丁澤紅 鐵韋韋 付莉莉 顏彥 夏志強 王文泉 胡偉

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101）

木薯MePIL1基因克隆與表達分析

丁澤紅 鐵韋韋 付莉莉 顏彥 夏志強 王文泉 胡偉

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所，海口 571101）

旨在克隆木薯MePIL1基因，揭示其在木薯遮蔭等非生物逆境脅迫中的作用。用RT-PCR的方法從木薯栽培種Ku50葉片中克隆MePIL1基因，對其進行序列比對和系統(tǒng)進化樹分析，研究其在木薯野生種和栽培種之間的結(jié)構(gòu)變異，并應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)分析其表達特性。結(jié)果顯示，克隆獲得木薯MePIL1基因，該基因具有一個1 578 bp的開放閱讀框，編碼525個氨基酸，含有一個HLH保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進化樹分析表明，MePIL1與其在楊樹和杞柳中的同源基因聚在一起，親緣關(guān)系較近。基因結(jié)構(gòu)變異分析顯示，MePIL1在HLH結(jié)構(gòu)域非常保守，其結(jié)構(gòu)變異主要來自于栽培種與野生種之間的差異，且整體上分布比較均勻。表達分析結(jié)果顯示，MePIL1在葉片中高表達，而且其表達量受到遮蔭和滲透脅迫的誘導。結(jié)果表明，成功克隆了木薯MePIL1基因，并且MePIL1在轉(zhuǎn)錄水平參與木薯對遮蔭和滲透脅迫的應(yīng)答。

木薯；MePIL1；遮蔭；基因克??；表達分析

陽光充足是提高木薯產(chǎn)量的重要保證。作為短日照熱帶作物，木薯喜陽不耐遮蔭，它對光照強度十分敏感。在拉丁美洲、非洲等熱帶干旱或半干旱地區(qū)，農(nóng)民以求達到土壤經(jīng)濟效益最大化，木薯常常與其它早熟的作物（如玉米、水稻、橡膠和椰子樹等）間作在一起［1，2］。大多數(shù)時候，特別是植物

生長發(fā)育的早期，由于間種的作物長得較快，致使木薯經(jīng)常遭受到不同程度的遮蔭，光照強度降低［3］；其次，隨著木薯栽培水平的提高，木薯生產(chǎn)區(qū)域的擴展和種植密度的增加，使得遮蔭的情況也時有發(fā)生。遮蔭（光照不足）會導致木薯莖葉陡長、節(jié)間伸長、莖干細弱、塊根變小，最終造成木薯產(chǎn)量顯著減少［3］。因此，篩選和鑒定與木薯遮蔭相關(guān)的重要基因，深入研究其生物學功能，對提高木薯產(chǎn)量具有重要意義。

在遮蔭條件下，光強和光質(zhì)是改變最大的環(huán)境因子：如遠紅光（FR）增加，紅光（R）和藍光減少［4］，它們可以作為信號分子誘導植物發(fā)生一系列的生理變化。相應(yīng)地，許多基因的表達量也會發(fā)生改變。其中，PIF3-LIKE 1（PIL1）是遮蔭條件下加速植物生長所必需的基因之一，編碼一個bHLH蛋白［5］。PIL1最早是在擬南芥中通過基因芯片發(fā)現(xiàn)的，qRT-PCR證實其表達量在遮蔭環(huán)境（低R：FR）下可以迅速被誘導；更重要的是，當植物從低R：FR轉(zhuǎn)移到高R：FR時，其表達量則迅速下降［5］。研究表明，PIL1可以被其他基因（如cry1、cry2、pif4、pif5、pif7等）調(diào)控［6，7］，共同參與遮蔭反應(yīng)。而且，PIL1還能自我反饋調(diào)節(jié)（自身的表達量）以應(yīng)對遮蔭脅迫［8］。

