□ 陳志強　阿依古麗　宋　鈺　張　穎　吐魯番市質(zhì)量與計量檢測所

葡萄干中5-羥甲基糠醛的液相色譜測定

□ 陳志強阿依古麗宋鈺張穎吐魯番市質(zhì)量與計量檢測所

闡述葡萄干中羥甲基糠醛檢驗方法和條件，并結(jié)合實驗確定葡萄干中羥甲基糠醛測定的提取凈化條件和色譜檢測條件。本研究針對樣品的前處理方法、檢測和確證方法的選擇和優(yōu)化，建立適用于葡萄干樣品的前處理方法、儀器測定方法和確證方法。

葡萄干；5-羥甲基糠醛；液相色譜；儀器條件

5-羥甲基糠醛（5-Hydroxym ethyl furfural，5-HM F）是葡萄糖、果糖等單糖化合物在高溫或弱酸等條件下脫水產(chǎn)生的醛類化合物，具有高活性的呋喃環(huán)、芳醇、芳醛結(jié)構(gòu)，其衍生物被廣泛的用作真菌劑、腐蝕抑制劑、香料，并作為一種有效防治神經(jīng)退行性疾病、認知損害和抗心肌缺血的心血管病藥物，受到研究人員的廣泛關(guān)注。食品工業(yè)中，美拉德反應(yīng)和焦糖化反應(yīng)也可產(chǎn)生羥甲基糠醛，但具有一定毒副作用，對眼、黏膜、皮膚有刺激性，過量食用會引起中毒，造成動物橫紋肌麻痹和內(nèi)臟損害。

5-羥甲基糠醛的含量是衡量葡萄干品質(zhì)的重要指標之一，吐魯番是我國最大的葡萄干加工和出口基地，檢測5-羥甲基糠醛的含量對于提升葡萄干品質(zhì)，提升市場競爭力具有積極的意義。

1　方法

5-羥甲基糠醛的檢測方法通常有控制溶液的顏色、紫外法、雙波長法、雜質(zhì)對照法等。5-羥甲基糠醛的最大吸收波長為284 nm，該處干擾較少，紫外法常可作為5-羥甲基糠醛檢測的首選方法。如中國藥典2000、BP2000、USP27和日本藥局方中納入的葡萄糖注射液，均采用紫外法測定5-羥甲基糠醛含量。如果樣品中的雜質(zhì)在284 nm有明顯的吸收，則會干擾5-羥甲基糠醛的檢測，應(yīng)采用HPLC法代替。本文主要探討HPLC法的條件。1.1 提取凈化

葡萄干及其制品中主要含有糖、有機酸、色素、植物蛋白等物質(zhì)，因其含糖量高需對樣品進行稀釋，5-羥甲基糠醛極性大，易溶于水和甲醇，故采用水稀釋樣品。直接稀釋進樣有機酸、色素干擾大，需凈化待測樣品。根據(jù)葡萄干的特點和5-羥甲基糠醛的化學(xué)性質(zhì)，Bond Elut EN V、HLB等固相萃取柱在一定條件下對葡萄干中的羥甲基糠醛有較好的吸附，因此進一步研究這些固相萃取柱在葡萄干中5-羥甲基糠醛殘留檢測中的應(yīng)用。實驗發(fā)現(xiàn)，Bond Elut EN V 固相萃取柱可重復(fù)利用，且上樣后流速較HLB小柱快，故選用Bond Elut EN V小柱作為凈化柱。

選用Bond Elut EN V固相萃取柱（500 m g，6 m L），研究固相萃取凈化時的上樣量、淋洗、洗脫條件。固相萃取柱用5 m L甲醇，10 m L水活化。

1.2樣品前處理

稱取剪碎的葡萄干10 g加水浸泡1～2 h，放入高速組織搗碎機中，加少量水搗碎，全部轉(zhuǎn)移至100 m L容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻、過濾，濾液備用。取濾液直接上樣，用水淋洗，去除糖和部分有機酸。

1.3上樣量

選擇葡萄干濾液為檢測樣品，分別量取3.0、4.0、5.0、6.0 m L各3份，添加標準溶液100 μ g，上樣后用水淋洗樣品管和固相萃取柱，用30 m L 20%甲醇水溶液洗脫，洗脫液用水稀釋定容至50 m L，進樣檢測，計算加標回收率，見表1。稱樣量為6.0 m L時，回收率明顯低于其他稱樣量的回收率，這是由于萃取柱的載樣量有限，稱樣大時易造成萃取柱過載，從而使回收率偏低，為保證測定結(jié)果的準確性，確定樣品稱樣量為 5.0 m L。

表1　不同樣品量加標回收率

1.4淋洗及洗脫條件

選擇水作為淋洗劑，結(jié)果表明，5 m L水基本能把固相萃取柱上的糖和極性大的物質(zhì)完全淋洗下來。分別研究體積比為10%、20%、30%的甲醇-水作為洗脫劑的洗脫效果，結(jié)果表明，三種比例的洗脫劑用量20 m L時，均能將5-羥甲基糠醛從SPE小柱上洗脫下來，其中30%甲醇-水洗脫雜質(zhì)較多，10%和20%甲醇-水洗脫雜質(zhì)少，凈化效果較好。但10%甲醇-水洗脫時回收率較低，通過增大洗脫劑用量可提高回收率，說明10%甲醇-水作為洗脫劑時用量大，綜合考慮選擇20%甲醇-水作為洗脫劑。

