□ 廖夏云　黃小云　馮麗敏　聶紅梅　池明亮　譚　強(qiáng)　廣西中醫(yī)藥大學(xué)

甘氨酸的抑菌作用分析

□ 廖夏云黃小云馮麗敏聶紅梅池明亮譚強(qiáng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)

甘氨酸可作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑和調(diào)味劑應(yīng)用于食品中，還具有一定的抑菌效果。本文通過研究甘氨酸在不同的條件下對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli，以下簡稱E.coli)和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，以下簡稱Sa）的抑菌活性，確定甘氨酸對(duì)這兩種食品中常見的致病菌的最佳的抑制條件。用微量肉湯稀釋法，測(cè)定在不同的濃度、不同pH值、不同時(shí)間的條件下，甘氨酸對(duì)E.coli和Sa的抑菌率，確定最佳的抑菌條件。通過單因素實(shí)驗(yàn)研究表明甘氨酸對(duì)E.coli的最佳抑菌條件：濃度為2.0%（g/mL)，pH為7，時(shí)間為20 h，抑菌率為100%。甘氨酸對(duì)Sa的最佳抑菌條件：濃度為2.5%（g/mL)，pH為5，時(shí)間為16 h，抑菌率為100%。甘氨酸對(duì)Sa和E.coli均具有良好的抑制作用，對(duì)E.coli的抑制效果更好。

甘氨酸，抑菌，微量肉湯稀釋法

甘氨酸（Glycine），又名氨基乙酸（C2H5N O2），在氨基酸中結(jié)構(gòu)最簡單，為人體非必需氨基酸。甘氨酸為白色單斜晶系的晶體或白色性結(jié)晶粉末，無臭、無毒、易溶于水[1]，甜度為蔗糖的0.8倍。大鼠口服半數(shù)致死量LD50是7.93 g/kg[2]。

目前，谷氨酸鈉（味精）和甘氨酸是全世界用量最大的調(diào)味品。甘氨酸因具有抗氧化作用而被添加到奶油、干酪、人造奶油中，能延長保質(zhì)期3～4倍，在火腿、臘腸、魚肉、花生醬等食品中添加1%～2%的甘氨酸能達(dá)到防臭和防腐的效果[3]，甘氨酸還用于配制運(yùn)動(dòng)員的營養(yǎng)飲料及其氨基酸食品，食用添加甘氨酸的食品對(duì)人體胃液酸度的調(diào)節(jié)、肌肉活力的提高有一定作用[4-7]。

我國允許使用的防腐劑有30多種，但安全無毒、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、抑菌廣泛并適用于各種食品的理想防腐劑仍然很少。甘氨酸來源豐富，對(duì)動(dòng)物的毒性很低，同時(shí)幾乎不對(duì)人體產(chǎn)生毒性，因此可作為一種非特異性防腐劑。石春芝 等[8]對(duì)甘氨酸的抑菌作用研究表明，3%的甘氨酸對(duì)堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌抑菌的作用非常明顯，甘氨酸與低級(jí)脂肪酸合并使用時(shí)對(duì)引起豆腐腐敗的微生物有顯著的抑菌作用。在席曉嵐 等人的研究報(bào)道中，用4-硝基苯甲醛與甘氨酸反應(yīng)合成Schiff堿，抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，該化合物對(duì)紅色毛癬菌、孢子絲菌、白色念珠菌均有不同程度的抑菌活性作用[9]。

如何既防止食品的腐敗變質(zhì)，又滿足消費(fèi)者對(duì)防腐劑安全無毒、經(jīng)濟(jì)有效的要求是目前研究的熱點(diǎn)，甘氨酸既具有防腐作用，又有營養(yǎng)和改善食品風(fēng)味等作用，這樣的天然防腐劑的研究和開發(fā)利用是食品科學(xué)工業(yè)的一個(gè)新方向。本文采用微量肉湯稀釋法，探究在不同濃度、pH值、時(shí)間的條件下甘氨酸對(duì)大腸桿菌（E.coli）和金黃色葡萄球菌（Sa）的最佳抑制條件，擴(kuò)展對(duì)甘氨酸抑菌作用的環(huán)境和條件的研究，進(jìn)一步了解甘氨酸的抑菌作用效果。