木薯栽培種是野生種從熱帶雨林邊緣向稀樹草原進化而來［9］。經(jīng)過約7 000-12 000年的馴化，與野生種相比，木薯栽培種具有更好的逆境（如抗病性、耐旱性和耐貧瘠）耐受能力，因而具有更高的生物量和淀粉產(chǎn)量［10］。PIL1被看作是研究植物遮蔭反應(yīng)的標記基因［11］。然而，目前與PIL1相關(guān)的研究主要集中在模式植物擬南芥，PIL1在熱帶作物中的研究還較少，有關(guān)木薯PIL1基因克隆及其對遮蔭反應(yīng)的相關(guān)分子作用機制尚未見報道。本研究從木薯栽培種Ku50葉片中克隆一個PIL1基因（命名為MePIL1），從系統(tǒng)進化樹、基因結(jié)構(gòu)變異、啟動子順式元件和基因表達等方面對它展開了分析，為進一步研究MePIL1的調(diào)控功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試木薯野生種W14、栽培種Ku50和Arg7由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 材料種植與處理 在木薯種植季節(jié)，將Ku50種莖切成長度約15 cm 的莖段，挑選芽眼（3-4個/莖段）且粗細均勻一致的莖段扦插于塑料盆（高18.8 cm，上直徑18.5 cm，下直徑14.8 cm）中，1莖段/盆?；|(zhì)采用營養(yǎng)土與蛭石以1∶1的體積比進行混合。木薯種植約10 d后進行間苗，保留1苗/盆。

遮蔭處理：遮蔭處理的木薯種植于樹蔭底下，對照處理的木薯種植于室外。種植約2個月后，選擇生長狀況較一致的植株，收集不同葉片，包括未展開葉、第一片完全展開葉和老葉的樣品，-80℃超低溫冰箱保存。

PEG處理：種植60 d后，選取長勢一致的植株用20%的PEG6000溶液模擬干旱脅迫，以澆灌自來水（不施PEG）為對照。在處理0、3和24 h后，分別收集葉片（包括未展開葉、第一片完全展開葉及老葉）和根的樣品，-80℃超低溫冰箱保存。

為了考察木薯野生種（W14）和不同栽培種（Ku50和Arg7）中MePIL1基因的表達變化，我們收集了正常大田種植環(huán)境下葉片（90 d）、莖（90 d）和儲藏根（150 d）的樣品，-80℃超低溫冰箱保存、備用。

1.2.2 RNA提取與cDNA合成 用RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取不同木薯組織總RNA。用 Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司）將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，儲存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 基因克隆 以木薯Ku50葉片的cDNA第一鏈為模板，用primer6.0軟件設(shè)計的MePIL1基因全長擴增引物（L1：5'-CAATCGGGTCGTGTTTTGGC-3'；R1：5'-TCTTTGAGCCTATGGCGTGT-3'）進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接和轉(zhuǎn)化后，挑選陽性TA克隆送往華大基因生物科技公司進行測序。

1.2.4 生物信息學分析 用BLASTP搜索Phytozome數(shù)據(jù)庫（https://phytozome.jgi.doe.gov/），獲取在其他物種中同源性較高的序列；用ClustalX進行序列比對；用MEGA5.2軟件［12］構(gòu)建進化樹（Bootstrap= 1 000）；用DnaSPv5［13］進行SNP分析及Ka/Ks計

算；用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/）進行啟動子元件分析；用CDD數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）進行保守結(jié)構(gòu)域分析。木薯栽培種Ku50和野生種W14中MePIL1基因序列由前期全基因組測序確定［9］；栽培種AM560中MePIL1序列從Phytozome數(shù)據(jù)庫下載。

1.2.5 基因表達分析 用primer6.0軟件設(shè)計MePIL1基因qRT-PCR特異性引物（L2：5'-TGACTTGTTTCCCGGTTCGT-3'；R2：5'-CGTCTTCGCATTCGGGTACT-3'）。actin基因引物（L3：5'-TGATGAGTCTGGTCCATCCA-3'；R3：5'-CCTCCTACGACCCAATCTCA-3'）由前人研究［14］確定。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR采用 SYBR Green I試劑盒（TaKaRa公司），按照操作說明在Mx 3005P熒光定量PCR儀（Stratagene，美國）上進行：95℃ 30 s，1個循環(huán)；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃30 s，40個循環(huán)；95℃ 1 min，55℃ 30 s，95℃ 30 s，1個循環(huán)。每個樣品3次生物學重復(fù)，表達量按照2-ΔΔCt進行計算［15］。

2 結(jié)果

2.1 MePIL1基因的克隆

根據(jù)擬南芥AtPIL1序列（AT2G46970），搜索木薯數(shù)據(jù)庫尋找其同源序列（Manes.05G008000.1），之后設(shè)計基因特異性引物進行PCR擴增（圖1）。測序后得到一個長為1 639 bp的序列，包括33 bp的5' UTR，28 bp的3' UTR及1 578 bp的開放閱讀框，將其命名為MePIL1（GenBank登錄號：KX147466）。MePIL1編碼525個氨基酸。經(jīng)與木薯參考基因組（https://phytozome.jgi.doe.gov/）比對，MePIL1共有5個外顯子，4個內(nèi)含子（圖2）。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，MePIL1包含一個HLH domain，位于第3、4外顯子上（圖2）。

