丁澤紅 鐵韋韋 付莉莉 顏彥 夏志強(qiáng) 王文泉 胡偉

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101）

木薯MePIL1基因克隆與表達(dá)分析

丁澤紅 鐵韋韋 付莉莉 顏彥 夏志強(qiáng) 王文泉 胡偉

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海口 571101）

旨在克隆木薯MePIL1基因，揭示其在木薯遮蔭等非生物逆境脅迫中的作用。用RT-PCR的方法從木薯栽培種Ku50葉片中克隆MePIL1基因，對(duì)其進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，研究其在木薯野生種和栽培種之間的結(jié)構(gòu)變異，并應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)分析其表達(dá)特性。結(jié)果顯示，克隆獲得木薯MePIL1基因，該基因具有一個(gè)1 578 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼525個(gè)氨基酸，含有一個(gè)HLH保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，MePIL1與其在楊樹(shù)和杞柳中的同源基因聚在一起，親緣關(guān)系較近?；蚪Y(jié)構(gòu)變異分析顯示，MePIL1在HLH結(jié)構(gòu)域非常保守，其結(jié)構(gòu)變異主要來(lái)自于栽培種與野生種之間的差異，且整體上分布比較均勻。表達(dá)分析結(jié)果顯示，MePIL1在葉片中高表達(dá)，而且其表達(dá)量受到遮蔭和滲透脅迫的誘導(dǎo)。結(jié)果表明，成功克隆了木薯MePIL1基因，并且MePIL1在轉(zhuǎn)錄水平參與木薯對(duì)遮蔭和滲透脅迫的應(yīng)答。

木薯；MePIL1；遮蔭；基因克隆；表達(dá)分析

陽(yáng)光充足是提高木薯產(chǎn)量的重要保證。作為短日照熱帶作物，木薯喜陽(yáng)不耐遮蔭，它對(duì)光照強(qiáng)度十分敏感。在拉丁美洲、非洲等熱帶干旱或半干旱地區(qū)，農(nóng)民以求達(dá)到土壤經(jīng)濟(jì)效益最大化，木薯常常與其它早熟的作物（如玉米、水稻、橡膠和椰子樹(shù)等）間作在一起［1，2］。大多數(shù)時(shí)候，特別是植物

生長(zhǎng)發(fā)育的早期，由于間種的作物長(zhǎng)得較快，致使木薯經(jīng)常遭受到不同程度的遮蔭，光照強(qiáng)度降低［3］；其次，隨著木薯栽培水平的提高，木薯生產(chǎn)區(qū)域的擴(kuò)展和種植密度的增加，使得遮蔭的情況也時(shí)有發(fā)生。遮蔭（光照不足）會(huì)導(dǎo)致木薯莖葉陡長(zhǎng)、節(jié)間伸長(zhǎng)、莖干細(xì)弱、塊根變小，最終造成木薯產(chǎn)量顯著減少［3］。因此，篩選和鑒定與木薯遮蔭相關(guān)的重要基因，深入研究其生物學(xué)功能，對(duì)提高木薯產(chǎn)量具有重要意義。

在遮蔭條件下，光強(qiáng)和光質(zhì)是改變最大的環(huán)境因子：如遠(yuǎn)紅光（FR）增加，紅光（R）和藍(lán)光減少［4］，它們可以作為信號(hào)分子誘導(dǎo)植物發(fā)生一系列的生理變化。相應(yīng)地，許多基因的表達(dá)量也會(huì)發(fā)生改變。其中，PIF3-LIKE 1（PIL1）是遮蔭條件下加速植物生長(zhǎng)所必需的基因之一，編碼一個(gè)bHLH蛋白［5］。PIL1最早是在擬南芥中通過(guò)基因芯片發(fā)現(xiàn)的，qRT-PCR證實(shí)其表達(dá)量在遮蔭環(huán)境（低R：FR）下可以迅速被誘導(dǎo)；更重要的是，當(dāng)植物從低R：FR轉(zhuǎn)移到高R：FR時(shí)，其表達(dá)量則迅速下降［5］。研究表明，PIL1可以被其他基因（如cry1、cry2、pif4、pif5、pif7等）調(diào)控［6，7］，共同參與遮蔭反應(yīng)。而且，PIL1還能自我反饋調(diào)節(jié)（自身的表達(dá)量）以應(yīng)對(duì)遮蔭脅迫［8］。

