劉國(guó)強(qiáng), 劉 銳, 魏春雷, 張春華

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基于線(xiàn)粒體16S rRNA基因序列對(duì)3種珍珠貝的鑒定

劉國(guó)強(qiáng)1, 劉 銳2, 魏春雷1, 張春華1

(1. 國(guó)家海洋局北海海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站, 廣西北海 536000; 2. 河北省邯鄲市環(huán)境保護(hù)局, 河北邯鄲 056002)

傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定主要依賴(lài)于分類(lèi)者的經(jīng)驗(yàn)和水平, 容易產(chǎn)生分類(lèi)錯(cuò)誤。為提高物種鑒定的準(zhǔn)確性, 作者采用形態(tài)學(xué)與線(xiàn)粒體16S rRNA基因序列分析相結(jié)合的方式對(duì)廣西北海潿洲島采獲的3種珍珠貝進(jìn)行了鑒定。研究結(jié)果表明, 基于形態(tài)學(xué)可將3種珍珠貝分別鑒定為企鵝珍珠貝()、寬珍珠貝()和中國(guó)珍珠貝(), 但基于16S rRNA基因序列, 形態(tài)學(xué)鑒定為的標(biāo)本應(yīng)為.。和.是兩個(gè)完全獨(dú)立的種, 并非為同物異名。珍珠貝屬16S rRNA基因序列的種間遺傳距離明顯大于種內(nèi)遺傳距離, 適宜作為該屬種類(lèi)鑒定的分子標(biāo)記。在基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)中, 相同種類(lèi)的不同個(gè)體均形成單系群, 并獲得很高的支持率。分布于中國(guó)沿海的珍珠貝屬種類(lèi)應(yīng)包括, 是否有的分布尚需進(jìn)一步證實(shí)。

珍珠貝屬(); 16S rRNA基因; 種類(lèi)鑒定

珍珠貝屬()隸屬珍珠貝目(Pterioida)、珍珠貝科(Pteriidae), 是一類(lèi)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的貝類(lèi), 中國(guó)沿海共分布有12種[1–2]。其中, 寬珍珠貝起初被王禎瑞[3]定為., 但隨后又將.視為的同物異名[2], 此后國(guó)內(nèi)許多學(xué)者[4–6]沿用了這一種名。而T?mkin[7]認(rèn)為.和為兩個(gè)完全獨(dú)立的種, 且能通過(guò)DNA序列加以區(qū)分。因此, 在中國(guó)分布的究竟是.還是, 或是兩者兼而有之, 還未有相關(guān)研究的證實(shí)。

當(dāng)前, 貝殼形態(tài)特征仍然是貝類(lèi)分類(lèi)的主要依據(jù)。然而, 貝殼形態(tài)會(huì)隨環(huán)境變化產(chǎn)生差異, 許多種內(nèi)變異很大或一些種間差異并不明顯, 進(jìn)而導(dǎo)致標(biāo)本難以準(zhǔn)確鑒定[8]。分子生物學(xué)技術(shù)不僅廣泛應(yīng)用于貝類(lèi)的系統(tǒng)發(fā)育研究[7, 9-10], 在種類(lèi)鑒定和區(qū)分上也具有重要應(yīng)用價(jià)值[8, 10-12]。作者以采自廣西潿洲島海域的3種珍珠貝屬種類(lèi)為材料, 通過(guò)測(cè)定其線(xiàn)粒體16S rRNA基因序列對(duì)其進(jìn)行鑒定, 并結(jié)合GenBank中下載的其他珍珠貝屬種類(lèi)序列分析了該屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系, 以期為其他研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

作者所用的中國(guó)珍珠貝()、.和企鵝珍珠貝() (圖1)采自廣西潿洲島海域, 樣品數(shù)分別為2、1和3個(gè)。樣品冷凍保存帶回實(shí)驗(yàn)室后, 取其腹足肌保存于無(wú)水乙醇中, –20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

采用CTAB法提取樣品總DNA[13], 使用引物16sar-L(5′-CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3′)和16sbr-H(5′-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3′)[14]擴(kuò)增線(xiàn)粒體16S rRNA基因片段。

PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL, 其中:10×buffer 5 μL, dNTP 200 μmol/L, 引物各0.3 μmol/L, Taq酶1.5 U, 模板DNA 1 μL, 加去離子水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性2 min; 94℃變性30 s, 52℃退火30 s, 72℃延伸60 s, 共35個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收純化, 然后進(jìn)行雙向測(cè)序, 測(cè)序引物與擴(kuò)增引物相同。

1.3 數(shù)據(jù)處理和系統(tǒng)樹(shù)構(gòu)建

采用Bioedit 7.0.1 軟件進(jìn)行序列拼接, 并輔以手工校對(duì)。合并從GenBank 下載的數(shù)據(jù), 利用ClustalX1.8.3 軟件對(duì)序列進(jìn)行多重比對(duì)。采用MEGA 5.10分析序列的堿基組成以及基于Kimura雙參數(shù)模型(Kimura 2-parameter, K2P)的遺傳距離, 并利用該軟件中的鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 可靠性經(jīng)過(guò)1 000次自展(bootstrap)檢驗(yàn)。文中僅在系統(tǒng)樹(shù)上標(biāo)注出大于50%的自展支持率。

a–b. 中國(guó)珍珠貝; c–d..; e–f. 企鵝珍珠貝; 比例尺=1 cm

a–b.; c–d.; e–f.; scale bar 1 cm

2 結(jié)果

2.1 堿基組成

序列提交GenBank, 獲得登錄號(hào)KT205283- 205288。3種珍珠貝的序列長(zhǎng)度為495 bp ~529 bp (不包括引物區(qū))。連同GenBank下載的9條珍珠貝屬序列一起分析堿基組成, 珍珠貝屬16S rRNA基因的A、T、G、C平均比例分別為25.5%、28.6%、29.5%和16.4%, A+T的比例較高。