圖1 木薯MePIL1基因擴增結(jié)果

2.2 MePIL1基因結(jié)構(gòu)變異

為了揭示MePIL1基因結(jié)構(gòu)的變異，將3個木薯品種（包括一個野生種W14，兩個栽培種Ku50和AM560）中的MePIL1序列進行比對分析（圖2-A），共發(fā)現(xiàn)46個SNP，4個Indel（圖2-B）。整體上，這些變異分布比較均勻。有趣的是，在HLH保守結(jié)構(gòu)域并沒有發(fā)現(xiàn)任何變異，暗示HLH區(qū)域可能對MePIL1基因功能非常重要。

圖2 木薯MePIL1基因比對結(jié)果（A）與其結(jié)構(gòu)變異示意圖（B）

序列兩兩比較表明，MePIL1的結(jié)構(gòu)變異主要來自于栽培種與野生種之間的差異：栽培種與栽培種之間的差異很小，只有4個SNP，其中1個在非編碼區(qū)，3個在編碼區(qū)；除此之外，其他變異均來自于栽培種與野生種之間。栽培種與野生種Ka/Ks的值介于0.519-0.578之間，暗示MePIL1基因在進化的過程中受到了純化選擇。

2.3 MePIL1進化樹分析

經(jīng)Phytozome數(shù)據(jù)庫搜索，獲得了與MePIL1同源性較高的其他物種的序列。進化樹分析表明，MePIL1蛋白與楊樹（Potri.014G111400.1）和杞柳（SapurV1A.0321s0050.1）聚在一起，親緣關(guān)系較近（圖3）。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，C4植物包括柳枝稷、谷子、高粱、二穗短柄草、玉米和狗尾草聚在一起，而C3植物如白菜型油菜和水稻聚在一起，說明PIL1基因具有C3-C4分化的特性。然而，作為C3植物，擬南芥并沒有與白菜型油菜和水稻聚在一起，說明PIL1在C3植物內(nèi)存在不同的分化。

圖3 MePIL1系統(tǒng)進化樹分析

2.4 啟動子元件分析

啟動子是基因的一個重要組成部分。我們選取MePIL1起始密碼子上游1 500 bp進行啟動子元件分析，發(fā)現(xiàn)了與ABA作用的元件（如ABRE）、與光相關(guān)的元件（如ATCT-motif、Box I和Box 4）、與熱脅迫相關(guān)的元件（如HSE）和與干旱誘導相關(guān)的元件（如MBS）。而且，這些作用元件在野生種和栽培種中都存在。這些結(jié)果表明，MePIL1可能參與干旱、光、熱等脅迫的響應(yīng)。

2.5 MePIL1表達分析

本研究考察了MePIL1基因在野生種和栽培種不同組織中的表達量變化。結(jié)果（圖4-A）表明，在野生種W14中，MePIL1在葉片中表達最高，莖稈其次，根中最低。與野生種相比，MePIL1在栽培種中呈現(xiàn)出相似的表達趨勢，然而其在葉片中的表達量要高3-4倍，且表現(xiàn)出葉片特異性表達的特點。這些結(jié)果表明，在木薯進化的過程中，MePIL1基因主要傾向于通過提高葉片中的表達量來適應(yīng)新的生長環(huán)境。這可能與該基因在野生種和栽培種之間的堿基變異有關(guān)。

圖4 木薯MePIL1基因表達量分析

木薯栽培種是野生種從熱帶雨林邊緣向稀樹草原進化而來，其中光（包括光強和光質(zhì)）是最重要的環(huán)境因子。隨后，我們在正常和遮蔭條件下，分別檢測了栽培種Ku50不同葉片中MePIL1基因的表達量。結(jié)果（圖4-B）表明，MePIL1在遮蔭條件下的表達量均顯著的高于其在正常條件下的表達量，說明該基因受遮蔭脅迫誘導。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，MePIL1的表達量隨著葉片衰老而逐漸增加，暗示該基因可能還參與木薯葉片衰老過程。