木薯栽培種是野生種從熱帶雨林邊緣向稀樹(shù)草原進(jìn)化而來(lái)［9］。經(jīng)過(guò)約7 000-12 000年的馴化，與野生種相比，木薯栽培種具有更好的逆境（如抗病性、耐旱性和耐貧瘠）耐受能力，因而具有更高的生物量和淀粉產(chǎn)量［10］。PIL1被看作是研究植物遮蔭反應(yīng)的標(biāo)記基因［11］。然而，目前與PIL1相關(guān)的研究主要集中在模式植物擬南芥，PIL1在熱帶作物中的研究還較少，有關(guān)木薯PIL1基因克隆及其對(duì)遮蔭反應(yīng)的相關(guān)分子作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究從木薯栽培種Ku50葉片中克隆一個(gè)PIL1基因（命名為MePIL1），從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、基因結(jié)構(gòu)變異、啟動(dòng)子順式元件和基因表達(dá)等方面對(duì)它展開(kāi)了分析，為進(jìn)一步研究MePIL1的調(diào)控功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試木薯野生種W14、栽培種Ku50和Arg7由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 材料種植與處理 在木薯種植季節(jié)，將Ku50種莖切成長(zhǎng)度約15 cm 的莖段，挑選芽眼（3-4個(gè)/莖段）且粗細(xì)均勻一致的莖段扦插于塑料盆（高18.8 cm，上直徑18.5 cm，下直徑14.8 cm）中，1莖段/盆。基質(zhì)采用營(yíng)養(yǎng)土與蛭石以1∶1的體積比進(jìn)行混合。木薯種植約10 d后進(jìn)行間苗，保留1苗/盆。

遮蔭處理：遮蔭處理的木薯種植于樹(shù)蔭底下，對(duì)照處理的木薯種植于室外。種植約2個(gè)月后，選擇生長(zhǎng)狀況較一致的植株，收集不同葉片，包括未展開(kāi)葉、第一片完全展開(kāi)葉和老葉的樣品，-80℃超低溫冰箱保存。

PEG處理：種植60 d后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株用20%的PEG6000溶液模擬干旱脅迫，以澆灌自來(lái)水（不施PEG）為對(duì)照。在處理0、3和24 h后，分別收集葉片（包括未展開(kāi)葉、第一片完全展開(kāi)葉及老葉）和根的樣品，-80℃超低溫冰箱保存。

為了考察木薯野生種（W14）和不同栽培種（Ku50和Arg7）中MePIL1基因的表達(dá)變化，我們收集了正常大田種植環(huán)境下葉片（90 d）、莖（90 d）和儲(chǔ)藏根（150 d）的樣品，-80℃超低溫冰箱保存、備用。

1.2.2 RNA提取與cDNA合成 用RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取不同木薯組織總RNA。用 Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司）將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 基因克隆 以木薯Ku50葉片的cDNA第一鏈為模板，用primer6.0軟件設(shè)計(jì)的MePIL1基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物（L1：5'-CAATCGGGTCGTGTTTTGGC-3'；R1：5'-TCTTTGAGCCTATGGCGTGT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接和轉(zhuǎn)化后，挑選陽(yáng)性TA克隆送往華大基因生物科技公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 用BLASTP搜索Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)（https://phytozome.jgi.doe.gov/），獲取在其他物種中同源性較高的序列；用ClustalX進(jìn)行序列比對(duì)；用MEGA5.2軟件［12］構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（Bootstrap= 1 000）；用DnaSPv5［13］進(jìn)行SNP分析及Ka/Ks計(jì)

算；用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/）進(jìn)行啟動(dòng)子元件分析；用CDD數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。木薯栽培種Ku50和野生種W14中MePIL1基因序列由前期全基因組測(cè)序確定［9］；栽培種AM560中MePIL1序列從Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)下載。

