姜莉莉，周瑾潔，王旭東，孫亞琴，修志龍

大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024

微生物菌群發(fā)酵生產(chǎn)化學(xué)品的研究進(jìn)展

姜莉莉，周瑾潔，王旭東，孫亞琴，修志龍

大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024

姜莉莉, 周瑾潔, 王旭東, 等. 微生物菌群發(fā)酵生產(chǎn)化學(xué)品的研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(11): 1496-1506.

Jiang LL, Zhou JJ, Wang XD, et al. Progress in chemicals production by microbial consortia. Chin J Biotech, 2016, 32(11): 1496-1506.

廉價(jià)生物質(zhì)資源的利用是工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，復(fù)雜的成分和較多的雜質(zhì)使傳統(tǒng)的單菌發(fā)酵方式難以應(yīng)對(duì)，成為產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵問(wèn)題。文中從微生物菌群的工業(yè)應(yīng)用、微生物菌群發(fā)酵與純種發(fā)酵的比較、微生物細(xì)胞間的相互作用等方面綜述了微生物菌群發(fā)酵技術(shù)的最新研究進(jìn)展，并對(duì)微生物菌群的設(shè)計(jì)和應(yīng)用進(jìn)行了展望。微生物菌群發(fā)酵可以充分利用廉價(jià)生物質(zhì)基質(zhì)、生產(chǎn)多個(gè)產(chǎn)品或減少副產(chǎn)物的生成，在生物基化學(xué)品和燃料的生產(chǎn)中將是一種有前景的發(fā)酵技術(shù)。

工業(yè)微生物組學(xué)，微生物菌群，發(fā)酵，生物質(zhì)，生物煉制，生物基化學(xué)品，生物燃料

人類一直與微生物群落一起生活，人體腸道微生物細(xì)胞的數(shù)量甚至超過(guò)了其他細(xì)胞總量，但我們對(duì)自身和環(huán)境中微生物群落的組成和功能知之甚少，至今未培養(yǎng)的微生物仍占自然界中微生物的90%以上。為此美國(guó)48位科學(xué)家聯(lián)合在《科學(xué)》周刊上提出開(kāi)展“聯(lián)合微生物組計(jì)劃 (Unified Microbiome Initiative，簡(jiǎn)稱UMI)”的建議，開(kāi)展對(duì)人體、植物、動(dòng)物、土壤和海洋等幾乎所有微生物組的研究，并希望美國(guó)能將其與“精準(zhǔn)醫(yī)療”和“腦科學(xué)”兩大科學(xué)計(jì)劃予以同樣的重視[1]。與此同時(shí)來(lái)自德國(guó)、美國(guó)和中國(guó)的3位科學(xué)家在《自然》周刊上呼吁，在UMI基礎(chǔ)上啟動(dòng)“國(guó)際微生物組計(jì)劃 (IMI)”，建議所有相關(guān)學(xué)科的專家一起合作，使不同國(guó)家和研究領(lǐng)域能夠共享標(biāo)準(zhǔn)，從而實(shí)現(xiàn)資源的整合[2]。微生物組學(xué) (Microbiome) 是研究土壤、湖泊、腸道等生態(tài)環(huán)境下微生物菌落與陸生、水生動(dòng)植物的生長(zhǎng)以及人類疾病和健康之間關(guān)系的新興學(xué)科，研究主旨是揭示微生物多樣性與人和生態(tài)穩(wěn)定性之間的關(guān)系。微生物組學(xué)可以應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)和醫(yī)藥等領(lǐng)域，工業(yè)微生物組學(xué)研究的對(duì)象是在食品、輕工、環(huán)境、能源、化工等工業(yè)領(lǐng)域得到應(yīng)用的微生物菌群。

人類對(duì)微生物資源的利用經(jīng)歷過(guò)天然混菌發(fā)酵和純種發(fā)酵兩個(gè)階段，已有幾千年歷史的傳統(tǒng)食品，如奶酪、酸菜、釀酒、大醬等的發(fā)酵生產(chǎn)是多種微生物 (如細(xì)菌和真菌) 共同作用的結(jié)果；為了避免發(fā)酵過(guò)程中染菌以及產(chǎn)物中帶有病原微生物，混菌發(fā)酵逐漸被純種發(fā)酵所替代。微生物純培養(yǎng)技術(shù)使研究者擺脫了多種微生物共存的復(fù)雜局面，能夠不受干擾地對(duì)單一菌株進(jìn)行研究，從而使人們對(duì)微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化和遺傳特性有了更為深入的認(rèn)識(shí)，是微生物學(xué)發(fā)展的一個(gè)巨大進(jìn)步，也是生物化學(xué)工程和現(xiàn)代生物技術(shù)的里程碑。目前多數(shù)生物技術(shù)產(chǎn)品，如氨基酸、有機(jī)酸、抗生素和酶等都是利用純培養(yǎng)的微生物細(xì)胞生產(chǎn)的[3]，但是自然環(huán)境中90%以上的微生物不能用現(xiàn)有的生物技術(shù)來(lái)培養(yǎng)，而且利用純種培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)生物基能源和化學(xué)品存在著基質(zhì)成本高、產(chǎn)物分離困難[4]、有機(jī)酸或醇類等副產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有毒害作用[5]等難題。