在MePIL1啟動子區(qū)域，我們發(fā)現(xiàn)了與ABA作用的元件（如ABRE）和與干旱誘導相關(guān)的元件（如MBS），暗示MePIL1可能還參與干旱脅迫。為了初步研究MePIL1對干旱脅迫的響應(yīng)，我們在PEG 6000模擬條件下，考察了MePIL1在不同組織中表達的動態(tài)變化（圖4-C）。結(jié)果表明，在未展開葉中，MePIL1的表達量呈現(xiàn)先下降（3 h）再上升（24 h）的趨勢；在第一片完全展開葉中，MePIL1的表達量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，但差異并不明顯；在老葉中，MePIL1的表達量在PEG脅迫3 h后基本沒有變化，但在24 h顯著上升；在根中，MePIL1的表達量很低，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。這些結(jié)果表明，在PEG脅迫處理后，MePIL1在不同葉片和根中的表達量呈現(xiàn)多樣性的變化，這將為后續(xù)研究其功能提供較好的參考。

3 討論

木薯是喜陽作物，光照不足（遮蔭）顯著地減少了木薯產(chǎn)量。作為遮蔭反應(yīng)的標記基因，PIL1在植物遮蔭脅迫中扮演著重要角色，但在木薯中尚未見報道。本研究從木薯中克隆了PIL1的同源基因MePIL1。序列分析表明，MePIL1編碼525個氨基酸，有5個外顯子，4個內(nèi)含子，親緣關(guān)系與楊樹和杞柳較近。與其他PIL1基因類似［5］，MePIL1也含有一個保守的HLH結(jié)構(gòu)域。

木薯栽培種是野生種從熱帶雨林邊緣向稀樹草原進化而來［9］。與熱帶雨林相比，稀樹草原所處的緯度更高，太陽光要相對弱一些。為了更好地適應(yīng)新的生長環(huán)境，許多與光、高溫和水分脅迫等相關(guān)的基因在栽培種中的表達均較高［9］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)MePIL1在兩個栽培種（Ku50和Arg7）葉片中的表達量均顯著高于野生種，暗示這可能是木薯在進化的過程中增強環(huán)境適應(yīng)性的結(jié)果。此外，我們還發(fā)現(xiàn)MePIL1在野生種和栽培種之間存在大量的堿基變異，但具體哪個變異與基因的表達量相關(guān)，目前還不清楚。

與預(yù)期相同，在遮蔭條件下，MePIL1的表達量被顯著誘導。而且，它還能被PEG6000處理誘導，說明MePIL1可能參與除遮蔭之外的其他脅迫（如干旱）響應(yīng)。這一點在水稻中觀察到了相似的結(jié)論：在干旱條件下，OsPIL1可以作為一個關(guān)鍵調(diào)控因子參與節(jié)間伸長［16］。除此之外，冷脅迫也顯著抑制了OsPIL1的表達量，然而高鹽、高溫、ABA、GA對OsPIL1的表達量沒有影響［16］。

表達分析表明，MePIL1在葉片中特異性表達，而且其表達量隨著葉片衰老而逐漸增加，暗示該基因可能參與木薯葉片衰老過程。雖然目前還沒有PIL1參與衰老的直接報道，但有研究表明，PIF4和PIF5在擬南芥中能誘導葉片衰老［17］；而且PIF4和PIF5能調(diào)控其下游靶基因PIL1的表達［18］，暗示PIF4和PIF5可能通過PIL1調(diào)控木薯葉片衰老。這些結(jié)果為進一步研究MePIL1的功能奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究克隆了木薯PIL基因MePIL1。該基因具有1 578 bp的開放閱讀框，編碼525個氨基酸，含有HLH保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進化樹分析表明，MePIL1與楊樹和杞柳的親緣關(guān)系較近?；蚪Y(jié)構(gòu)變異分析顯示MePIL1在HLH結(jié)構(gòu)域非常保守，其結(jié)構(gòu)變異主要來自于栽培種與野生種之間的差異。表達分析結(jié)果顯示，MePIL1在葉片中高表達，而且其表達量受到遮蔭和滲透脅迫的誘導。

［1］ Mutsaers H, Ezumah H, Osiru D. Cassava-based intercropping：a review［J］. Field Crops Research, 1993, 34（3-4）：431-457.

［2］ Johnston M, Onwueme I. Effect of shade on photosynthetic pigments in the tropical root crops：yam, taro, tannia, cassava and sweet potato［J］. Experimental Agriculture, 1998, 34（3）：301-312.

［3］ Okoli PS, Wilson G. Response of cassava（Manihot esculenta Crantz）to shade under field conditions［J］. Field Crops Research, 1986, 14：349-359.

［4］ Vandenbussche F, Pierik R, Millenaar FF, et al. Reaching out of the shade［J］. Current Opinion in Plant Biology, 2005, 8（5）：462-468.