1.2.5 基因表達(dá)分析 用primer6.0軟件設(shè)計(jì)MePIL1基因qRT-PCR特異性引物（L2：5'-TGACTTGTTTCCCGGTTCGT-3'；R2：5'-CGTCTTCGCATTCGGGTACT-3'）。actin基因引物（L3：5'-TGATGAGTCTGGTCCATCCA-3'；R3：5'-CCTCCTACGACCCAATCTCA-3'）由前人研究［14］確定。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR采用 SYBR Green I試劑盒（TaKaRa公司），按照操作說(shuō)明在Mx 3005P熒光定量PCR儀（Stratagene，美國(guó)）上進(jìn)行：95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 1 min，55℃ 30 s，95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)，表達(dá)量按照2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算［15］。

2 結(jié)果

2.1 MePIL1基因的克隆

根據(jù)擬南芥AtPIL1序列（AT2G46970），搜索木薯數(shù)據(jù)庫(kù)尋找其同源序列（Manes.05G008000.1），之后設(shè)計(jì)基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖1）。測(cè)序后得到一個(gè)長(zhǎng)為1 639 bp的序列，包括33 bp的5' UTR，28 bp的3' UTR及1 578 bp的開(kāi)放閱讀框，將其命名為MePIL1（GenBank登錄號(hào)：KX147466）。MePIL1編碼525個(gè)氨基酸。經(jīng)與木薯參考基因組（https://phytozome.jgi.doe.gov/）比對(duì)，MePIL1共有5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子（圖2）。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，MePIL1包含一個(gè)HLH domain，位于第3、4外顯子上（圖2）。

圖1 木薯MePIL1基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2 MePIL1基因結(jié)構(gòu)變異

為了揭示MePIL1基因結(jié)構(gòu)的變異，將3個(gè)木薯品種（包括一個(gè)野生種W14，兩個(gè)栽培種Ku50和AM560）中的MePIL1序列進(jìn)行比對(duì)分析（圖2-A），共發(fā)現(xiàn)46個(gè)SNP，4個(gè)Indel（圖2-B）。整體上，這些變異分布比較均勻。有趣的是，在HLH保守結(jié)構(gòu)域并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何變異，暗示HLH區(qū)域可能對(duì)MePIL1基因功能非常重要。

圖2 木薯MePIL1基因比對(duì)結(jié)果（A）與其結(jié)構(gòu)變異示意圖（B）

序列兩兩比較表明，MePIL1的結(jié)構(gòu)變異主要來(lái)自于栽培種與野生種之間的差異：栽培種與栽培種之間的差異很小，只有4個(gè)SNP，其中1個(gè)在非編碼區(qū)，3個(gè)在編碼區(qū)；除此之外，其他變異均來(lái)自于栽培種與野生種之間。栽培種與野生種Ka/Ks的值介于0.519-0.578之間，暗示MePIL1基因在進(jìn)化的過(guò)程中受到了純化選擇。

2.3 MePIL1進(jìn)化樹(shù)分析

經(jīng)Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，獲得了與MePIL1同源性較高的其他物種的序列。進(jìn)化樹(shù)分析表明，MePIL1蛋白與楊樹(shù)（Potri.014G111400.1）和杞柳（SapurV1A.0321s0050.1）聚在一起，親緣關(guān)系較近（圖3）。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，C4植物包括柳枝稷、谷子、高粱、二穗短柄草、玉米和狗尾草聚在一起，而C3植物如白菜型油菜和水稻聚在一起，說(shuō)明PIL1基因具有C3-C4分化的特性。然而，作為C3植物，擬南芥并沒(méi)有與白菜型油菜和水稻聚在一起，說(shuō)明PIL1在C3植物內(nèi)存在不同的分化。

圖3 MePIL1系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

2.4 啟動(dòng)子元件分析

啟動(dòng)子是基因的一個(gè)重要組成部分。我們選取MePIL1起始密碼子上游1 500 bp進(jìn)行啟動(dòng)子元件分析，發(fā)現(xiàn)了與ABA作用的元件（如ABRE）、與光相關(guān)的元件（如ATCT-motif、Box I和Box 4）、與熱脅迫相關(guān)的元件（如HSE）和與干旱誘導(dǎo)相關(guān)的元件（如MBS）。而且，這些作用元件在野生種和栽培種中都存在。這些結(jié)果表明，MePIL1可能參與干旱、光、熱等脅迫的響應(yīng)。

