邸紅芹 楊永輝 朱桂云 王曉玲 楊慶志 范海霞 王亮 張輝

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·論著·

改良多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)流感A型和B型病毒

邸紅芹 楊永輝 朱桂云 王曉玲 楊慶志 范海霞 王亮 張輝

目的 建立改良多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系快速檢測(cè)流感A型和B型病毒。方法 根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果選定流感A型和B型病毒的靶序列，建立MRT-PCR檢測(cè)體系。構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，評(píng)估所建立體系的靈敏度、特異性和重復(fù)性。結(jié)果 成功建立了基于同源加尾系統(tǒng)和Taqman-分子燈標(biāo)探針的改良多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系；該方法最低檢測(cè)限為102 copies/μl，特異性良好，重復(fù)性良好，變異系數(shù)(CV)為0.99%～2.50%。結(jié)論 建立了快速、敏感、特異、穩(wěn)定地改良多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR(MRT-PCR)檢測(cè)體系，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR；同源加尾系統(tǒng)，Taqman-分子燈標(biāo)；流感病毒

流感病毒(influenza virus，IFV)為分節(jié)段(8個(gè)節(jié)段)的負(fù)鏈RNA病毒，其屬于正粘病毒科(orthomyxoviridae)，基于流感病毒核殼蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)抗原決定簇的差異，分為三種不同型：A型、B型和C型。其中A型流感病毒(influenza virus A，IFA)和B型流感病毒(influenza virus B，IFB)是引起人感染的主要病毒，其可導(dǎo)致上呼吸道感染且能迅速傳播流行，特別是在老人和兒童等人群中發(fā)病率和死亡率較高[1]。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，如雞胚組織培養(yǎng)接種以及血清學(xué)診斷，由于其操作過(guò)程繁瑣、靈敏度低以及檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，無(wú)法滿足快速診斷的要求，并且病毒抗原的變異頻率很高、傳播快速為IFV的精準(zhǔn)診斷和有效防控帶來(lái)極大困難。病毒簡(jiǎn)便、精確及敏感的診斷手段就表現(xiàn)得極其重要。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)檢測(cè)方法的介入，給臨床IFV診斷和治療提供很大幫助，尤其是多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(MRT-PCR)以其高通量、高靈敏性、高特異性及操作快速簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，在IFV診斷中有很大的應(yīng)用空間。多重PCR體系中存在多對(duì)引物和探針，在反應(yīng)過(guò)程中容易造成引物探針交叉干擾，導(dǎo)致擴(kuò)增效率降低，因此，本文基于同源加尾系統(tǒng)(homo-Taq assidted non-dimer，HAND)建立改良的Taqmam-分子燈標(biāo)(Taqman-MB)多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)IFA和IFB，并優(yōu)化和評(píng)價(jià)所建立的改良MRT-PCR體系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 甲型流感毒(influenza A，IFA)、乙型流感病毒(influenza B，IFB)、副流感病(Parainfluenza，PIV)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)、冠狀病毒和腺病毒(adenovirus，ADV)來(lái)源于疾控中心以及本院檢驗(yàn)科分離培養(yǎng)，整個(gè)過(guò)程完成按照國(guó)家傳染性病原體的安全操作規(guī)范進(jìn)行。

