，放入濕盒中置于4℃冰箱過夜。

加二抗孵育和顯色 ，切片復(fù)染、脫水、透明、封片后倒置顯微鏡觀察。

1.2.3Western印跡檢測Caspase-3蛋白表達：取來自不同個體的第三代瘢痕疙瘩成纖維細胞（KF1、KF2）、中科院細胞庫第三代正常成纖維細胞（NSF1），非瘢痕疙瘩病人正常第三代皮膚成纖維細胞（NSF2），瘢痕疙瘩組織塊，正常皮膚組織塊，提取細胞總蛋白。瘢痕疙瘩第三代成纖維細胞，5-fu梯度(0.1mmol/L、0.01mmol/L、0.001mmol/L、0mmol/L)培養(yǎng)2h后，提取細胞總蛋白。BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。SDS-PAGE分離蛋 白后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶TBST溶液封閉過夜后洗膜，分別加入相應(yīng)的一抗Mouse anti-Caspase-3(1∶500稀釋)Mouse anti-GAPDH(1∶5 000稀釋)，再分別加入二抗 Rabbit anti-mouse IgGHRP(1∶5 000稀釋)，ECL法顯色后化學(xué)發(fā)光成像儀上顯影，顯影圖片掃描后保存圖像。

1.2.4CCK-8檢測細胞增值率：取對數(shù)生長期的瘢痕疙瘩成纖維細胞（細胞密度為1×104/孔），接種于96孔培養(yǎng)板中（100 μl/孔）中。待細胞長成單層后，更換培養(yǎng)液，將不同濃度的5-fu（0.1mmol/L、0.01mmol/L、0.001mmol/L、0mmol/L）加入新的培養(yǎng)液中，然后分別培養(yǎng)2h，再以10μl/孔向各孔中加入CCK-8試劑溶液，繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中保溫4h，終止培養(yǎng)，震蕩搖勻，在全自動定量酶標儀（Bio-Rad）上以450nm波長處測定各孔吸光度，結(jié)果以各組6孔吸光度的均值±標準差(xˉ±s)表示，吸光度值越高，表示細胞的增殖活性越強。

1.2.5Trans-well侵襲實驗，蘇木精-伊紅(HE)染：采用6孔Trans-well(8.0μm 濾膜微孔)系統(tǒng)。將含0.5%BSA濃度的培養(yǎng)基分為四組，分別加入5-fu(0.001mmol/L，0.01mmol/L，0.1mmol/L，0mmol/L)。用四組配好的培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為5×107個／L，分別取1ml細胞懸液加入小室內(nèi)，下室加入2ml含10%FBS 的培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)72h。用棉簽擦去小室上面細胞，固定，行HE染色：梯度酒精脫水，蘇木精染色約3min，鹽酸酒精分化，流水沖洗20min。分化后鏡檢。伊紅染色：0.1%～0.5%伊紅染液染色2min，70%乙醇5s。梯度酒精脫水，二甲苯透明2min，倒置顯微鏡觀察。

1.2.6統(tǒng)計學(xué)方法：本實驗結(jié)果均經(jīng)SPSS 15.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料用均數(shù)±標準差(xˉ±s)表示，采用t檢驗和方差分析 比組間差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　實驗結(jié)果

2.1瘢痕疙瘩和正常皮膚成纖維細胞通過免疫組化實驗，Caspase-3蛋白表達情況：可以看到瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞中均有Caspase-3蛋白的表達。如圖1。

圖1　瘢痕疙瘩成纖維細胞、正常皮膚成纖維細胞的Caspase-3免疫組織化學(xué)染色照片（400×）

2.2瘢痕疙瘩和正常皮膚組織通過免疫組化實驗，Caspase-3蛋白表達情況：可以看到瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常皮膚組織中均有Caspase-3蛋白的表達，如圖2。

圖2　瘢痕疙瘩成纖維細胞、正常皮膚成纖維細胞的Caspase-3免疫組織化學(xué)染色照片（100×）

2.3瘢痕疙瘩和正常皮膚組織通過熒光免疫組化實驗，Caspase-3蛋白表達情況：可以看到瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常皮膚組織中均有Caspase-3蛋白的表達，且瘢痕疙瘩組織中表達量要少于正常皮膚組織。如圖3。

圖3　通過熒光免疫化學(xué)染色顯示Caspase-3蛋白表達（100×）

2.4Western blot結(jié)果表明：兩組正常皮膚成纖維細胞中Caspase-3（32kd）、caspase-3(19kd)蛋白水平均明顯高于瘢痕疙瘩成纖維細胞(P＜0.05)，圖4。

2.5Western blot結(jié)果表明：正常皮膚組織中Caspase-3（32kd），caspase-3(19kd)蛋白水平均明顯高于瘢痕疙瘩組織(P＜0.05，圖5)。

