段國辰 郭濤 趙慶濤

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·論著·

EGFR在肺腺癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)意義

段國辰 郭濤 趙慶濤

目的 初步探討表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)在肺腺癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)及意義。方法 采用免疫組化方法比較46例肺腺癌患者原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶EGFR的表達(dá)及其意義。結(jié)果 EGFR在46例肺腺癌患者原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中陽性表達(dá)率分別為47.8%、52.2%；原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶EGFR表達(dá)分別在不同臨床病理特征中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中EGFR的表達(dá)具有一致性(K=0.563，P<0.05)，一致性為中等強(qiáng)度。結(jié)論 EGFR在肺腺癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中均呈現(xiàn)表達(dá)。EGFR在肺腺癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)具有一致性，提示EGFR可能參與了肺腺癌的轉(zhuǎn)移過程。

表皮生長因子；肺腺癌；免疫組化；原發(fā)灶；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶

流行病學(xué)研究顯示，肺癌為全球性疾病且發(fā)病率高[1]。近年來，肺癌在我國人群中患病率與死亡率逐年上升，我國已成為世界肺癌大國，肺癌已成為嚴(yán)重危害人民健康的疾病之一。由于臨床癥狀出現(xiàn)較晚，大多數(shù)患者就診時往往已經(jīng)晚期，從而失去早期手術(shù)機(jī)會達(dá)到根治性治療的目的。傳統(tǒng)的治療方法如化療，雖然能緩解患者的病情，但不能改善患者的生存質(zhì)量，部分患者容易出現(xiàn)耐藥、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，放療使肺野的照射面積較大，容易發(fā)生放射性毒性，而且效果不盡如人意。隨著人們對分子生物學(xué)研究與認(rèn)識的不斷加深，肺癌的治療有了進(jìn)一步發(fā)展，以表皮生長因子受體(EGFR)為分子靶點(diǎn)的靶向治療成為了研究焦點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR隸屬于酪氨酸激酶家族，是一種重要的跨膜受體。EGFR能夠識別并結(jié)合表皮生長因子配體，激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、遷移等細(xì)胞生命活動，進(jìn)而參與了腫瘤的形成、侵襲及轉(zhuǎn)移[2,3]。對于中晚期肺腺癌患者，檢測EGFR的表達(dá)往往選取腫瘤原發(fā)病灶的活組織標(biāo)本。然而，在實(shí)際的臨床工作中，由于經(jīng)支氣管鏡活檢或CT引導(dǎo)下穿刺活檢獲取的組織量較少，檢測EGFR的陽性表達(dá)率低。而患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶活組織標(biāo)本相對較易獲取，目前關(guān)于原發(fā)灶EGFR與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶EGFR的表達(dá)是否一致，及其在轉(zhuǎn)移過程中是否發(fā)生改變尚未被透徹闡明。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年1月至2012年12月在河北省人民醫(yī)院胸外科住院并接受外科手術(shù)治療的46例肺腺癌患者石蠟包埋的組織切片。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①在河北省人民醫(yī)院胸外科接受肺葉切除+淋巴結(jié)清掃術(shù)手術(shù)治療的患者；②術(shù)前均未接受化療、放療等治療，術(shù)后均接受4個療程DC方案化療；③經(jīng)術(shù)后病理與免疫組化證實(shí)均為腺癌(兩名病理醫(yī)師獨(dú)立完成)，伴有淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移，石蠟包塊完整；④臨床病例、病理資料齊全肺腺癌患者；⑤術(shù)前檢查雙側(cè)頸部B超、頭顱CT、全身骨顯像、腹部增強(qiáng)CT或行全身PET-CT均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移者。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①觀察原發(fā)灶及相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的HR染色片，其中原發(fā)灶中癌細(xì)胞較少或相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中癌細(xì)胞較少者；②術(shù)前接受化療、放療者；③病例資料不完善者；④組織蠟塊太薄者。