1.2 核酸提取 根據(jù)RNA(High Pure Viral Nucleic Acid Kit，Roche)提取試劑盒說(shuō)明書，提取各菌株的核酸。收集樣本于1.5 ml無(wú)菌EP管中，并加入200 μl結(jié)合緩沖液，震蕩混勻，72℃孵育10 min；將混合液加入高純過(guò)濾管中，8 000 g離心30 s，棄收集管中的上清液，留沉淀；用移液器吸500 μl抑制劑清除緩沖液于高純過(guò)濾管中，8 000 g離心30 s，棄離心后的液體；向高純過(guò)濾管中加入450 μl洗滌溶液，8 000 g離心30 s，棄收集管廢液，并重復(fù)1次；加入35 μl洗脫溶液，8 000 g離心2 min，得到核酸模板，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建 從NCBI下載IFA和IFB全基因序列，采用MEGA 4.0同源比對(duì)進(jìn)行序列分析，篩選保守序列，根據(jù)該特異性地序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，擴(kuò)增IFA和IFB目的條帶。通過(guò)分子生物學(xué)方法將目的產(chǎn)物連接至克隆載體PMD18-T(購(gòu)自大連寶生物)上，并將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Trans 10感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自北京全式金生物)，選擇陽(yáng)性單菌落，接種培養(yǎng)，并菌液PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。將菌液PCR驗(yàn)證陽(yáng)性樣本重新接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 160 r/min震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，使用質(zhì)粒小提試劑盒(購(gòu)自天根生物)，根據(jù)說(shuō)明書提取質(zhì)粒：取1.5 ml培養(yǎng)過(guò)夜的菌液于EP管中，12 000 r/min離心30 s，棄除上清液；加入250 μl P1，并徹底懸浮細(xì)菌沉淀；吸取250 μl P2于EP管中，溫和地顛倒混勻6～8次使細(xì)裂解充分；用移液槍向EP管中添加350 μl P3，立刻緩慢顛倒混勻6～8次，使溶液充分混勻，12 000 r/min離心10 min；將上清轉(zhuǎn)移到CP3(吸附柱)中，12 000 r/min離心30 s倒掉收集管中的液體；向CP3中加入600 μl漂洗液PW，12 000 r/min離心30 s，棄離心后的液體，并重復(fù)1次；將CP3置于潔凈的1.5 ml EP管中，向柱膜中部滴加50 μl質(zhì)粒洗脫液 EB，靜置2 min，12 000 r/min離心2 min收集質(zhì)粒溶液于EP管中。采用核酸定量?jī)x(Eppendorf)測(cè)定質(zhì)粒濃度并根據(jù)公式計(jì)算其拷貝數(shù)，通過(guò)公式計(jì)算質(zhì)粒原始拷貝數(shù)，拷貝數(shù)(copies/μl)= 6.02×1 023×質(zhì)粒濃度(ng/μl)/(堿基數(shù)×660)，再用無(wú)核酸酶水(RNA-free ddH2O)按10倍系列稀釋(107～10 copies/μl)，作為IFA和IFB的標(biāo)準(zhǔn)品，用于評(píng)價(jià)改良MRT-PCR診斷體系。

1.4 檢測(cè)引物及探針設(shè)計(jì) 根據(jù)IFA和IFB的保守序列，首先采用Beacon designer 8.0設(shè)計(jì)MRT-PCR引物及探針，探針設(shè)計(jì)完成后利用DNA Folding軟件進(jìn)行探針結(jié)構(gòu)分析，保證探針只形成一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)；引物之間的干擾、發(fā)卡結(jié)構(gòu)和二聚體，使用AutoDimer 和primer 5等軟件分析，最后在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性分析。所有引物5’端均采用同源加尾的方法添加一段Tag標(biāo)簽，以減少或消除引物二聚體增加擴(kuò)增效率。Taqman-MB探針5’端熒光基團(tuán)分別為FAM和HEX，3’端淬滅基團(tuán)為DABCYL。各探針引物序列均送往上海生工生物合成。見(jiàn)表1。