2.5 MePIL1表達(dá)分析

本研究考察了MePIL1基因在野生種和栽培種不同組織中的表達(dá)量變化。結(jié)果（圖4-A）表明，在野生種W14中，MePIL1在葉片中表達(dá)最高，莖稈其次，根中最低。與野生種相比，MePIL1在栽培種中呈現(xiàn)出相似的表達(dá)趨勢(shì)，然而其在葉片中的表達(dá)量要高3-4倍，且表現(xiàn)出葉片特異性表達(dá)的特點(diǎn)。這些結(jié)果表明，在木薯進(jìn)化的過(guò)程中，MePIL1基因主要傾向于通過(guò)提高葉片中的表達(dá)量來(lái)適應(yīng)新的生長(zhǎng)環(huán)境。這可能與該基因在野生種和栽培種之間的堿基變異有關(guān)。

圖4 木薯MePIL1基因表達(dá)量分析

木薯栽培種是野生種從熱帶雨林邊緣向稀樹(shù)草原進(jìn)化而來(lái)，其中光（包括光強(qiáng)和光質(zhì)）是最重要的環(huán)境因子。隨后，我們?cè)谡：驼谑a條件下，分別檢測(cè)了栽培種Ku50不同葉片中MePIL1基因的表達(dá)量。結(jié)果（圖4-B）表明，MePIL1在遮蔭條件下的表達(dá)量均顯著的高于其在正常條件下的表達(dá)量，說(shuō)明該基因受遮蔭脅迫誘導(dǎo)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，MePIL1的表達(dá)量隨著葉片衰老而逐漸增加，暗示該基因可能還參與木薯葉片衰老過(guò)程。

在MePIL1啟動(dòng)子區(qū)域，我們發(fā)現(xiàn)了與ABA作用的元件（如ABRE）和與干旱誘導(dǎo)相關(guān)的元件（如MBS），暗示MePIL1可能還參與干旱脅迫。為了初步研究MePIL1對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)，我們?cè)赑EG 6000模擬條件下，考察了MePIL1在不同組織中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化（圖4-C）。結(jié)果表明，在未展開(kāi)葉中，MePIL1的表達(dá)量呈現(xiàn)先下降（3 h）再上升（24 h）的趨勢(shì)；在第一片完全展開(kāi)葉中，MePIL1的表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，但差異并不明顯；在老葉中，MePIL1的表達(dá)量在PEG脅迫3 h后基本沒(méi)有變化，但在24 h顯著上升；在根中，MePIL1的表達(dá)量很低，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。這些結(jié)果表明，在PEG脅迫處理后，MePIL1在不同葉片和根中的表達(dá)量呈現(xiàn)多樣性的變化，這將為后續(xù)研究其功能提供較好的參考。

3 討論

木薯是喜陽(yáng)作物，光照不足（遮蔭）顯著地減少了木薯產(chǎn)量。作為遮蔭反應(yīng)的標(biāo)記基因，PIL1在植物遮蔭脅迫中扮演著重要角色，但在木薯中尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究從木薯中克隆了PIL1的同源基因MePIL1。序列分析表明，MePIL1編碼525個(gè)氨基酸，有5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子，親緣關(guān)系與楊樹(shù)和杞柳較近。與其他PIL1基因類似［5］，MePIL1也含有一個(gè)保守的HLH結(jié)構(gòu)域。

木薯栽培種是野生種從熱帶雨林邊緣向稀樹(shù)草原進(jìn)化而來(lái)［9］。與熱帶雨林相比，稀樹(shù)草原所處的緯度更高，太陽(yáng)光要相對(duì)弱一些。為了更好地適應(yīng)新的生長(zhǎng)環(huán)境，許多與光、高溫和水分脅迫等相關(guān)的基因在栽培種中的表達(dá)均較高［9］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)MePIL1在兩個(gè)栽培種（Ku50和Arg7）葉片中的表達(dá)量均顯著高于野生種，暗示這可能是木薯在進(jìn)化的過(guò)程中增強(qiáng)環(huán)境適應(yīng)性的結(jié)果。此外，我們還發(fā)現(xiàn)MePIL1在野生種和栽培種之間存在大量的堿基變異，但具體哪個(gè)變異與基因的表達(dá)量相關(guān)，目前還不清楚。

