陶虹張紹平張琳娜張漫扈啟寬，

（1. 寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學系，銀川 750004；2. 寧夏顱腦疾病重點實驗室 國家重點實驗室培育基地，銀川 750004）

腫瘤干細胞中受H3K9me2調控的干性基因的篩選

陶虹1張紹平2張琳娜1張漫1扈啟寬1，2

（1. 寧夏醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學系，銀川 750004；2. 寧夏顱腦疾病重點實驗室 國家重點實驗室培育基地，銀川 750004）

為了分析比較甲基轉移酶G9a和組蛋白H3K9me2修飾在膠質瘤干細胞與非干細胞中存在的差異，篩選出維持膠質瘤干細胞干性的相關基因。通過G9a抑制劑促進U87細胞成球和過表達G9a促進U87細胞分化的方法，培養(yǎng)了成球的膠質瘤干細胞和貼壁的非干細胞，這兩種細胞的CD133表達差異明顯。再利用H3K9me2抗體通過ChIP-seq技術比較H3K9me2修飾在干細胞組與非干細胞組中的差異，在存在差異的基因中，對TSS±2 000 bp范圍內的基因進行了GO分析，并隨機選出10個轉錄因子進行QPCR驗證，結果與ChIP-seq實驗基本一致。

ChIP-seq；G9a；H3K9me2；Bix01294；U87細胞株

自我復制是干細胞所特有的特性，在保持高度增殖能力的同時還能維持子代細胞處于不分化狀態(tài)，并保持其多向分化潛能。腫瘤干細胞廣泛存在于各種腫瘤中［1-6］，也具有自我復制和多向分化的特性，并表達多種干細胞的標志分子，如CD34、CD133、ALDH1、CXCR4、Nestin、LRCs等。腫瘤干細胞一般處于休眠或者低增殖狀態(tài)，但受到內、外因素刺激后，便可被活化進入自我復制和增殖狀態(tài)，成為腫瘤發(fā)生的“種子 ”［7］。

組蛋白H3K9（dimethylated histone H3 lysine 9）甲基化修飾是發(fā)生在組蛋白H3的9位賴氨酸殘基上的甲基化，與基因沉默相關［8］。在胚胎干細胞中，H3K9甲基化修飾的基因僅占基因組4%；當胚胎干細胞分化時，分化的細胞會失去H3K4與H3K27的

雙價可塑性修飾，轉而以更為永久的DNA甲基化與H3K9甲基化為標記［9］。Sox2、c-myc、Oct4、nanog等是維持腫瘤干細胞自我復制至關重要的核心轉錄因子，在干細胞走向分化之后，這些基因必須被抑制，而這種抑制機制最可能與組蛋白H3K9甲基化修飾和DNA甲基化有關［10］。G9a是一種組蛋白賴氨酸（H3K9）甲基轉移酶，催化常染色質H3K9的單甲基（H3K9me）和雙甲基化（H3K9me2）［11，12］。Bix01294是一種G9a抑制劑，可以促進膠質瘤細胞系的“神經球”克隆成球率，同時促進干細胞標志分子CD133和Sox2等干性基因的表達；轉染G9a表達質粒則可以使CD133和Sox2表達水平明顯下降［13］。

我們在前期工作［13］中發(fā)現(xiàn)，將U87細胞用加Bix01294的成球培養(yǎng)基培養(yǎng)5-7 d，可以得到質量較好的成球細胞，其CD133表達量明顯升高，將此作為干細胞的模型；與此相對應，我們用貼壁培養(yǎng)的U87細胞轉染G9a過表達質粒后2 d，這些細胞的CD133表達量有所下降，以此作為非干細胞的對照模型。在此兩種干細胞和非干細胞的模型中，我們擬采用ChIP-seq（Chromatin immunoprecipitationsequencing）技術對全基因組范圍內H3K9me2修飾的基因進行分析比較，試圖篩選出受H3K9me2修飾調控的“干性”相關基因。