表1 檢測(cè)引物及探針序列

1.5 MRT-PCR檢測(cè)體系建立和優(yōu)化 使用Roche 480 PCR儀采用Taqman Fast Virus One-step Master Mix(Invitrogen)作為MRT-PCR的反應(yīng)體系(總體系25 μl)，其中含有預(yù)混的Taq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP及RNase抑制劑， 0.5 μl Tag引物(濃度40 μmol/L)，多重PCR體系中引物(濃度40 μmol/L)和探針(濃度20 μmol/L)采用矩陣法按照0.25、0.20、0.15和0.10 μl梯度優(yōu)化，選擇最佳的引物探針濃度。PCR反應(yīng)程序?yàn)?0℃，15 min(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng))；95℃，10 min(熱啟動(dòng))；95℃，15 s(變性)，62℃，25 s(退火)，72℃ 20 s(延伸)，5個(gè)循環(huán)(富集)；95℃，15 s(變性)，62℃，30 s(退火，收集熒光)，72℃ 20 s(延伸)，35個(gè)循環(huán)(擴(kuò)增)。

1.6 靈敏度實(shí)驗(yàn) 將IFA和IFB的質(zhì)粒等濃度混合制成復(fù)合模板，并將該模板梯度稀釋成一系列質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，共計(jì)7個(gè)濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品(107～10 copies/μl)，進(jìn)行MRT-PCR檢測(cè)，檢測(cè)其最低檢測(cè)濃度。

1.7 特異性實(shí)驗(yàn) 為了驗(yàn)證MRT-PCR的特異性，利用副流感病(parainfluenza，PIV)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)、冠狀病毒(coronaviruses)和腺病毒(adenovirus，ADV)等相關(guān)呼吸道病原體的核酸為模板，進(jìn)行MRT-PCR檢測(cè)，評(píng)估該檢測(cè)體系的特異性。

1.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 將IFA和IFB的質(zhì)粒按1∶1比例混合，配成107～102copies/μl梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行MRT-PCR檢測(cè)，重復(fù)10次評(píng)估檢測(cè)體系的重復(fù)性。

2 結(jié)果

2.1 引物和探針濃度優(yōu)化 通過(guò)引物和探針的梯度MRT-PCR檢測(cè)試驗(yàn)，得出該診斷體系中，IFA的檢測(cè)引物和探針濃度分別為(FAM通道)0.20 μl和0.15 μl；IFB的檢測(cè)引物和探針濃度分別為(HEX通道)0.15 μl和0.15 μl。因此，建立的MRT-PCR體系為25 μl，包括：模板RNA 5 μl，Taqman Fast Virus One-step Master Mix(Invitrogen)13.5 μl，Tag引物0.5 μl，IFA的上下游檢測(cè)引物各0.20 μl及探針0.15 μl，IFA和IFB的上下游檢測(cè)引物和探針各0.15 μl，RNA-free ddH2O 5.0 μl。見(jiàn)圖1。

圖1 MRT-PCR體系中IFA(A和B)和IFB(C和D)檢測(cè)引物和探針優(yōu)化。1、2、3和4分別代表引物及探針濃度為0.25、0.20、0.15和0.10 μl時(shí)的擴(kuò)增曲線

2.2 MRT-PCR檢測(cè)體系靈敏度分析 使用拷貝數(shù)為107～10 copies/μl的IFA和IFB的質(zhì)?；旌夏０?，完成MRT-PCR檢測(cè)，所建立的改良MRT-PCR檢測(cè)體對(duì)IFA和IFB的最低檢測(cè)濃度為102copies/μl，各反應(yīng)之間的引物探針的交叉干擾較小，能夠同時(shí)擴(kuò)增不同的靶序列，能滿足單一體系中檢測(cè)兩種流感病毒的要求。見(jiàn)圖2。