圖4　Caspase-3蛋白在正常成纖維細胞與瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達情況

圖5　Caspase-3蛋白在正常成皮膚組織與瘢痕疙瘩組織中的表達情況

2.6Western blot結(jié)果表明：5-fu濃度梯度作用于瘢痕疙瘩成纖維細胞2h后，發(fā)現(xiàn)5-fu作用的細胞，Caspase-3蛋白表達較無5-fu作用的細胞表達明顯增加，同時通過圖可發(fā)現(xiàn)隨著5-fu濃度的增加，細胞Caspase-3蛋白表達也隨之增加，有一定的梯度依賴性。Caspase-3 蛋白的相對分子質(zhì)量為 32kd , 活化時降解成相對分子質(zhì)量為 19kd亞單位,檢測發(fā)現(xiàn)19kd亞單位表達逐漸增高, 說明 caspase-3 被活化 （P＜0.05，圖6）

圖6　5-fu濃度梯度作用于瘢痕疙瘩成纖維細胞2h后，Caspase-3蛋白表達，GAPDH是參考蛋白

2.7CCK8實驗檢測細胞增殖：5-fu濃度梯度作用于瘢痕疙瘩成纖維細胞2h后，隨著5-fu濃度的增高，吸光度明顯降低，表示抑制明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),圖7，提示5-fu可抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖。

圖7　5-fu濃度梯度作用于瘢痕疙瘩成纖維細胞2h后，瘢痕疙瘩成纖維細胞吸光度變化

2.8Trans-well侵襲(圖8、9)結(jié)果顯示隨著5-fu濃度降低，侵襲到下室的細胞數(shù)目較明顯減少(P＜0.05,圖8）。說明5-fu有抑制瘢痕疙瘩細胞侵襲的作用。

圖8　5-fu濃度梯度作用于瘢痕疙瘩成纖維細胞72h后，各組的侵襲情況

3　討論

成纖維細胞異常是瘢痕疙瘩形成的關(guān)鍵，caspase-3與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系，因此瘢痕疙瘩作為腫瘤相關(guān)性疾病，其形成和caspase-3的關(guān)系也值得深入研究。

Caspase-3是一種半胱天冬酶，其激活后可以抑制Survivin，引起的細胞核變化，在許多細胞凋亡途徑的最后一步中起到關(guān)鍵的作用，與細胞凋亡關(guān)系密切[2-4]。激活caspase-3細胞會通過旁分泌影響周圍caspase-3未激活的細胞。

Caspase-3在腫瘤的治療中，一直受到廣泛的關(guān)注，通過各種藥物促進caspase-3的表達，促進癌細胞凋亡，治療癌癥取得了令人滿意的效果，Parinaz Ahangar等在結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)從魚油中獲取的docosahexaenoic acid（DHA），可以有效激活直腸癌中的Caspase-3蛋白，從而促進直腸癌細胞中caspase-3的表達，癌細胞凋亡明顯增加[5]。Yuan-hua Liu等在對肺癌細胞，體外的研究中均發(fā)現(xiàn)，金絲桃苷可以通過 Caspase-3 and P53 信號通路，誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡同時抑制肺癌細胞的增值，在移植A549 lung cancer進入裸鼠中制作的xenograft tumor model（異種腫瘤移植模型），裸鼠腹腔注射金絲桃苷后，腫瘤體積較為注射前明顯縮小，同時血液中腫瘤細胞也同樣減少[6]。最近L Flanagan等學(xué)者在對結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)了一個有趣的結(jié)果，并且發(fā)表到了nature系列雜志中，研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌病人細胞中caspase-3水平越低，以5-fu為基礎(chǔ)的化療方案治療后，患者disease free survival （無病生存時間）將延長，5-fu可有效激活癌細胞中caspase-3蛋白的表達，從而促進細胞的凋亡，提高患者的生存率，但如果癌細胞caspase-3水平較高，以5-fu為基礎(chǔ)的化療方案效果較差[7]。同時M Oliver MetzigIn等在對結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，5-FU可以促進caspased蛋白的表達，導(dǎo)致癌細胞的凋亡，但癌細胞對5-fu的抵抗越來越嚴重，作者將pan-caspase 抑制劑作用于直腸癌細胞后，再用5-fu作用癌細胞，發(fā)現(xiàn)無論在體內(nèi)還是體外實驗中均發(fā)現(xiàn)取得良好的效果，抵抗明顯減少,再一次證明了caspase低表達是有利于5-fu促進細胞凋亡的[8]。本實驗通過免疫組織化學(xué)證明，caspase-3在瘢痕疙瘩、正常皮膚、瘢痕疙瘩成纖維細胞及正常皮膚成纖維細胞中存在，同時熒光免疫組織化學(xué)，發(fā)現(xiàn)caspase-3在瘢痕疙瘩中明顯低于正常皮膚組織。通過蛋白免疫印跡方法，從蛋白層面證明瘢痕疙瘩成纖維細胞中caspase-3與正常成纖維細胞存在差異，表達水平明顯低于正常皮膚成纖維細胞，并且在瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織同樣存在這種現(xiàn)象。說明caspase-3的激活，是治療瘢痕疙瘩重要靶點。