1　實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1材料與儀器

金黃色葡萄球菌CICC 10384，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供；大腸桿菌CICC 10419，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；M ueller-Hinton Broth，北京陸橋技術(shù)有限公司；瓊脂，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甘氨酸，分析級(jí)，含量不少于99.0%，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

752N紫外分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；JJ200電子天平，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；LRH-250-S恒溫培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；DHG-9503A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海柏欣儀器設(shè)備廠；VS-840K-U潔凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；YXQ-LS-50SII立式蒸汽壓力滅菌柜，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JB-3恒溫定時(shí)攪拌器，上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司；XW-80A旋渦混合器，江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；DK-98-11電子調(diào)溫萬用爐，天津市泰斯特儀器有限公司；TP8D300H移液槍，TO PSCIEN；Biotek Epoch全波長酶標(biāo)儀。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1溶液制備

配制濃度為0.2 g/m L的甘氨酸溶液，分別用醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH至4、5，用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH至6、7、8、9，放入冰箱保存，備用。

1.2.2培養(yǎng)基的制備

M HB固體培養(yǎng)基：稱取M HB培養(yǎng)基12.5 g，加入瓊脂7.5 g，蒸餾水500 m L，溶解，分裝，煮至清澈透明，121 ℃高壓滅菌15 m in，備用。

M HB液體培養(yǎng)基：稱取M HB培養(yǎng)基12.5 g，加入蒸餾水500 m L，溶解，分裝，煮至清澈透明，121 ℃高壓滅菌15 m in，備用。

1.3甘氨酸在不同濃度、pH值、時(shí)間下的抑菌作用

1.3.1濃度對(duì)抑菌效果的影響

取潔凈無菌的96孔板，8列（1～8）×12行（A～L），pH=7的甘氨酸儲(chǔ)備液和液體培養(yǎng)基、菌液。

96孔板1～8列加入順序見表1，A～D行加入E.coli菌液，E～H行加入Sa菌液，加入完畢后，將96孔板放入恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為37 ℃，14 h后取出，用酶標(biāo)儀測(cè)定O D620值，計(jì)算抑菌率。

1.5.2pH值對(duì)抑菌效果的影響

以1.5.1中對(duì)抑菌效果顯著的最低濃度為最佳抑菌濃度，參照表1在96孔板中加入pH值分別為5、6、7、8、9的該濃度甘氨酸儲(chǔ)備液，加入相應(yīng)的無菌水、液體培養(yǎng)基和菌液，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h后，取出，用酶標(biāo)儀測(cè)定O D620值，計(jì)算抑菌率。

1.5.3抑菌時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響

將1.5.2中抑菌效果最佳的處理再放回37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 h測(cè)定O D620值，即記錄14、16、18、20 h和22 h時(shí)，在最佳抑菌濃度、最佳抑菌pH值條件下，甘氨酸的抑菌率隨時(shí)間的變化情況。

1.5.4抑菌率計(jì)算方法

抑菌率按照公式（1）計(jì)算：

當(dāng)實(shí)驗(yàn)O D值大于陽性對(duì)照O D值時(shí)，抑菌率記為0.0%；當(dāng)實(shí)驗(yàn)O D值小于陰性對(duì)照O D值時(shí)，抑菌率記為100.0%。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1不同濃度甘氨酸的抑菌效果

濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的甘氨酸對(duì)E.coli的抑菌率分別為0.0%、37.4%、76.1%、100.0%和100.0%，如圖1所示。由圖1可知，隨著甘氨酸濃度的增加，對(duì)E.coli的抑制作用增強(qiáng)，甘氨酸濃度到達(dá)2.0%后，甘氨酸對(duì)E.coli的抑菌率達(dá)100%。甘氨酸濃度為0.5%時(shí)，對(duì)E.coli沒有抑菌作用，甘氨酸屬于氨基酸，是E.coli良好的營養(yǎng)物質(zhì)，此時(shí)E.coli將甘氨酸作為營養(yǎng)物質(zhì)吸收；濃度為1.0%時(shí)，甘氨酸開始抑制E.coli，當(dāng)濃度到2.0%時(shí)，抑菌率為100.0%，抑菌效果最佳，濃度升高到2.5%，抑菌率同樣為100%，說明濃度達(dá)到2.0%后甘氨酸對(duì)E.coli都有很好的抑制作用。