1 材料與方法

1.1 材料

U87細胞株（北京協(xié)和細胞庫）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、OPTI-MEM（HyClone公司）；RNA提取試劑盒、脂質體試劑Lipofectamine 2000（INVITROGEN）；B27添 加 劑（GIBCO）；BFGF、EGF（INVITROGEN）；Bix01294（Sigma公司）；Q-PCR Mix（北京全式金）；抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) U87貼壁細胞用含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。U87成球細胞用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加Bix01294（每1 mL培養(yǎng)基中加濃度為1 mmol/L的Bix 1 μL），5-7 d成球。無血清培養(yǎng)基（100 mL）配制：DMEM/F12：96 mL；B27 supplement（50×）：2 mL；EGF（20 ng/ mL）：4 μL；Basic-FGF（20 ng/ mL）：40 μL；雙抗：1 mL；谷氨酰氨：1 mL。

1.2.2 G9a表達質粒的構建及轉染 以人全基因組為模板，G9a引物進行PCR（引物由上海杰瑞生物公司代理合成）。用PCR產物、表達質粒pcDNA3.1構建G9a表達質粒，鑒定完全正確后進行轉染。轉染前一天，U87細胞接種于6 cm的培養(yǎng)皿中，無抗生素培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)，第2天細胞密度達到80%-90%，將21.2 μL的G9a表達質粒和20 μL Lipofectamine 2000混合液均勻滴入培養(yǎng)皿中，置培養(yǎng)箱6 h后換正常培養(yǎng)基。同樣方法轉染空載質粒。

1.2.3 Western blot檢測G9a、H3K9me2和CD133蛋白的表達 將轉染空載質粒、G9a表達質粒3 d的貼壁細胞和懸浮培養(yǎng)的成球細胞分別提取總蛋白，BAC法測蛋白濃度，每泳道上樣40 μg，10%SDSPAGE膠電泳，PVDF膜濕轉，5%脫脂牛奶封閉，一抗G9a（1∶1 000）、H3K9me2（1∶1 000）4℃冰箱孵育過夜，洗膜，二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，洗膜，滴加HRP發(fā)光液，曝光，顯影。

1.2.4 ChIP-seq樣本制備 將貼壁和懸浮細胞分別離心，室溫PBS重懸后加入終濃度為1%的甲醛輕微混勻，室溫放置固定10 min；加入終濃度為0.125 mol/L的甘氨酸輕微混勻后置于冰上5 min，終止交聯(lián)；1 500 r/min 4℃離心5 min，棄上清，用等體積的冷PBS洗滌細胞兩次；1 500 r/min 4℃收集細胞，-80℃凍存。處理好的樣本交于上?？党缮锕こ逃邢薰咀鯟hIP-seq實驗，公司做染色質免疫沉淀使用的抗體是H3K9me2抗體。樣本在上機前進行質量檢測，ChIP-seq樣品要求DNA總量大于10 ng，片段主峰分布在100-500 bp之間。本實驗樣品：非干細胞片段主峰大小為234 bp，濃度為27.7 nmol/L；干細胞片段主峰大小為227 bp，濃度為15.3 nmol/L，符合上機測序要求，結果如圖1。

1.2.5 QPCR實驗 Trizol法分別提取干細胞和非干細胞的總RNA。以符合試驗要求的RNA為模板逆轉錄cDNA，以SYBR Green為熒光標記物，GAPDH為內參，進行PCR擴增和熒光檢測。反應體系：cDNA 2 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5

μL，2×Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR 擴增循環(huán)：95℃ 5 min，然后94℃ 5 s、60℃ 15 s、72℃ 10 s，經40次循環(huán)后72℃ 7 min。2-△△Ct法測定干細胞和非干細胞mRNA的相對表達量。QPCR引物由Premier Primer 5. 0 software設計。