5-氟尿嘧啶是一種嘧啶類抗代謝藥，在國際范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用于注射治療瘢痕疙瘩。Eveline BIJLARD等[9]2015年發(fā)表的的系統(tǒng)性回顧中發(fā)現(xiàn)有45%～78%的患者在瘢痕疙瘩內(nèi)注射5-fu后取得了非常好的效果，只有一位病人被證明完全沒有效果。目前5-fu注射治療瘢痕疙瘩的機制，認為5-fu可抑制胸腺嘧啶核苷合成酶，阻斷尿嘧啶脫氧核苷轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶脫氧核苷，從而影響DNA的生物合成。新生血管對抑制細胞增殖藥物敏感性高，5-Fu可減少瘢痕疙瘩新生血管內(nèi)皮細胞增殖[10]。易彤波等[11]在研究中發(fā)現(xiàn)論5-fu通過caspase8信號傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡；5-fu誘導(dǎo)caspase8活性升高有濃度與時間依賴性。同時呂軍等[12]發(fā)現(xiàn)5-fu同樣通過caspase3誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，5-fu以時間和濃度的依賴方式促進caspase8的表達，也就是說5-fu可以促進腫瘤細胞的凋亡。本次實驗通5-fu梯度作用于瘢痕疙瘩成纖維細胞后，通過Western blot從蛋白層面證明5-fu同樣可以明顯提高瘢痕疙瘩成纖維細胞中caspase-3的表達，而且有一定的濃度依賴性，加速瘢痕疙瘩成纖維細胞的凋亡，糾正瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡減少異常，最終導(dǎo)致瘢痕疙瘩萎縮，變小。同時本次實驗通過CCK8、Transwells等實驗證明5-fu同樣可以抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增生，及侵襲等腫瘤特性，并且有一定的濃度依賴性。

綜上所述，瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡異常，而凋亡通路中關(guān)鍵的caspase3在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的低表達可能正是關(guān)鍵原因，5-fu在臨床上被廣泛應(yīng)用于瘢痕疙瘩的注射治療，并且被證明是有效的治療藥物，本次實驗從促進瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡的角度，解釋了5-fu治療瘢痕疙瘩的機制，同時證明了caspase-3蛋白在瘢痕疙瘩中低表達，導(dǎo)致瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡異常，為治療瘢痕疙瘩提供了新思路。

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編輯/張惠娟

The research of changes of the Caspase-3 after 5-FU act on keloid fibroblasts

WANG Peng1,2,GONG Jun-sheng2,LI Jin-fu1,ZHANG Bao-lin2,ZHENG Ruo-nan3
(1.The First Clinical Medical College of Shanxi Medical University of Shanxi Province,Taiyuan 030001,Shanxi,China; 2.Plastic Surgery,The First Hospital of Shanxi Medical University of Shanxi Province,Taiyuan 030001,Shanxi,China ;3.The Ninth Affiliated Hospital of Medical College, Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200011,China)

Objective To prove the existence of Caspase-3 gene in normal skin fibroblasts and keloid fibroblasts from the protein level. To study the effect of 5-FU(5-fluorouracil) concentration gradient on the expression of Caspase-3 protein and proliferation, migration and invasion of fibroblasts from keliod. Methods ①Immunohistochemistry and Western blot was used to detect caspase-3 protein expression in keloid and normal skin tissue, keloid fibroblast (KF)and normal skin fibroblasts ( NSF) ; ②5-FU (5-fluorouracil) concentration gradient effect of the keloid fibroblasts (KF).Western blot was used to detect the expression of caspase-3 protein expression.CCK-8 test measurement KF cells proliferation. Trans-wells chamber assay KF cells in migration and invasion ability. Results The keloid tissue, normal skin tissue, KF, NSF have the expression of Caspase-3 protein.The expression levels of caspase-3 protein were significant differences between KF and NSF (P＜0.05). The expression levels of Caspase-3 protein were significantly up-regulated after 2 hours of 5-FU act on KF, and the effects were concentration dependent(P ＜ 0.05);CCK-8 results showed that5-fu inhibited proliferative activity of KF, and the effects were concentration dependent(P＜0.05).Trans-wells results that 5-fu inhibited the migration and invasion activity of KF, and the effects were concentration dependen. Conclusion Caspase-3 is involved in the regulation of 5-FU induced KF apoptosis. 5-FU promotes Caspase-3 activity in a concentration dependent manner, and inhibits the tumor characteristics such as KF proliferation, invasion, migration and so on.

normal skin fibroblasts; keloid fibroblast; normal skin tissue; keloid; 5-fluorouracil; Caspase-3; Apoptosis

R619+.6

A

1008-6455（2016）11-0060-05

山西省科技發(fā)展計劃〈社會發(fā)展〉基金（20110313011-7）；山西省衛(wèi)生與計劃生育委員會基金（2014032）；山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院院基金（YC1415）

張寶林，男，科室主任、教授、主任醫(yī)師，中華醫(yī)學(xué)會整形分會全國委員、山西省醫(yī)師協(xié)會整形美容協(xié)會主委；山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院整形科，郵編：030001

2016-07-21

2016-10-25