□ 常立娟　青海省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所

啤酒有害菌檢驗培養(yǎng)基的優(yōu)化

□ 常立娟青海省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所

現(xiàn)階段，我國啤酒廠主要利用培養(yǎng)基檢測技術(shù)檢測啤酒有害菌，該技術(shù)投資少、便于觀察且簡單易行，在啤酒廠中廣泛使用。但該技術(shù)所使用的N BB培養(yǎng)基、M RS培養(yǎng)基均依靠進口，這與我國啤酒大國的地位不相匹配。同時，我國啤酒較淡爽、麥汁濃度低，不可避免地導致我國啤酒有害菌與國外啤酒存在一定差異，對有害菌檢驗培養(yǎng)基的要求也略有不同。在積極構(gòu)建和諧社會的今天，探究啤酒有害菌檢驗培養(yǎng)基的優(yōu)化策略，具有重要現(xiàn)實意義。

試驗部分

儀器與試劑

儀器：英國O XO ID公司生產(chǎn)的厭氧產(chǎn)氣袋、厭氧指示片；生化培養(yǎng)箱；顯微鏡；厭氧罐；pH計等。

試劑：英國O XO ID公司生產(chǎn)的M RS培養(yǎng)基；德國企業(yè)生產(chǎn)的N BB培養(yǎng)基；中國食品發(fā)酵研究院提供的麥根浸出物；北京索萊寶企業(yè)提供的葉酸和精氨酸；受到污染的啤酒。

試驗方法

1 配制培養(yǎng)基

嚴格按照說明書方法配制M RS培養(yǎng)基和N BB培養(yǎng)基。

2 菌種分離與培養(yǎng)

隨機選取某廠生產(chǎn)的受到污染的啤酒，將酒樣涂布到培養(yǎng)基上，選擇單菌落，劃線分離純化得到2株乳酸桿菌。稀釋被污染的酒樣，并將其涂布到培養(yǎng)基上，在28 ℃的厭氧罐中培養(yǎng)5 d。

3 培養(yǎng)基成分的完善

通過單因素試驗方法，以葉酸、精氨酸、麥根浸出物的優(yōu)化為因素水平。水平①：麥根浸出物加量為10 m g/L，精氨酸為0.5 g/L，葉酸為20 m L/L。水平②：麥根浸出物加量為20 m g/L，精氨酸為0.8 g/L，葉酸為60 m L/L。水平③：麥根浸出物加量為30 m g/L，精氨酸為1 g/L，葉酸為100 m L/L。水平④：麥根浸出物加量為40 m g/L，精氨酸為1.3 g/L，葉酸為140 m L/L。水平⑤：麥根浸出物加量為50 m g/L，精氨酸為1.5 g/L，葉酸為180 m L/L。

4 培養(yǎng)基成分用量的優(yōu)化

選擇正交試驗的方法優(yōu)化麥根浸出物、精氨酸和葉酸的添加量。在M RS培養(yǎng)基用量的優(yōu)化中，水平①：麥根浸出物加量為20 m g/L，精氨酸為0.5 g/L，葉酸為140 m L/L。水平②：麥根浸出物加量為30 m g/L，精氨酸為0.8 g/L，葉酸為180 m L/L。水平③：麥根浸出物加量為40 m g/L，精氨酸為1 g/L，葉酸為220 m L/L。在N BB培養(yǎng)基用量的優(yōu)化中，水平①：麥根浸出物加量為20 m g/L，精氨酸為0.5 g/L，葉酸為60 m l/L。水平②：麥根浸出物加量

為30 m g/L，精氨酸為0.8 g/L，葉酸為100 m L/L。水平③：麥根浸出物加量為40 m g/L，精氨酸為1 g/L，葉酸為140 m L/L。

檢出方法

表1　MRS培養(yǎng)基生長因子優(yōu)化正交試驗

表2　NBB培養(yǎng)基生長因子優(yōu)化正交試驗

通過革蘭染色檢測，革蘭陽性菌為紫色，革蘭陰性菌為紅色。通過過氧化氫酶試驗檢測，有氣泡則為過氧化氫酶陽性，無氣泡則為過氧化氫酶陰性。通過顯微鏡觀測，結(jié)合顯微鏡觀察與上述檢測結(jié)果，判定有害菌種類。