圖1 CHIP-seq樣品質量分析

表1 QPCR引物序列

2 結果

2.1 Western blot檢測干細胞和非干細胞G9a、CD133、Sox2蛋白的表達

Western blot結果（圖2）顯示，U87細胞轉染G9a表達質粒后，G9a和H3K9me2蛋白的表達量明顯升高，說明G9a表達質粒轉染成功，同時干細胞標志分子CD133和干性相關基因Sox2的表達量顯著下降。加Bix01294的成球U87細胞，其G9a和H3K9me2蛋白的表達量顯著下降，但CD133和Sox2的表達量卻明顯增加。

圖2 Western blot檢測干細胞和非干細胞G9a、CD133、Sox2蛋白的表達情況

2.2 全基因組和第6號染色體上H3K9me2修飾差異的結果

2.2.1 全基因組H3K9me2修飾差異的結果 為了比較干細胞和非干細胞全基因組 H3K9me2修飾的差異，分別統(tǒng)計了干細胞和非干細胞全基因組H3K9me2的富集情況（即peaks數(shù)）及全基因組上的啟動子區(qū)、外顯子區(qū)、內含子區(qū)、基因間區(qū)共4個區(qū)域上H3K9me2的富集情況（即peaks數(shù)）。結果（表2）顯示，在干細胞和非干細胞的全基因組上，H3K9me2修飾差異不明顯，而且大多數(shù) H3K9me2 peaks分布在基因間區(qū)。

表2 干細胞和非干細胞H3K9me2修飾水平在全基因組上的分布情況

2.2.2 第6號染色體上H3K9me2修飾差異的結果 使用UCSC基因組瀏覽器，對膠質瘤干細胞和

非干細胞的第6號染色體的H3K9me2分布情況進行可視化展示，結果如圖3所示，第6號染色體上干細胞中H3K9me2的富集情況稍小于非干細胞中H3K9me2的富集情況。

圖3 干細胞和非干細胞中H3K9me2修飾水平在6號染色體上的分布情況

2.3 ChIP-seq實驗篩選差異基因的結果

ChIP-seq分別篩選干細胞和非干細胞中受H3K-9me2調控的基因，結果（圖4）顯示在轉錄起始位點（Transcription Start Site，TSS）±2 000 bp范圍內，膠質瘤干細胞中受H3K9me2調控的基因有1 006個，非干細胞中受H3K9me2調控的基因有976個，其中有355個同時存在于干細胞和非干細胞中。受H3K9me2調控的轉錄因子，膠質瘤干細胞中254個，非干細胞中238個，同時存在于干細胞和非干細胞中的95個。從轉錄因子中隨機選取10個做QPCR檢測，其中6個選自干細胞，4個選自非干細胞。所選取轉錄因子的名稱及峰值位置見表3。

圖4 干細胞與非干細胞進行ChIP-seq實驗篩選得到的相關基因

表3 隨機選取10個轉錄因子的名稱及峰值位置

2.4 隨機選取的轉錄因子的QPCR結果及干細胞和非干細胞KLHL4、HOXC9、CHD2的H3K9me2修飾差異

2.4.1 隨機選取的轉錄因子的QPCR結果 對隨機選取的10個轉錄因子做QPCR驗證，結果（圖5）顯示干細胞中隨機選取的FOXN3、FEZF2、KLHL4、PRDM13、FAM43B、HOXC9在干細胞中mRNA的相對表達量高于非干細胞，其中PRDM13、KLHL4的表達量增加顯著，而從非干細胞中隨機選取的HOXA4、HOXC4、RNF13、CHD2在干細胞中mRNA的相對表達量低于非干細胞，尤以CHD2表達量的降低最為明顯。

2.4.2 干細胞和非干細胞KLHL4、HOXC9、CHD2的H3K9me2修飾差異 ChIP-seq結果（圖6）顯示，

HOXC9在干細胞中H3K9me2修飾水平低于非干細胞，而CHD2在干細胞中H3K9me2修飾水平高于非干細胞，KLHL4變化不明顯。與QPCR實驗結果基本相符。