圖2 改良MRT-PCR體系靈敏度檢測(cè);A:IFA的檢測(cè)擴(kuò)增曲線，B:IFB的檢測(cè)擴(kuò)增曲線

2.3 MRT-PCR檢測(cè)體系特異性分析 使用羅氏公司的High Pure Viral Nucleic Acid Kit提取咽拭子樣本中的病毒核酸，50個(gè)流感A型病毒(influenza virus A)陽(yáng)性樣本，50個(gè)流感B型病毒(influenza virus A)樣本，30個(gè)副流感病毒(parainfluenza virus)陽(yáng)性樣本，20個(gè)呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)陽(yáng)性樣本，10個(gè)冠狀病毒(coronaviruses)陽(yáng)性樣本和10個(gè)腺病毒(adenovirus)的病毒核酸(以上陽(yáng)性樣本均經(jīng)熒光 RT-PCR方法確定為陽(yáng)性)，完成MRT-PCR檢測(cè)。結(jié)果表明除了50例流感A型和B型病毒陽(yáng)性樣本檢測(cè)為陽(yáng)性，其余病毒檢測(cè)均為陰性。見(jiàn)表2。

表2 MRT-PCR體系特異性檢測(cè)

表3 改良MRT-PCR體系重復(fù)性檢驗(yàn)

3 討論

流感是由流感病毒引起的常見(jiàn)呼吸系統(tǒng)疾病，其具有高度的傳染性，流行范圍廣泛，且臨床表現(xiàn)又極為相似，給臨床醫(yī)師診療帶來(lái)極大困難。李巖等[2]對(duì)河北省2009至2015年度流行性感冒進(jìn)行病原學(xué)監(jiān)測(cè)，顯示：63 397例流感樣標(biāo)本的陽(yáng)性率為16.89%(10 705 例陽(yáng)性)，其中IFA H1N1亞型4 179例、季節(jié)性H3亞型3 674例及IFB 2 595例，表明河北省流行高峰出現(xiàn)在當(dāng)年11月至次年2月，以IFA H1N1亞型流感病毒流行為主，與IFB型流感病毒和季節(jié)性H3亞型病毒呈共同或先后交替感染流行的特點(diǎn)，兒童感染陽(yáng)性率(5～15歲)最高。流感病毒快速、準(zhǔn)確的診斷是臨床治療合理用藥的關(guān)鍵，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如分離培養(yǎng)和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，耗時(shí)長(zhǎng)且檢測(cè)效率低。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，多種新的診斷手段被用于各種呼吸道病毒的診斷，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR[3，4]、恒溫?cái)U(kuò)增[5,6]以及基因芯片技術(shù)[7，8]等。周雪花[9]納入了2009年9月至2013年12月收集的2 489例本院就診患者拭子標(biāo)本，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR診斷其特異性的核酸序列，共檢測(cè)出676例陽(yáng)性標(biāo)本(陽(yáng)性率27.16%)，其中主要流行的病毒為IFA和IFB，該方法可用于快速檢測(cè)流感病毒核酸，用于流感病毒流行病學(xué)調(diào)查。呂沁風(fēng)等[10]基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，構(gòu)建新型恒溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)用于甲型H1N1亞型流感病毒的快速診斷。彭宜等[11]基于顏色的不同，采用LAMP技術(shù)建立可視化禽流感病毒檢測(cè)體系，溯源性檢測(cè)120例臨床標(biāo)本，該方法檢測(cè)到H1N1和H1N2亞型禽流感病毒分別為14份和8份，與病毒分離結(jié)果一致。楊海鷗等[12]建立了一種基于NASBA技術(shù)檢測(cè)呼吸道合胞病毒(RSV)的新方法，其檢測(cè)靈敏度顯著高于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，至少比RT-PCR高出2個(gè)數(shù)量級(jí)，克服了目前實(shí)驗(yàn)室病毒檢測(cè)方法的局限性，為呼吸道病毒的檢測(cè)提供快速有效的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。本文建立一種改良的多重實(shí)時(shí)熒光PCR體系，用于流感病毒診斷，其具有敏感、特異、簡(jiǎn)便及高通量等優(yōu)勢(shì)。