表1　甘氨酸的抑菌濃度

圖1　pH為7的甘氨酸對(duì)E.coli的抑制作用

測(cè)定濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%的甘氨酸對(duì)Sa的抑制作用，得到抑菌率分別為0.0%、0.0%、2.6%、55.9%、100.0%、100.0%，如圖2所示。由圖2可知，隨著甘氨酸濃度的增加，對(duì)Sa的抑制作用增強(qiáng)，當(dāng)甘氨酸濃度達(dá)到2.5%時(shí)，甘氨酸對(duì)Sa的抑菌率達(dá)到100%。甘氨酸濃度為0.5%、1.0%時(shí)，對(duì)Sa沒有抑菌作用，此時(shí)Sa以甘氨酸為營養(yǎng)物質(zhì)；濃度為1.5%時(shí)，甘氨酸開始對(duì)Sa產(chǎn)生抑制作用，當(dāng)濃度到2.5%時(shí)，抑菌率為100.0%，抑菌效果最佳，濃度升高到3.0%，抑菌率同樣為100.0%，說明當(dāng)濃度到達(dá)2.5%時(shí)，甘氨酸對(duì)Sa有很好的抑制作用。

圖2　pH為7甘氨酸對(duì)Sa的抑制作用

甘氨酸可作為微生物的良好氮源，對(duì)E.coli和Sa是營養(yǎng)物質(zhì)，因此甘氨酸濃度過低則無法很好地抑制E.coli和Sa的生長，濃度過高則成本增加，并且對(duì)于氨基酸含量豐富的食品，添加的甘氨酸過量還可能會(huì)導(dǎo)致人體對(duì)營養(yǎng)吸收不平衡，因此甘氨酸對(duì)E.coli的最佳抑制濃度應(yīng)選擇2.0%，對(duì)Sa的最佳抑制濃度應(yīng)選擇2.5%。

2 2 不同pH值甘氨酸的抑菌效果

設(shè)置濃度為2.0%，pH值分別為5、6、7、8和9的甘氨酸溶液，測(cè)定其對(duì)E.coli的抑制作用效果，抑菌率分別為95.2%、98.1%、100.0%、100.0%、96.7%，如圖3所示。由圖3可知甘氨酸在pH 5～9范圍內(nèi)對(duì)E.coli都有良好的抑菌效果，且抑菌率差異不明顯，表明甘氨酸在pH 5～9的范圍內(nèi)都有抑菌作用。

圖3　2.0%甘氨酸對(duì)E.coli的抑制作用

設(shè)置濃度為2.5%，pH值分別為5、6、7、8和9的甘氨酸溶液，測(cè)定其對(duì)Sa的抑制作用效果，抑菌率分別為100.0%、92.4%、98.1%、97.0%、86.9%，如圖4所示。由圖4可知，甘氨酸在pH 5～9的范圍內(nèi)對(duì)Sa都有較好的抑菌效果，除pH=9的甘氨酸外，其他甘氨酸抑菌均抑菌率超過90.0%，且差異不明顯，表明甘氨酸在pH 5～8的范圍內(nèi)對(duì)Sa有良好抑菌作用，pH=9的甘氨酸抑菌效果稍差。

圖4　2.5%甘氨酸對(duì)Sa的抑制作用

甘氨酸在pH值為5～9的范圍內(nèi)對(duì)E.coli的抑制率均達(dá)到95.0%以上，對(duì)Sa的抑制率均達(dá)到85.0%以上，表明甘氨酸在較寬的pH值范圍內(nèi)對(duì)E.coli和Sa有廣泛的抑制作用。由圖3可知，甘氨酸在pH值為7或8時(shí)，對(duì)E.coli的抑菌效果最佳，由圖4可知甘氨酸在pH為7時(shí)抑菌率為98.1%，pH值為8時(shí)為97.0%，pH為7比pH為8抑菌更好，綜合考慮，甘氨酸對(duì)E.coli的最佳抑菌的pH應(yīng)為7。由圖4可知甘氨酸的pH值為5時(shí)對(duì)Sa的抑菌效果最佳，因此甘氨酸對(duì)Sa的最佳抑菌pH為5。

