謝琦　劉永明

摘要：目的：從大腸桿菌中選擇性抽提GST-Tal-TP5融合蛋白。方法：采用滲透休克法從大腸桿菌中提取GST-Totl-TP5融合蛋白，優(yōu)化操作條件，并與超聲破碎法進(jìn)行比較。結(jié)果：優(yōu)化后的滲透休克法從大腸桿菌提取GST-TotI-TP5融合蛋白可使雜蛋白量含量相對(duì)超聲破碎法降低一個(gè)數(shù)量級(jí)。結(jié)論：滲透休克法可高效提取大腸桿菌表達(dá)的GST-Tα1-TP5融合蛋白。

關(guān)鍵詞：滲透休克法；大腸桿菌；谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶；重組胸腺肽Tα1-TP5

中圖分類(lèi)號(hào)：R441.9；Q51；R378.21 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-2409（2015）04-0009-04

胸腺素α1（Tα1）是胸腺組分5（thvmosin fraction 5）中分離出來(lái)的由28個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，胸腺五肽（TP5）是胸腺生成素Ⅱ第32—36位的氨基酸殘基片段。Tod和TP5均屬免疫調(diào)節(jié)劑，臨床上二者均被用于治療免疫缺陷、肝炎、腫瘤和艾滋病等疾病。為了進(jìn)一步研究二者的聯(lián)合作用，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了與GST基因融合表達(dá)的重組胸腺肽Tα1-TP5表達(dá)菌株，在乳糖的誘導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)了高效可溶性表達(dá)。

滲透休克法可選擇性提取大腸桿菌周質(zhì)空間蛋白，對(duì)簡(jiǎn)化后期純化工藝十分有利。有文獻(xiàn)報(bào)道采用滲透休克法提取重組大腸桿菌周質(zhì)空間的青霉素G?；?，回收率92.4%，純化倍數(shù)3.22。目前，大腸桿菌表達(dá)的GST融合蛋白大多采用超聲破碎法，該法得到的粗酶液比活較低。本研究探討用滲透休克法從大腸桿菌中提取GST-Tα1-TP5融合蛋白，并優(yōu)化操作條件。

1材料與方法

1.1材料與試劑

大腸桿菌BL21（DE3）[PGEX-4T-1]，攜帶重組胸腺肽Tα1-TP5基因。

BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海生物工程公司；

TB培養(yǎng)基：酵母粉2.4%，蛋白胨1.2%，甘油0.4%，磷酸二氫鉀17 mmol/L，磷酸氫二鉀72 mmol/L，高壓滅菌時(shí)磷酸鹽與其他組分分開(kāi)，待溶液冷卻至60%以下后混合。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)條件 500ml三角瓶裝TB培養(yǎng)基100ml，接種量0.5%，37℃，250 r/min，搖床培養(yǎng)，2.5 h后加終濃度1 dL乳糖誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)6h后收集菌體。

1.2.2蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定。

1.2.3 GST酶活測(cè)定采用分光光度法嘲測(cè)定GST-Tcx1-TP5融合蛋白的酶活。

1.2.4超聲破碎細(xì)胞 離心收集菌體，20 mM Tris-HCL（pH 8.0）緩沖液洗滌離心，菌體重懸，冰浴超聲破碎10 rain（工作30 s，間歇30 s），破碎后在14 000 r/min下冷凍離心10min，所得上清即為粗酶液。

1.2.5滲透休克法 發(fā)酵液離心去上清液，菌體用PBS洗滌1次后重懸于1/2發(fā)酵液體積的高滲溶液中，于25℃輕柔磁力攪拌30min，4℃12 000 r/min離心10min，棄高滲液，在菌泥中加入1/2發(fā)酵液體積的預(yù)冷的低滲溶液中，于冰浴中輕柔磁力攪拌一定時(shí)間，4℃14000 r/min離心10min，得上清液，為粗酶液。1.2.6蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)實(shí)驗(yàn)高滲溶液為100 mM Tris-HCl含10mM EDTA和不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（10%，20%，30%，40%，50%）的蔗糖，pH 9.0；低滲液為20 mMTris-HCL，pH 8.0；低滲提取時(shí)間為20min；實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)1.2.1和1.2.5。粗酶液進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。

1.2.7低滲液選擇實(shí)驗(yàn)根據(jù)1.2.6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，高滲液所含蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，GST-Tα1-TP5融合蛋白的提取率最高，后續(xù)的條件優(yōu)化以此為基礎(chǔ)。

選擇3種不同的低滲液進(jìn)行比較，分別為水，pH6.9；20 mM Tris-HCl，pH 8.0；20 mM PBS，pH 7.4。實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)1.2.1和1.2.5。粗酶液進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。

1.2.8低滲處理時(shí)間實(shí)驗(yàn) 根據(jù)1.2.7的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇最優(yōu)的低滲液，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)以此為基礎(chǔ)。

低滲提取時(shí)間選擇10min，20min，30min，40min，50 min，60 min。實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)1.2.1和1.2.5。粗酶液進(jìn)行12%SDS-PAGE分析。

1.2.9超聲波法與滲透休克法的比較 將同一批發(fā)酵得到的菌體分別按1.2.4和1.2.5方法提取粗酶液，滲透休克法采用優(yōu)化后的條件。所得粗酶液在同樣條件下進(jìn)行12%SDS-PAGE，按1.2.2方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，按1.2.3法測(cè)定GST-Tα1-TP5融合蛋白酶活。