面對(duì)微生物純種培養(yǎng)技術(shù)的缺陷，人們對(duì)微生物發(fā)酵方式進(jìn)行了重新思考。近年來(lái)，在純種培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的共培養(yǎng)(Co-culture) 或混合培養(yǎng)生物技術(shù) (Mixed culture biotechnology，MCB)，是將兩種或以上的微生物 (絕大多數(shù)是兩種微生物) 在無(wú)菌條件下進(jìn)行混合培養(yǎng)，利用特定的不同微生物的生長(zhǎng)和代謝特點(diǎn)進(jìn)行發(fā)酵的生物技術(shù)。共培養(yǎng)發(fā)酵的典型應(yīng)用是生產(chǎn)維生素C前體2-酮基-L-古龍酸 (2-keto-L-gulonic acid，2-KLG)，這種混合菌系最為常用的是普通生酮基古龍酸菌 (俗稱小菌) 和巨大芽孢桿菌 (俗稱大菌)，其中小菌胞內(nèi)分泌的L-山梨糖脫氫酶和L-山梨酮脫氫酶經(jīng)過(guò)兩步反應(yīng)可以將L-山梨糖轉(zhuǎn)化成2-KLG，大菌可以作為小菌的伴生菌，縮短小菌生長(zhǎng)的延遲期，促進(jìn)小菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸[6]。為了進(jìn)一步克服單菌的局限性，并能夠適應(yīng)復(fù)雜的基質(zhì)和粗放的環(huán)境，利用微生物菌群 (Microbial consortium) 進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)日益成為新的研究熱點(diǎn)。該技術(shù)是天然混菌發(fā)酵的工業(yè)應(yīng)用，是基于生態(tài)選擇的原則將能夠利用復(fù)雜基質(zhì)、產(chǎn)物范圍特殊的菌群保留在反應(yīng)器或發(fā)酵罐中持續(xù)使用，因此有助于降低基質(zhì)成本和產(chǎn)物分離的成本，并且培養(yǎng)過(guò)程通常無(wú)需滅菌操作。微生物菌群中通常含有一些未知的或未培養(yǎng)的微生物，其作用尚不清楚。微生物菌群在環(huán)境修復(fù)、能源生產(chǎn)中表現(xiàn)出極強(qiáng)的優(yōu)越性，如活性污泥處理廢水、生產(chǎn)沼氣等。

生物煉制 (Biorefinery) 是利用可再生的生物質(zhì)資源為原料，經(jīng)過(guò)物理、化學(xué)、生物及其集成方法加工成化學(xué)品的過(guò)程，所涉及的技術(shù)也稱為工業(yè)生物技術(shù)。我國(guó)新近公布的《中國(guó)制造2025》規(guī)劃中明確提出，構(gòu)建“高效、清潔、低碳、循環(huán)”的綠色制造體系[7]。生物煉制的宗旨是將廉價(jià)原料“吃干榨凈”，將發(fā)酵產(chǎn)物充分利用。廉價(jià)原料的多樣性，如木質(zhì)纖維素、粗甘油、糖蜜、農(nóng)產(chǎn)品加工廢棄物等，以及組成的復(fù)雜性，如玉米秸稈等木質(zhì)纖維素水解液中含有五碳糖、六碳糖、酸、醛、酚、鹽等十幾種組分，這些原料用于發(fā)酵生產(chǎn)使傳統(tǒng)的單菌單底物發(fā)酵模式難以應(yīng)對(duì)，出現(xiàn)原料利用不充分(多數(shù)菌偏愛(ài)六碳糖)、原料中的酸、醛、酚、鹽抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)物難以分離等難題[8]。農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)或加工過(guò)程的廢棄物或低值原料的高效利用是生物煉制的重要任務(wù)，發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物的分離提取或生物轉(zhuǎn)化是生物煉制亟待解決的另一個(gè)問(wèn)題。為了解決廉價(jià)原料難以利用、底物轉(zhuǎn)化率低、副產(chǎn)物多、發(fā)酵和分離成本高等產(chǎn)業(yè)化難題，微生物菌群發(fā)酵技術(shù)有望勝任廉價(jià)原料的工業(yè)化生產(chǎn)，受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。