圖5 干細胞和非干細胞中H3K9me2修飾的轉錄因子的mRNA相對表達量

圖6 KLHL4、HOXC9、CHD2在干細胞和非干細胞中H3K9me2的修飾水平

2.5 膠質瘤干細胞基因的GO分析

GO結果（圖7）顯示，膠質瘤干細胞基因主要參與的生物學過程有乳腺腺泡和腺管的發(fā)育、肢體的形成、參與重力反應、肌細胞融合、胚胎消化道的發(fā)生、環(huán)核苷酸分解代謝過程、光的傳入、聯(lián)會復合體的組裝及合胞體的形成；主要參與的細胞組分有軸突的形成、神經肌肉接頭的傳遞及肌肉的收縮、遞質貯存釋放、G蛋白等介導的細胞膜的信號轉導、應激、鉀通道；參與的分子功能主要有腺苷酸環(huán)化酶、MAP激酶、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸磷酸酶、二肽酶、環(huán)GMP磷酸二酯酶、鉀通道和作用于碳-氮鍵水解酶的活性，以及腎上腺素受體、翻譯起始因子、TBP類蛋白的結合。

3 討論

不論是在腫瘤細胞還是普通細胞中，干性都不是一個穩(wěn)定的狀態(tài)［14，15］。被普遍認為的腫瘤干細胞從靜態(tài)變?yōu)閯討B(tài)的說法得到不斷的證實，這種轉變與腫瘤干細胞干性的得失密切相關［16］。在動態(tài)腫瘤干細胞理論中，已分化的腫瘤細胞通過去分化的方式，可重新獲得干細胞特性［17］。腫瘤干細胞的特性主要依賴于特定基因的表達開放與關閉［18］。隨著基因組測序技術的進步和表觀遺傳學迅速的發(fā)展，越來越多的研究者意識到，表觀遺傳學在腫瘤的調控中也占有一席之地［19］。表觀遺傳學包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑和RNA編輯等，它們在基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下調控基因的表達及細胞表型。如組蛋白甲基轉移酶EZH2催化組蛋白形成H3K9me和H3K27me。研究表明，在T細胞淋巴瘤［20］、肝癌、結腸癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤中，上調EZH2的表達水平，腫瘤干細胞數(shù)量增多［21-25］，而藥物阻斷或下調EZH2，則導致腫瘤干細胞的自我增殖能力減弱，致瘤能力抑制［26，27］。

圖7 膠質瘤干細胞基因的GO分析

本實驗主要通過ChIP-Seq方法篩選得到了一批峰值在TSS±2 000 bp范圍內，而且在膠質瘤干細胞中高表達而在非干細胞中低表達的干性基因，例如FEZF2、KLHL4、PRDM13、HOXC9等；QPCR驗證結果顯示干細胞中隨機選取的FOXN3、FEZF2、KLHL4、PRDM13、FAM43B、HOXC9在干細胞中mRNA的相對表達量高于非干細胞，尤其KLHL4、PRDM13的表達量升高明顯，提示在干細胞中

FOXN3、FEZF2、KLHL4、PRDM13、FAM43B、HOXC9的H3K9me2修飾水平低，被抑制的程度弱，因此在干細胞中的表達量增加。而非干細胞中隨機選取的HOXA4、HOXC4、RNF13、CHD2在干細胞中的mRNA的相對表達量卻低于非干細胞，提示在非干細胞中HOXA4、HOXC4、RNF13、CHD2的H3K9me2修飾水平高，被抑制的程度強，因此在干細胞中的表達量降低。此外，GO分析結果顯示，膠質瘤干細胞基因主要參與的生物學過程有乳腺腺泡和腺管的發(fā)育、肢體的形成、參與重力反應、肌細胞融合、胚胎消化道的發(fā)生、環(huán)核苷酸分解代謝過程、光的傳入、聯(lián)會復合體的組裝及合胞體的形成；主要參與的細胞組分有軸突的形成、神經肌肉接頭的傳遞及肌肉的收縮、遞質貯存釋放、G蛋白等介導的細胞膜的信號轉導、應激、鉀通道；參與的分子功能主要有腺苷酸環(huán)化酶、MAP激酶、酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸磷酸酶、二肽酶、環(huán)-GMP磷酸二酯酶、鉀通道和作用于碳-氮鍵水解酶的活性，以及腎上腺素受體、翻譯起始因子、TBP-類蛋白的結合。