1.3 免疫組化方法 (1)組織切片依次經(jīng)過二甲苯液10 min、無水乙醇6 min、95%乙醇6 min、85%乙醇6 min 進(jìn)行脫蠟、水化組織切片，自來水沖洗切片3 min；(2)3%雙氧水孵育10 min，蒸餾水沖洗3次，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；(3)根據(jù)所應(yīng)用的一抗的特殊要求，將組織切片放入盛有枸櫞酸鈉緩沖液的高壓鍋內(nèi)，緩沖液剛好沒過組織切片，用微波爐將其煮沸約2 min；(4)冷卻后用PBS液沖洗，2 min×3次；(5)滴加足夠量的一抗，保證完全覆蓋組織面，保持組織面濕潤，置于37℃恒溫箱內(nèi)孵育2 h，PBS液沖洗，2 min×3次；(6)滴加試劑1(Polymer Helper即用型)，完全覆蓋組織面，置于37℃恒溫箱內(nèi)孵育20 min，PBS液沖洗，2 min×3次；(7)滴加試劑2(polyperoxidase-anti-mouse/rabbit IgG即用型)，完全覆蓋組織面，置于37℃恒溫箱內(nèi)孵育45 min，PBS液沖洗，2 min×3次；(8)滴加新配制好的DAB溶液，置于37℃的恒溫箱內(nèi)孵育10 min，取出，觀察切片顯色情況，直至切片顯色良好；(9)自來水充分沖洗后，蘇木精復(fù)染約5 min，依次于無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇進(jìn)行脫水、透明、封片。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) EGFR抗原是一種轉(zhuǎn)膜蛋白，主要存在于腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)，陽性顯色于胞膜、胞漿。陽性表達(dá)的判定標(biāo)準(zhǔn)[4-6]：腫瘤細(xì)胞的胞膜或胞漿有棕黃色顯色，明顯高于背景底色。綜合考慮癌細(xì)胞表達(dá)的陽性面積、強(qiáng)度及所占百分比計(jì)算結(jié)果。染色強(qiáng)度：不染色為陰性，淡黃色為(+)，棕黃色為(++)，黃褐色為(+++)；陽性細(xì)胞所占百分比：陽性10%為陰性，10%～30%為(+)，30%～50%為(++)，>50%為(+++)，對應(yīng)的分值分別為0～3分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，兩個變量因素的一致性比較采用Kappa一致性檢驗(yàn)，一致性強(qiáng)弱判斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：K=-1，完全不一致；K<0.4，差；0.4～0.75，中等；>0.75，強(qiáng)。選取α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌患者原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中EGFR的表達(dá)與不同臨床病理特征之間的關(guān)系 EGFR陽性表達(dá)位于腫瘤細(xì)胞的胞漿、胞膜,呈棕黃色或棕褐色,不同組織染色效果不同,EGFR在46例肺腺癌患者原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的陽性表達(dá)率分別為47.8%、52.2%。原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶EGFR表達(dá)分別在不同性別、年齡、分化程度、病變部位、吸煙史、TNM分期、腫瘤大小之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1～3，表1、2。

圖1 肺腺癌患者原發(fā)灶中EGFR的陽性表達(dá)和陰性表達(dá)(HE×10)

2.2 肺腺癌患者原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中EGFR的表達(dá)一致性 原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中EGFR的表達(dá)具有一致性(K=0.563，P<0.05)，一致性為中等強(qiáng)度。見表3。

圖2 肺腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中EGFR的陽性表達(dá)和陰性表達(dá)(HE×10)

圖3 肺腺癌患者原發(fā)灶與相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中EGFR的陽性表達(dá)(HE×10)

表1 肺腺癌患者原發(fā)灶中EGFR的表達(dá)與不同臨床病理特征之間的關(guān)系 例(%)

3 討論

近幾年，肺腺癌發(fā)病率與死亡率逐年上升，尤其好發(fā)于年輕女性，吸煙、長期暴露于空氣污染和所在工作場所暴露于致癌原是肺癌風(fēng)險增加的重要因素。非小細(xì)胞肺癌約占肺癌總病例數(shù)的75%～80%[1]。目前EGFR抑制劑靶向治療在臨床上的廣泛應(yīng)用取得了很好的療效，給非小細(xì)胞肺癌患者尤其是中晚期患者帶來了福音，但是在我們臨床實(shí)際的治療工作中，有時由于支氣管活檢及穿刺活檢原發(fā)灶組織量較少，EGFR的檢測陽性率低，需行淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶EGFR的檢測[8]，因此淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶EGFR是否具有高表達(dá)水平，與原發(fā)灶表皮生長因子受體表達(dá)是否一致，成為EGFR靶向治療的必備條件，目前國內(nèi)外相關(guān)的文獻(xiàn)報道較少。

表2 肺腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中EGFR的表達(dá)與不同臨床病理特征之間的關(guān)系 例(%)

表3 肺腺癌患者原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中EGFR的表達(dá)一致性 n=46，例