［5］ Salter MG, Franklin KA, Whitelam GC. Gating of the rapid shadeavoidance response by the circadian clock in plants［J］. Nature, 2003, 426（6967）：680-683.

［6］ Zhang T, Maruhnich SA, Folta KM. Green light induces shade

avoidance symptoms［J］. Plant Physiology, 2011, 157（3）：1528-1536.

［7］ Nozue K, Tat AV, Devisetty UK, et al. Shade avoidance components and pathways in adult plants revealed by phenotypic profiling［J］. Plos Genet, 2015, 11（4）：e1004953.

［8］ Li L, Zhang Q, Pedmale UV, et al. PIL1 participates in a negative feedback loop that regulates its own gene expression in response to shade［J］. Molecular Plant, 2014, 7（10）：1582-1585.

［9］ Wang W, Feng B, Xiao J, et al. Cassava genome from a wild ancestor to cultivated varieties［J］. Nature Communications, 2014, 5：5110

［10］ Bredeson JV, Lyons JB, Prochnik SE, et al. Sequencing wild and cultivated cassava and related species reveals extensive interspecific hybridization and genetic diversity［J］. Nature Biotechnology, 2016, 34：562-570.

［11］ Wang H, Zhang Z, Li H, et al. CONSTANS-LIKE 7 regulates branching and shade avoidance response in Arabidopsis［J］. Journal of Experimental Botany, 2013, 64（4）：1017-1024.

［12］ Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods［J］. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28（10）：2731-2739.

［13］ Librado P, Rozas J. DnaSP v5：a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data［J］. Bioinformatics, 2009, 25（11）：1451-1452.

［14］ Xu J, Duan X, Yang J, et al. Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots［J］. Plant Physiology, 2013, 161（3）：1517-1528.

［15］ 胡偉, 顏彥, 韋運謝, 等. 木薯MeASR基因克隆及表達分析［J］.生物技術(shù)通報, 2015, 31（10）：125-130.

［16］ Todaka D, Nakashima K, Maruyama K, et al. Rice phytochromeinteracting factor-like protein OsPIL1 functions as a key regulator of internode elongation and induces a morphological response to drought stress［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2012, 109（39）：15947-15952.

［17］ Sakuraba Y, Jeong J, Kang MY, et al. Phytochrome-interacting transcription factors PIF4 and PIF5 induce leaf senescence in Arabidopsis［J］. Nature Communications, 2014, 5：4636.

［18］ Hornitschek P, Kohnen MV, Lorrain S, et al. Phytochrome interacting factors 4 and 5 control seedling growth in changing light conditions by directly controlling auxin signaling［J］. The Plant Journal, 2012, 71（5）：699-711.

（責任編輯 馬鑫）

Clone and Expression Analysis of MePIL1 in Cassava

DING Ze-hong TIE Wei-wei FU Li-li YAN Yan XIA Zhi-qiang WANG Wen-quan HU Wei
（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Science，Haikou 571101）

This work aims to clone MePIL1 gene from cassava and to reveal its functional roles in abiotic stresses（e.g.，shade），which will provide theoretical bases for optimizing the planting density of cassava. MePIL1 gene was cloned from leaf of cassava cultivar ‘Ku50’by RT-PCR method，and the sequences of MePIL1 and its homology genes with other species were aligned and their phylogenetic tree was constructed. Subsequently，structural variations of MePIL1 were revealed between wild and cultivated cassava，and their expression patterns were investigated by quantitative RT-PCR. Results showed that MePIL1，which had a 1 578 bp open reading frame and encoded 525 amino acids and contained a HLH conserved domain，was cloned from cassava. Phylogenetic analysis showed that MePIL1 and homologous genes from Populus trichocarpa and Salix purpurea were clustered together，indicating that they had close genetic relationships. Analysis of gene structural variation revealed that the region of HLH domain was highly conserved，while most variations were derived from the differences between the wild and cultivated cassava species，and the distribution overall was relatively even. Expression pattern analysis showed that MePIL1 was highly expressed in leaf，and its expression was induced by osmotic stress and shade treatments. In conclusion，MePIL1 of cassava was successfully cloned and it was involved in the responses to shade and osmotic stresses at the transcriptional level in cassava.

cassava；MePIL1；shade stress；gene clone；expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.013

2016-04-17

海南省自然科學基金項目（20163120，20153048，314123）

丁澤紅，男，博士，助理研究員，研究方向：植物分子生物學；E-mail：dingzehong@itbb.org.cn

胡偉，男，博士，副研究員，研究方向：植物分子生物學；E-mail：huwei2010916@126.com