與預(yù)期相同，在遮蔭條件下，MePIL1的表達(dá)量被顯著誘導(dǎo)。而且，它還能被PEG6000處理誘導(dǎo)，說(shuō)明MePIL1可能參與除遮蔭之外的其他脅迫（如干旱）響應(yīng)。這一點(diǎn)在水稻中觀察到了相似的結(jié)論：在干旱條件下，OsPIL1可以作為一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子參與節(jié)間伸長(zhǎng)［16］。除此之外，冷脅迫也顯著抑制了OsPIL1的表達(dá)量，然而高鹽、高溫、ABA、GA對(duì)OsPIL1的表達(dá)量沒(méi)有影響［16］。

表達(dá)分析表明，MePIL1在葉片中特異性表達(dá)，而且其表達(dá)量隨著葉片衰老而逐漸增加，暗示該基因可能參與木薯葉片衰老過(guò)程。雖然目前還沒(méi)有PIL1參與衰老的直接報(bào)道，但有研究表明，PIF4和PIF5在擬南芥中能誘導(dǎo)葉片衰老［17］；而且PIF4和PIF5能調(diào)控其下游靶基因PIL1的表達(dá)［18］，暗示PIF4和PIF5可能通過(guò)PIL1調(diào)控木薯葉片衰老。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究MePIL1的功能奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究克隆了木薯PIL基因MePIL1。該基因具有1 578 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼525個(gè)氨基酸，含有HLH保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，MePIL1與楊樹(shù)和杞柳的親緣關(guān)系較近?；蚪Y(jié)構(gòu)變異分析顯示MePIL1在HLH結(jié)構(gòu)域非常保守，其結(jié)構(gòu)變異主要來(lái)自于栽培種與野生種之間的差異。表達(dá)分析結(jié)果顯示，MePIL1在葉片中高表達(dá)，而且其表達(dá)量受到遮蔭和滲透脅迫的誘導(dǎo)。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Clone and Expression Analysis of MePIL1 in Cassava

DING Ze-hong TIE Wei-wei FU Li-li YAN Yan XIA Zhi-qiang WANG Wen-quan HU Wei
（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Science，Haikou 571101）

This work aims to clone MePIL1 gene from cassava and to reveal its functional roles in abiotic stresses（e.g.，shade），which will provide theoretical bases for optimizing the planting density of cassava. MePIL1 gene was cloned from leaf of cassava cultivar ‘Ku50’by RT-PCR method，and the sequences of MePIL1 and its homology genes with other species were aligned and their phylogenetic tree was constructed. Subsequently，structural variations of MePIL1 were revealed between wild and cultivated cassava，and their expression patterns were investigated by quantitative RT-PCR. Results showed that MePIL1，which had a 1 578 bp open reading frame and encoded 525 amino acids and contained a HLH conserved domain，was cloned from cassava. Phylogenetic analysis showed that MePIL1 and homologous genes from Populus trichocarpa and Salix purpurea were clustered together，indicating that they had close genetic relationships. Analysis of gene structural variation revealed that the region of HLH domain was highly conserved，while most variations were derived from the differences between the wild and cultivated cassava species，and the distribution overall was relatively even. Expression pattern analysis showed that MePIL1 was highly expressed in leaf，and its expression was induced by osmotic stress and shade treatments. In conclusion，MePIL1 of cassava was successfully cloned and it was involved in the responses to shade and osmotic stresses at the transcriptional level in cassava.

cassava；MePIL1；shade stress；gene clone；expression analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.013

2016-04-17

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20163120，20153048，314123）

丁澤紅，男，博士，助理研究員，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：dingzehong@itbb.org.cn

胡偉，男，博士，副研究員，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：huwei2010916@126.com