1.5洗脫條件的優(yōu)化

吸取5 m L葡萄干濾液樣品6份，分別加入100 μ g標準品，平行處理6個固相萃取柱，按照前述活化、淋洗，分別用10、15、20、25、30 m L和35m L 20%甲醇-水洗脫，制作洗脫曲線。結(jié)果表明洗脫劑體積為20 m L時，回收率大于99%，基本能洗脫完全，洗脫曲線如圖1所示，為保證不同樣品均能洗脫完全，最終確定洗脫體積為25 m L。

圖1　Bond Elut ENV 柱上羥甲基糠醛的洗脫曲線

1.6最終確定的提取凈化方法

吸取5 m L葡萄干濾液于50 m L離心管中，加入20 m L水，充分溶解混勻，取活化好的聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物固相萃取柱（Bond Elut EN V），將樣品溶液全部上樣，用5 m L水洗滌樣品管，洗滌液也上柱凈化，再用5 m L水淋洗固相萃取柱，最后用25 m L甲醇-水洗脫，整個固相萃取過程保持流速2～3 m L/m in，收集洗脫液，用水定容至50 m L，過0.2 μ m微孔濾膜，供高效液相色譜法檢測。

2　高效液相色譜條件

主要研究色譜柱和流動相，在色譜柱選擇時，流動相為乙腈-水（10∶90，V/V）比較BEH C18、HSS T3色譜柱，發(fā)現(xiàn)使用BEH C18色譜柱時，5-羥甲基糠醛出峰過早，在1m in左右出峰，調(diào)整流動相比例仍無明顯改變。而HSS T3色譜柱對極性較大的羥甲基糠醛色譜保留效果較好，所以選擇HSS T3色譜柱進行下一步研究。研究流動相時，比較甲醇-水（8∶92，V/V）、乙腈-水（8∶92，V/V）的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選用甲醇做流動相時，目標物與雜質(zhì)分離較差，同時目標物出峰較晚，分析時間延長；而選用乙腈做流動相時，分離效果明顯變好且分析時間縮短，故選定水和乙腈為流動相。

最終確定的液相色譜條件如下。色譜柱：W aters ACQ U ITY U PLC H SS T3柱（100 m m×2.1 m m，1.8 μ m）；流動相：乙腈-水（8∶92，V/V）等度洗脫，使用前過濾并脫氣；柱溫：35 ℃；樣品室溫度：20 ℃；檢測波長：285 nm；流速：0.3 m L/m in；進樣量：10 μ L。

根據(jù)樣液中羥甲基糠醛的含量情況，選定與樣液濃度相近的標準工作溶液，標準工作溶液和樣液中羥甲基糠醛的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測線性范圍內(nèi)，如果樣液中羥甲基糠醛的含量超出檢測的線性范圍，則稀釋后再進樣。對標準工作溶液和樣液等體積分時段參插進樣測定，以保留時間定性，外標法定量，在給定的液相色譜熒光檢測條件下，羥甲基糠醛標準溶液的液相色譜圖如圖2所示。

3　線性與測定低限

配制濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 μ g/m L和10.0 μ g/m L的5-羥甲基糠醛系列標準溶液，按方法規(guī)定的色譜條件進樣檢測，并以標準濃度（X，μ g/m L）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標作圖，同時用最小二乘法進行線性回歸，得標準曲線回歸方程為Y=230 00X+2 778.4，線性相關(guān)系數(shù)R2為1.000 0，標準曲線如圖3所示，線性關(guān)系良好。

圖2　羥甲基糠醛標準溶液的超高效液相色譜圖（4 μg/mL）

圖3　標準曲線

表2　羥甲基糠醛的加標回收率和精密度（n=6）

4　回收率及精密度

本方法采用添加回收的方法，對葡萄干樣品按表2規(guī)定的水平進行添加，每個樣品添加3個水平，每個添加水平重復(fù)6次，按規(guī)定的高效液相色譜法進行測定，本方法回收率及室內(nèi)精密度見表2。

5　結(jié)語

目前國際上對果汁中5-羥甲基糠醛的含量無統(tǒng)一的限量規(guī)定，歐盟果蔬汁飲料工業(yè)協(xié)會（AIJN）規(guī)定果汁中5-羥甲基糠醛的最大殘留限量為20 m g/ L；國際果汁加工聯(lián)合會（IFFJP）建議果汁中5-羥甲基糠醛的最大殘留限量為5～10 m g/L，濃縮果汁中最大殘留限量為25 m g/L。本檢測方法標準中5-羥甲基糠醛的測定低限能達到1.0 m g/ kg，滿足國內(nèi)外相關(guān)限量要求，可作為葡萄干中5-羥甲基糠醛的檢測依據(jù)。