4 結論

本研究通過ChIP-seq技術比較了H3K9me2修飾在干細胞與非干細胞中的差異，篩選得到了一批H3K9me2修飾調控的“干性”相關基因：FOXN3、FEZF2、KLHL4、PRDM13、FAM43B、HOXC9等，并對TSS±2 000 bp范圍內的基因進行了GO分析。此外，對隨機選取10個轉錄因子進行QPCR驗證，結果與ChIP-seq基本相符。

［1］ Li YF, Xiao B, Tu SF, et al. Cultivation and identification of colon cancer stem cell-derived spheres from the Colo205 cell line［J］. Braz J Med Biol Res, 2012, 45（3）：197-204.

［2］ Nakanishi Y, Seno H, Fukuoka A, et al. Dclk1 distinguishes between tumor and normal stem cells in the intestine［J］. Nat Genet, 2013, 45（1）：98-103.

［3］ Chen J, Li YJ, Yu TS, et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy［J］. Nature, 2012, 488（7412）：522-526.

［4］ Machado HL, Kittrell FS, Edwards D, et al. Separation by cell size enriches for mammary stem cell repopulation activity［J］. Stem Cells Transl Med, 2013, 2（3）：199-203.

［5］ Driessens G, Beck B, Caauwe A, et al. Defining the mode of tumour growth by clonal analysis［J］. Nature, 2012, 488（7412）：527-530.

［6］ Hinohara K, Kobayashi S, Kanauchi H, et al. ErbB receptor tyrosine kinase/NF-κB signaling controls mammosphere formation in human breast cancer［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109（17）：6584-6589.

［7］ Liao WT, Ye YP, Deng YJ, et al. Metastatic cancer stem cells：from the concept to therapeutics［J］. Am J Stem Cells, 2014, 3（2）：46-62.

［8］ Sharma S, Kelly TK, Jones PA. Epigenetics in cancer［J］. Carcinogenesis, 2010, 31（1）：27-36.

［9］ Wen B, Wu H, Shinkai Y, et al. Large histone H3 lysine 9 dimethylated chromatin blocks distinguish differentiated from embryonic stem cells［J］. Nat Genet, 2009, 41（2）：246-250.

［10］ Zhang J, Gao Q, Li P, et al. S phase-dependent interaction with DNMT1 dictates the role of UHRF1 but not UHRF2 in DNA methylation maintenance［J］. Cell Res, 2011, 21（12）：1723-1739.

［11］ Black JC, Van Rechem C, Whetstine JR. Histone lysine methylation dynamics：establishment, regulation and biological impact［J］. Mol cell, 2012, 48（4）：491-507.

［12］ Mosammaparast N, Shi Y. Reversal of histone methylation-biochemical and molecular mechanisms of histone demethylases［J］. Annu Rev Biochem, 2010, 79（7）：155-179.

［13］ Tao H, Li H, Su Y, et al. Histone methyltransferase G9a and H3K9 dimethylation inhibit the self-renewal of glioma cancer stem cells［J］. Mol Cell Biochem, 2014, 394（1-2）：23-30.

［14］ Sánchez Alvarado A, Yamanaka S. Rethinking differentiation：stem cells, regeneration and plasticity［J］. Cell, 2014, 157（1）：110-119.

［15］ Kreso A, Dick JE. Evolution of the cancer stem cell model［J］. Cell Stem Cell, 2014, 14（3）：275-291.