多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR集合了多重PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn)，可以在單一體系中快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)多種靶序列，但是由于PCR反應(yīng)體系中存在多對(duì)引物和探針，在PCR反應(yīng)過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致引物探針間的交叉干擾，如背景熒光值高和引物二聚體的形成，嚴(yán)重干擾PCR擴(kuò)增。本研究中我們采用了改良的Taqmam-MB探針(Taqman-分子燈標(biāo)探針)，探針保留了分子燈標(biāo)探針的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使熒光和猝滅基團(tuán)盡可能的靠近，解決背景熒光高的問(wèn)題，同時(shí)將探針臂也做為序列識(shí)別位點(diǎn)，使探針與靶序列結(jié)合更加緊密，提高雜交的效率[13，14]。此外，我們引入了同源加尾系統(tǒng)(HAND)解決擴(kuò)增過(guò)程中引物二聚體的問(wèn)題，其原理是：在PCR的初始階段由于引物較高的溶解溫度(Tm值)低濃度的加尾引物特異的與靶序列結(jié)合，擴(kuò)增并富集兩頭帶有Tag的PCR產(chǎn)物，若此時(shí)有引物二聚體形成，加尾引物兩頭的互補(bǔ)序列會(huì)構(gòu)成一個(gè)穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，致使其不能進(jìn)行擴(kuò)增，從而極大地減少了引物二聚體對(duì)熒光定量PCR的干擾[15-17]。蘭全學(xué)等[18]基于同源加尾體系建立快速診斷中食源性致病菌的MRT-PCR體系，臨床樣本檢測(cè)顯示該方法特異且敏感性高，與金標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)論一致。

本文首先建立了改良的基于HAND系統(tǒng)的MRT-PCR體系，經(jīng)一系列方法學(xué)驗(yàn)證，該檢測(cè)體系靈敏度良好，檢測(cè)最低限為1×102copies/μl，基本能滿足流感病毒的檢測(cè)要求；改良的MRT-PCR體系具有很高的特異性，能夠特異的檢測(cè)IFA和IFB，其他病毒檢測(cè)無(wú)陽(yáng)性結(jié)果；此外重復(fù)性檢驗(yàn)得出該體系CV為0.51%～1.97%，均小于5%，重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，表明建立的改良MRT-PCR體系能夠用于流感病毒的快速檢測(cè)，為流感的有效防控提供高效、可靠及精確的技術(shù)方法。

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Detection of influenza virus A and B by modified multiplex real-time fluorescence PCR assay

DIHongqin,YANGYonghui,ZHUGuiyun,etal.

HeibeiProvincialChestDiseaseHospital,Shijiazhuang050041,China

Objective To set up a modified multiplex real-time fluorescence quantitative PCR (MRT-PCR) assay to detect influenza virus A and B rapidly.Methods The MRT-PCR assay was established according to target sequence of influenza virus A and B specific gene selected by bioinformatics analysis results. The standard products and quality control samples were built to evaluate the sensitivity,specificity and repeatability of the system.Results The MRT-PCR detection system was successfully established based on Taqman-molecular beacon (Taqman-MB) probe and Homo-Taq Assidted Non-Dimer (HAND) system.The detection limit of the assay was 102 copies/μl,which showed good specificity and repeatability,with coefficient of variation (CV) being 0.99%～2.50%.Conclusion A fast,specific,sensitive,stable, modified MRT-PCR detection system is successfully established,which possesses favourable application prospect in clinical practice.

MRT-PCR; HAND system; Taqman-molecular beacon,; influenza virus

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.23.002

項(xiàng)目來(lái)源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(編號(hào)：20150147)

050041 石家莊市，河北省胸科醫(yī)院(邸紅芹、楊永輝、朱桂云、王亮、張輝)；河北省唐山市豐潤(rùn)區(qū)第二人民醫(yī)院(王曉玲、楊慶志)；河北省三河市中醫(yī)醫(yī)院(范海霞)

張輝，050041 石家莊市，河北省胸科醫(yī)院;

E-mail：zhanghui_4081@sina.com

R 373

A

1002-7386(2016)23-3529-04

2016-10-12)