結(jié)果與討論

培養(yǎng)基成分的完善

按照1.2.3設計的因素水平進行培養(yǎng)基單因素試驗，培養(yǎng)5 d。結(jié)果表明，不同劑量的麥根浸出物均出現(xiàn)2種菌落，30 m g/L水平時，菌落最多、桿菌長勢最好，10m g/L時，菌落最少。0.8 g/L精氨酸水平時，菌落最多。180 m g/L葉酸水平菌落最多、效果最好。綜上可知，30 m g/L麥根浸出物+0.8 m g/L精氨酸+180 m g/L葉酸為M RS培養(yǎng)基最佳添加量。不同劑量的麥根浸出物均出現(xiàn)1種菌落，30 m g/L水平時，菌落最多、桿菌長勢最好。0.8 g/L精氨酸水平時，菌落最多。180 m g/L水平的葉酸菌落最多、效果最好。綜上可知，30 m g/L麥根浸出物+0.8 m g/L精氨酸+180 m g/L葉酸為N BB培養(yǎng)基最佳添加量。兩者優(yōu)化結(jié)果相同。

培養(yǎng)基成分用量的完善

按照1.2.4的因素水平進行正交設計，分別優(yōu)化M RS培養(yǎng)基、N BB培養(yǎng)基中麥根浸出物、精氨酸以及葉酸的添加量。結(jié)果顯示，在M RS培養(yǎng)基中，精氨酸影響最大、葉酸其次、麥根浸出物最小。提示與麥根浸出物、葉酸相比，精氨酸更易于促進有害菌生長。雖然麥根浸出物均會促進有害菌生長，但不如另外兩種因素影響大，20 m g/L麥根浸出物+0.8 g/L精氨酸+220 m g/L葉酸組合最佳。在N BB培養(yǎng)基中，精氨酸影響最大、葉酸、麥根浸出物影響相當。該研究再一次證實精氨酸對有害菌生長的促進作用。葉酸和麥根浸出物兩者也對有害菌生長起到促進作用。其中，50 m g/L麥根浸出物+0.8 g/L精氨酸+140 m g/L葉酸組合最佳。

驗證試驗

結(jié)合上述結(jié)果得出的兩種最佳組合方式，分別以全新培養(yǎng)基為對照組，培養(yǎng)5 d后進行菌落總數(shù)驗證試驗。①M RS培養(yǎng)基中，20 m g/L麥根浸出物+0.8 g/L精氨酸+220 m g/L葉酸組合方式形成菌落總數(shù)為1.7×103CFU/m L，對照組中1.4×103CFU/m L，經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基中的菌落總數(shù)明顯要多。M RS培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果為：20 m g/L麥根浸出物+0.8 g/L精氨酸+220 m g/L葉酸。具體情況見表1。②N BB培養(yǎng)基中，50m g/L麥根浸出物+0.8g/L精氨酸+140m g/L葉酸組合方式形成菌落總數(shù)為5.9×102CFU/m L，對照組中4.3×102CFU/m L，經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基中的菌落總數(shù)明顯要多。N BB培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果為：50 m g/L麥根浸出物+0.8 g/L精氨酸+140 m g/L葉酸。具體情況見表2。

結(jié)語

如果在M RS培養(yǎng)基中單獨添加三種物質(zhì)，麥根浸出物的最佳添加量為30 m g/L，精氨酸的最佳添加量為0.8 g/L，葉酸的最佳添加量為180 m g/L。如果在N BB培養(yǎng)基中單獨添加三種物質(zhì)，麥根浸出物的最佳添加量為30 m g/L，精氨酸的最佳添加量為0.8 g/ L，葉酸的最佳添加量為100 m g/L。三種營養(yǎng)因子優(yōu)化配比試驗中，M RS培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果為20 m g/L麥根浸出物+0.8 g/L精氨酸+220 m g/L葉酸。N BB培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果為50 m g/L麥根浸出物+0.8 g/L精氨酸+140 m g/L葉酸。與N BB培養(yǎng)基相比，M RS培養(yǎng)基對乳酸桿菌的選擇性更強，且檢測能力更佳，M RS培養(yǎng)基更適合有害菌檢測。精氨酸能極大促進乳酸桿菌等啤酒有害菌的生長，能有效促進有害菌生長繁殖，這為今后的有害菌檢測研究指明方向。