2.3不同時(shí)間甘氨酸的抑菌效果

選擇甘氨酸濃度為2.0%，pH值為7，設(shè)置14、16、18、20 h和22 h 5個(gè)不同的培養(yǎng)時(shí)間，測(cè)定甘氨酸對(duì)E.coli的抑制效果，得到的抑菌率分別為100.0%、95.4%、100.0%、100.0%、98.3%，如圖5所示。由圖5可知，甘氨酸對(duì)E.coli的抑制作用隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，甘氨酸對(duì)E.coli的抑菌率沒有明顯變化，即甘氨酸在5個(gè)培養(yǎng)時(shí)間里對(duì)E.coli都有良好的抑制效果，且5個(gè)時(shí)間里的抑菌率差異不明顯，表明甘氨酸在14～22 h內(nèi)對(duì)E.coli有良好的抑菌效果。

圖5　濃度為2.0%，pH值為7的甘氨酸對(duì)E.coli的抑制作用

選擇濃度為2.5%，pH值為5的甘氨酸，設(shè)置14、16、18、20 h和22 h 5個(gè)不同的培養(yǎng)時(shí)間，測(cè)定甘氨酸對(duì)Sa的抑制效果，得到的抑菌率分別為100.0%、100.0%、96.4%、91.1%、92.0%，如圖6所示。由圖6可知，甘氨酸對(duì)Sa的抑制作用隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加逐漸減弱，當(dāng)時(shí)間到16 h時(shí)，抑菌率為100.0%，16 h后抑菌率降低，說明培養(yǎng)時(shí)間在16 h內(nèi)甘氨酸對(duì)Sa的抑制效果很好。甘氨酸在設(shè)置的5個(gè)培養(yǎng)時(shí)間里對(duì)Sa都有良好的抑制效果，并且五個(gè)時(shí)間里的抑菌率差異不明顯，表明甘氨酸在14～16 h內(nèi)對(duì)Sa有良好的抑菌效果。

圖6　濃度為2.5%，pH值為5的甘氨酸對(duì)Sa的抑制作用

甘氨酸在較長的時(shí)間內(nèi)對(duì)E.coli和Sa的抑制作用達(dá)到90.0%以上，呈現(xiàn)出較好的抑菌效果，表明甘氨酸能在較長的時(shí)間范圍內(nèi)起到良好的抑菌作用。

3　結(jié)論

通過測(cè)定不同濃度、pH值和時(shí)間的甘氨酸對(duì)E.coli和Sa這兩種細(xì)菌的抑菌率，確定甘氨酸濃度為2.0%，pH為7，培養(yǎng)14～22 h時(shí)，對(duì)E.coli的抑制作用最佳；甘氨酸濃度為2.5%，pH值為5，培養(yǎng)時(shí)間在16 h內(nèi)對(duì)Sa的抑制最佳。甘氨酸對(duì)E.coli和Sa都有較好的抑制作用。

對(duì)比不同濃度甘氨酸對(duì)E.coli和Sa的抑制作用，較低的甘氨酸濃度即可抑制E.coli的生長繁殖，說明E.coli對(duì)甘氨酸更為敏感。對(duì)比甘氨酸在pH值在5～9的范圍內(nèi)對(duì)E.coli和Sa的抑制作用，pH的變化對(duì)E.coli和Sa的抑制效果影響不大。對(duì)比培養(yǎng)時(shí)間對(duì)E.coli和Sa的抑制作用，在22h內(nèi)甘氨酸對(duì)E.coli的抑制效果變化較小，在16 h后對(duì)Sa的抑制作用隨著時(shí)間的延長而減弱，說明甘氨酸對(duì)E.coli的抑制時(shí)間更為長久。

4　結(jié)語

大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，甘氨酸對(duì)這兩種細(xì)菌都有良好的抑制作用，并在較寬的pH值范圍和時(shí)間范圍內(nèi)其抑菌率沒有顯著差異。

甘氨酸可作為一種安全無害的防腐劑應(yīng)用于易被E.coli和Sa污染的食品中，如米粉，糕點(diǎn)。甘氨酸既具有防腐作用，又具有營養(yǎng)和改善食品風(fēng)味等作用，其研究和開發(fā)利用有著廣闊的前景。

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中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室子課題（編號(hào)：J16093）。

廖夏云（1985-）,女,博士。研究方向：食品質(zhì)量與安全。