EGFR屬于I型生長因子家族，是erbB家族成員之一。EGFR主要由三個部分構(gòu)成：(1)胞外區(qū)(ECD)即多種多肽生長因子的配體結(jié)合區(qū);(2)疏水的跨膜區(qū)(TM);(3)胞內(nèi)區(qū)。EGFR由1186個氨基酸組成[9]，是一種相對分子量約170 kDa的跨膜蛋白[10]，其基因位于人類的第7號染色體，長度約200 kb，由28個外顯子組成。EGF和TGFa等配體與EGFR的配體結(jié)合區(qū)相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合后，EGFR的結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化即受體二聚合，進(jìn)而形成受體同源或異源二聚體，最終激活以酪氨酸激酶為主要結(jié)構(gòu)的胞內(nèi)區(qū)，使得分子磷酸化。EGFR被活化后能夠連接PLCT、P13K等參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。不同受體類型及磷酸化結(jié)合位點(diǎn)，會導(dǎo)致相應(yīng)的信號蛋白被激活。除此之外，EGFR還在腫瘤的分化、遷移、黏附、血管生成等關(guān)鍵特性中發(fā)揮著重要的作用[12,13]。

隨著國內(nèi)外研究的深入，研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤性疾病中EGFR均呈現(xiàn)高表達(dá)，其在腫瘤發(fā)病中的作用得到越來越多的關(guān)注。越來越多的證據(jù)表明EGFR在NSCLC原發(fā)灶中呈現(xiàn)高表達(dá)[14,15],且在癌旁正常組織中幾乎檢測不到其表達(dá)。有報道指出，EGFR在各種類型非小細(xì)胞肺癌原發(fā)灶組織中均呈現(xiàn)高表達(dá)[16]。我們的研究通過檢測肺腺癌患者原發(fā)灶中EGFR的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)EGFR在肺腺癌原發(fā)灶中陽性表達(dá)率為47.8%，與以往的研究結(jié)果一致，提示EGFR與肺腺癌的發(fā)生相關(guān),有可能以某種途徑參與其發(fā)病。已有文獻(xiàn)報道EGFR在女性NSCLC患者原發(fā)灶中的表達(dá)顯著高于男性[16]。有學(xué)者認(rèn)為女性NSCLC患者EGFR高表達(dá)的原因可能與女性體內(nèi)雌激素水平密切相關(guān),雌激素可能作為一種促發(fā)劑刺激腺上皮細(xì)胞增殖，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[17]。也有學(xué)者認(rèn)為EGFR在女性NSCLC中的高表達(dá)可能與EGFR的基因突變有關(guān)。鄭軍等[18]發(fā)現(xiàn)EGFR基因在女性患者中的突變率顯著升高。我們的研究證實(shí)女性肺腺癌患者原發(fā)灶中表達(dá)高于男性，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與文獻(xiàn)不一致。造成這種結(jié)果的原因可能與本實(shí)驗(yàn)病例數(shù)量相對較少有關(guān)，需加大樣本量進(jìn)一步證實(shí)。

關(guān)于肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中EGFR的表達(dá)，目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報道較少。Rao等[19]研究了47例NSCLC患者原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中EGFR的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶EGFR的陽性表達(dá)為78.7%(37/47)，呈現(xiàn)高表達(dá)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肺腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中EGFR陽性表達(dá)率高于原發(fā)灶中EGFR陽性表達(dá)率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示EGFR在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中呈現(xiàn)高表達(dá)，有可能參與了肺腺癌的轉(zhuǎn)移過程。EGFR在不同臨床病理特征分組下各組間均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

EGFR在肺腺癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)是否具有一致性，目前文獻(xiàn)結(jié)論尚不完全一致。Italiano等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在30例NSCLC患者中，有10例表達(dá)不一致，經(jīng)一致性檢驗(yàn)，EGFR在NSCLC患者原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)不一致，提示非小細(xì)胞肺癌原發(fā)灶向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶轉(zhuǎn)移過程中EGFR的表達(dá)不穩(wěn)定，可能發(fā)生了丟失。然而另一項(xiàng)研究表明，EGFR在肺腺癌患者原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示EGFR在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中穩(wěn)定表達(dá)[21]。本研究結(jié)果顯示，原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中EGFR表達(dá)一致33例，經(jīng)一致性檢驗(yàn)，肺腺癌患者原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中EGFR的表達(dá)具有一致性(K=0.563，P<0.05)，一致性為中等強(qiáng)度。本試驗(yàn)結(jié)果與Rao等[19]的研究結(jié)果一致，提示EGFR在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中穩(wěn)定表達(dá)，有可能通過檢測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中EGFR的表達(dá)來預(yù)測原發(fā)灶中的表達(dá)情況。

總之，EGFR在肺腺癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中均呈現(xiàn)高表達(dá)，EGFR在肺腺癌原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)具有一致性，提示EGFR在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中穩(wěn)定表達(dá)。EGFR參與肺腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程的具體機(jī)制尚未被透徹闡述，仍需進(jìn)一步的研究探索。

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050050 石家莊市，河北省人民醫(yī)院胸外二科(段國辰、趙慶濤)；河北大學(xué)附屬醫(yī)院(郭濤)

R 734.2

A

1002-7386(2016)23-3572-04

2016-06-16)