2結(jié)果與分析

2.1蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

滲透休克的操作中，高滲液蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是關(guān)鍵。為了進(jìn)一步提高提取率，在配制不同蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高滲液時(shí)，加入終濃度100 mM Tris-HCl，調(diào)節(jié)高滲液的pH 9.0，同時(shí)還添加10mM的EDTA以增加細(xì)胞膜的通透性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

從SDS-PAGE電泳圖譜分析可知，GST-Tα1-TP5融合蛋白的條帶的強(qiáng)度在蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)最強(qiáng)，該條件下GST-Tα1-TP5融合蛋白的提取率最高。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)高滲液蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均采用20%。

2.2低滲液的影響

采用2.1優(yōu)選的高滲液處理后，比較3種低滲液的提取效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。根據(jù)SDS-PAGE電泳圖譜，3種低滲液的提取效果為：20 mM Tris-HCl（pH 8.0）略?xún)?yōu)于水（pH 6.9）和20mMPBS（pH7.4）。又由于GST融合蛋白在20mMTris-HCl（pH 8.0）緩沖液中可以更好地保持酶活，利于后續(xù)酶活的測(cè)定和利用GST的特性進(jìn)一步地精制純化目的蛋白，所以本實(shí)驗(yàn)選擇20mM Tris-HCL（pH 8.0）為最優(yōu)的低滲液

2.3低滲處理時(shí)間的影響

不同低滲處理時(shí)間的結(jié)果見(jiàn)圖3，根據(jù)SDS-PAGE電泳圖譜分析，低滲提取時(shí)間選擇10 min時(shí)，目的蛋白提取率明顯低于20～60 min的提取率。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到20 min以后，目的蛋白的提取率變化不大。說(shuō)明周質(zhì)蛋白從周質(zhì)空間滲出并達(dá)到平衡大約需要20min，進(jìn)一步延長(zhǎng)時(shí)間，對(duì)提高目的蛋白的提取率作用不大，而且還會(huì)增加胞質(zhì)蛋白的滲出，對(duì)純化不利，所以最優(yōu)的低滲處理時(shí)間選擇20 min。

2.4超聲波法與滲透休克法的比較

將同一批發(fā)酵得到的菌體分別按將優(yōu)化后的滲透休克法與常規(guī)的超聲破碎法提取GST-Tα1-TP5融合蛋白，同樣條件下進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果見(jiàn)圖4。同時(shí)測(cè)定兩種方法提取粗酶液的蛋白含量和酶活，結(jié)果見(jiàn)表1。從電泳圖譜可直觀地看到滲透休克法提取的粗酶液比超聲破碎細(xì)胞得到的粗酶液雜蛋白含量少得多。從表1的結(jié)果可知，兩種方法提取的總酶活相差不大，但二者比活相差近10倍。

3討論

大腸桿菌是表達(dá)重組蛋白常用的宿主菌，對(duì)于表達(dá)于大腸桿菌周質(zhì)空間的重組蛋白，最好的抽提方法是在保持細(xì)胞內(nèi)膜完整的條件下，選擇性地部分破壞細(xì)胞外膜和細(xì)胞壁，使蛋白最大限度釋放出來(lái)，而胞內(nèi)物質(zhì)盡量不受影響地存在于細(xì)胞內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)采用的滲透休克法是針對(duì)大腸桿菌的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的周質(zhì)蛋白定向釋放技術(shù)，大腸桿菌是細(xì)胞壁較脆弱的G^-菌，外膜主要組成為脂多糖，脂多糖具有吸附金屬陽(yáng)離子如Ca²⁺、Mg²⁺等作用。該方法首先將大腸桿菌置于含有EDTA的高滲蔗糖介質(zhì)中，在高滲環(huán)境中細(xì)胞內(nèi)水分外流，導(dǎo)致細(xì)胞收縮，同時(shí)利用EDTA螯合陽(yáng)離子的能力，螯合吸附在外膜脂多糖表面上的金屬陽(yáng)離子，使細(xì)胞外膜受損，然后將收縮的細(xì)胞置入低滲的環(huán)境中，由于滲透壓的急劇變化，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞吸水膨脹，細(xì)胞周質(zhì)空間也急劇膨脹，受損的外膜和細(xì)胞壁被部分撐破，通透性增加，周質(zhì)空間的蛋白釋放到胞外。若采用細(xì)胞完全破碎的抽提方法，細(xì)胞內(nèi)容物全部釋放，大量的雜蛋白與目的蛋白混雜在一起，增加了后續(xù)純化的困難，最終將影響目的蛋白的提取率，此外，大量的雜蛋白中可能含有的蛋白酶或其他的抑制劑，對(duì)目的蛋白的提取也有影響。采用激烈的細(xì)胞破碎方法，如實(shí)驗(yàn)室常用的超聲破碎法和工業(yè)生產(chǎn)中常用的機(jī)械破碎法還會(huì)對(duì)目的蛋白的活性存在一定的破壞作用，如引起部分目的酶的失活等。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)在大腸桿菌周質(zhì)空間表達(dá)的GST-Tαl-TP5融合蛋白的滲透休克提取法進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的提取條件是高滲液為pH9.0，100mM Tris-HCl含10mM EDTA和20%的蔗糖，低滲液為20 mM Tris-HCl，pH 8.0，低滲提取時(shí)間為20 min。采用滲透休克法不需要復(fù)雜的設(shè)備和操作成本，規(guī)?？纱罂尚。m用范圍廣，不僅為實(shí)現(xiàn)重組胸腺肽的大規(guī)模生產(chǎn)提供了新的技術(shù)支撐，對(duì)其他表達(dá)于細(xì)胞周質(zhì)的重組蛋白的提取也起一定的借鑒作用。