［16］ Park TS, Donnenberg VS, Donnenberg AD, et al. Dynamic interactions between cancer stem cells and their stromal partners［J］. Current Pathobiology Reports, 2014, 1（2）：41-52.

［17］ Islam F, Qiao B, Smith RA, et al. Cancer stem cell：fundamental

experimental pathological concepts and updates［J］. Exp Mol Pathol, 2015, 98（2）：184-191.

［18］ Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer：the next generation［J］. Cell, 2011, 144（5）：646-674.

［19］ Dawson MA, Kouzarides T. Cancer epigenetics：from mechanism to therapy［J］. Cell, 2012, 150（1）：12-27.

［20］ Simon C, Chagraoui J, Krosl J, et al. A key role for EZH2 and associated genes in mouse and human adult T-cell acute leukemia［J］. Genes Dev, 2012, 26（7）：651-656.

［21］ Hu S, Yu LL, Li ZM, et al. Overexpression of EZH2 contributes to acquired cisplatin resistance in ovarian cancer cells in vitro and in vivo［J］. Cancer Biology & Therapy, 2010, 10（8）：788-795.

［22］ Mallen-St Clair J, Soydaner-Azeloglu R, Lee KE, et al. EZH2 couples pancreatic regeneration to neoplastic progression［J］. Genes Dev, 2012, 26（5）：439-444.

［23］ Au SLK, Wong CCL, Lee JMF, et al. Enhancer of zeste homolog 2 epigenetically silences multiple tumor suppressor microRNAs to promote liver cancer metastasis［J］. Hepatology, 2012, 56（2）：622-631.

［24］ Cai MY, Hou JH, Rao HL, et al. High expression of H3K27me3 in human hepatocellular carcinomas correlates closely with vascular invasion and predicts worse prognosis in patients［J］. Mol Med, 2011, 17（1-2）：12-20.

［25］ Fussbroich B, Wagener N, Macher-Goeppinger S, et al. EZH2 depletion blocks the proliferation of colon cancer cells［J］. PLoS One, 2011, 6（7）：e21651.

［26］ Qi W, Chan H, Teng L, et al. Selective inhibition of Ezh2 by a small molecule inhibitor blocks tumor cells proliferation［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109（52）：21360-21365.

［27］ Chase A, Cross NCP. Aberrations of EZH2 in cancer［J］. Clin Cancer Res, 2011, 17（9）：2613-2618.

（責任編輯 李楠）

Screening of Stem Genes Regulated by H3K9me2 in Tumor Stem Cells

TAO Hong1ZHANG Shao-ping2ZHANG Lin-na1ZHANG Man1HU Qi-kuan1，2
（1.The Department of Physiology，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004；2. Ningxia Key Lab of Cerebrocranial Diseases，the National Key Laboratory Incubation Base，Yinchuan 750004）

In order to analyze and compare the modification differences of the methyltransferase G9a and histone（H3K9me2）between in glioma stem cells and non-stem cells，the related genes maintaining the stem of glioma stem cells were screened. By using G9a inhibitor to facilitate U87 cells into spheres，and G9a overexpression to promote the cell differentiation，the sphered glioma stem cells and monolayer nonstem cells were cultured，and there were significant differences in CD133 expression between the two cell models. Then we used H3K9me2 antibody to compare the differences of H3K9me2 modification between glioma stem cells and non-stem cells via ChIP-seq assay. Genes in the range of TSS ± 2 000 bp among the genes with differences were selected for GO analysis. Moreover，10 transcription factors were randomly selected to confirm the expression level by QPCR，and the result of which was almost consistent with that by ChIP-seq assay.

ChIP-seq；G9a；H3K9me2；Bix01294；U87 cell line

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.030

2016-06-06

國家自然科學基金（31260246，31460300），寧夏醫(yī)科大學校級項目（XY201406）

陶虹，女，碩士，副教授，研究方向：神經生理；E-mail：kellywar2003@163.com

扈啟寬，男，博士，教授，研究方向：神經生理、干細胞；E-mail：huqikuan@163.com