2.2 遺傳距離

珍珠貝屬16S rRNA基因種內(nèi)的平均遺傳距離為0~0.005(范圍0~0.011), 種間的平均遺傳距離為0.088~0.227, 種內(nèi)與種間的遺傳距離差異明顯(表1)。和之間的種間遺傳距離最小, 為0.008;和之間的種間遺傳距離最大, 達(dá)0.227。作者測(cè)得的序列與GenBank中已有的序列(登錄號(hào)HQ329435)完全相同。

表1 珍珠貝屬種類(lèi)的種內(nèi)及種間平均遺傳距離

注:“/”表示僅1個(gè)個(gè)體, 無(wú)遺傳距離

2.3 系統(tǒng)學(xué)分析結(jié)果

以為外群, 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建了NJ樹(shù)(圖2), bootstrap支持率高于50%的標(biāo)注在節(jié)點(diǎn)處。由圖2可見(jiàn), 所有相同種類(lèi)的不同個(gè)體均形成單系, 并獲得很高的支持率。珍珠貝屬的種類(lèi)在NJ樹(shù)中明顯可分為2個(gè)支系, 支系Ⅰ包括和, 支系Ⅱ包括、、、和, 但兩個(gè)支系獲得的支持率較低(<50%)。

黑體顯示的序列號(hào)為本研究測(cè)得

Accession numbers in bold are sequenced in this study

3 討論

海洋貝類(lèi)是種類(lèi)十分豐富的一大類(lèi)群, 貝殼形態(tài)各異, 顏色豐富多彩, 鑒定難度較大。貝殼的殼形、殼色等是種類(lèi)鑒定和區(qū)分的主要依據(jù), 但這些特征會(huì)因?yàn)樾螒B(tài)可塑性、趨同進(jìn)化、性別以及生長(zhǎng)發(fā)育階段的不同而出現(xiàn)變化, 如蜘蛛螺屬()成體和幼體貝殼的形態(tài)差異很大[15], 脈紅螺()也會(huì)因棲息海區(qū)和底質(zhì)環(huán)境等因素的不同導(dǎo)致形態(tài)變異較大[16]。

作者采集到的標(biāo)本與國(guó)內(nèi)其他學(xué)者[2–6]所描述的或在形態(tài)學(xué)上基本一致, 可以斷定它們應(yīng)屬于同一個(gè)種。作者的標(biāo)本在腹緣上具有較多的小棘刺, 這一特征在國(guó)內(nèi)其他學(xué)者所描述的標(biāo)本中并未見(jiàn)到。基于線(xiàn)粒體16S rRNA基因序列的分析結(jié)果表明, 國(guó)內(nèi)記錄到的種類(lèi)應(yīng)為而非, 中國(guó)沿海是否有的分布尚需進(jìn)一步證實(shí)。珍珠貝屬16S rRNA基因序列的種間遺傳距離明顯大于種內(nèi)遺傳距離, 適宜作為該屬種類(lèi)區(qū)分的標(biāo)記。

形態(tài)鑒定是當(dāng)前海洋生物多樣性監(jiān)測(cè)工作的主要手段, 監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的質(zhì)量直接取決于鑒定者的水平和經(jīng)驗(yàn)。而目前專(zhuān)業(yè)的分類(lèi)人才極度匱乏, 已成為監(jiān)測(cè)工作的短板。中國(guó)已連續(xù)多年開(kāi)展海洋生態(tài)監(jiān)控區(qū)的生物多樣性監(jiān)測(cè)工作, 取得了大量的數(shù)據(jù), 但是仍然缺少完整的生物物種組成準(zhǔn)確名錄與分布記錄, 不能滿(mǎn)足多樣性全面分析比較的需要[17]。不同鑒定者之間或是不同年份之間的數(shù)據(jù)可比性較差。傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合, 會(huì)極大地提高物種鑒定的準(zhǔn)確性, 提升生物多樣性監(jiān)測(cè)的水平。

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(本文編輯: 譚雪靜)

Species identification of threespecies based on mitochondrial 16S rRNA gene

LIU Guo-qiang1, LIU Rui2, WEI Chun-lei1, ZHANG Chun-hua1

(1. Marine Environmental Monitoring Center of Beihai, State Oceanic Administration, Beihai 536000, China; 2. Handan Municipal Bureau of Environmental Protection, Handan 056002, China)

Species identification based on morphology highly relies on the ability of taxonomists. Some species can be easily misidentified based on morphological characteristics alone. To improve the accuracy of species identification, threespecies sampled from Weizhou Island, Guangxi, were identified based on shell morphology and mitochondrial 16S rRNA gene sequences. These three species were identified as,and, respectively, based on shell morphology. However, the specimen that was identified asbased on morphological characteristicswas later identified as.using 16S rRNA gene sequences.and.are two distinct species and are not synonyms. The genetic distances are much higher between species than within species, indicating that 16S rRNA gene is useful for species identification in the genus..is a valid species, andexists in China, with no further confirmation required.

; 16S rRNA gene; species identification

Jul. 9, 2015

Q959.212

A

1000-3096(2016)09-0018-05

10.11759//hykx20150709003

2015-07-09;

2015-12-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41306132)

劉國(guó)強(qiáng)(1979–), 男, 山東昌邑人, 碩士, 高級(jí)工程師, 主要從事海洋生物多樣性監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)研究, E-mail: liuguoqiang0821@ 163.com

[Foundation: National Natural Science Foundation of China, No. 41306132]