1 微生物菌群在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

微生物菌群在傳統(tǒng)食品，如奶酪、酸菜、釀酒、大醬等發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用已有上千年的歷史了，在生物能源 (如生物氣或沼氣、生物氫氣、燃料乙醇等)、生物基化學(xué)品 (如1,3-丙二醇)、生物材料 (如聚羥基脂肪酸酯) 等工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)品生產(chǎn)中也有應(yīng)用或研發(fā)。

1.1 生物氣

生物氣 (沼氣) 是在厭氧微生物菌群的作用下將有機(jī)廢棄物轉(zhuǎn)化成甲烷、H2、CO2等氣體的混合物，菌群中有一些菌需要特殊的生長(zhǎng)條件，如一定的氫分壓，所以它們很難通過(guò)傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)。Nishio和Nakashimada[9]利用兩步法來(lái)處理富含糖的廢水和面包垃圾。在這個(gè)過(guò)程中面包垃圾先在55 ℃下經(jīng)嗜熱厭氧污泥發(fā)酵轉(zhuǎn)化成氫氣和揮發(fā)性脂肪酸 (主要是乙酸和丁酸)，然后在第二階段中產(chǎn)生甲烷氣體。與此類似，另一個(gè)日本研究團(tuán)隊(duì)建立了中試規(guī)模的利用有機(jī)垃圾生產(chǎn)氫氣和甲烷的兩階段發(fā)酵過(guò)程[10]。一個(gè)嗜熱微生物菌群在60 ℃下以垃圾和廢紙為基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生氫氣和甲烷。盡管整個(gè)過(guò)程在不滅菌的條件下進(jìn)行，但嗜熱過(guò)程有效地降低了染菌的機(jī)率。

1.2 生物氫氣

近年來(lái)，利用混菌厭氧發(fā)酵有機(jī)廢物來(lái)生產(chǎn)氫氣受到了顯著重視。氫氣在化學(xué)工業(yè)中應(yīng)用廣泛，如合成胺類、醇類、醛類等，同時(shí)氫氣也是一種理想的燃料，其燃燒后只產(chǎn)生水。因此許多能源學(xué)家認(rèn)為氫氣將成為代替石化燃料的下一代能源[11]。目前，制約微生物厭氧發(fā)酵制氫的主要因素是氫氣的產(chǎn)量較低。由于生物化學(xué)和熱力學(xué)的限制，氫氣的最大理論摩爾數(shù)是4 mol/mol葡萄糖，但實(shí)際混菌發(fā)酵過(guò)程中由于存在消耗氫的微生物如產(chǎn)甲烷菌、同型產(chǎn)乙酸菌等，使得氫氣的產(chǎn)率通常不超過(guò)2 mol/mol葡萄糖[12]。現(xiàn)在已有研究通過(guò)堿、酸、熱等前處理方法來(lái)使上述消耗氫的微生物失活，其中熱處理的效果最好，但是對(duì)同型產(chǎn)乙酸菌不是很有效[12-13]。由于菌群復(fù)雜性，生成H2所經(jīng)歷的胞內(nèi)代謝途徑也較復(fù)雜。Lee等[14]學(xué)者通過(guò)電子流和還原力NADH2平衡成功預(yù)測(cè)了生產(chǎn)H2的混合菌群結(jié)構(gòu)模型，并與基于基因文庫(kù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基本匹配。該研究成功地將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與理論研究結(jié)合，預(yù)測(cè)出在pH 3.5條件下混合菌群生產(chǎn)H2歷經(jīng)的基本代謝途徑：丙酮酸脫羧-鐵氧還原蛋白氫化酶途徑，為后續(xù)研究提供了堅(jiān)實(shí)的理論支持。除了葡萄糖，Mangayil等[15]利用粗甘油為底物，利用活性污泥中篩選的混菌生產(chǎn)H2也取得良好效果，H2摩爾轉(zhuǎn)化率可達(dá)到1.1 mol H2/mol甘油。馬茜嵐等[16]采用硫酸纖維鈉/聚二甲基二烯丙基氯化銨微膠囊體系固定混合產(chǎn)氫菌群，構(gòu)建成一個(gè)能高效產(chǎn)氫的虛擬“細(xì)胞工廠”。該方法有效地增加了菌群對(duì)溫度的適應(yīng)能力，提高了底物濃度，氫氣產(chǎn)率保持在1.73?1.81 mol H2/mol葡萄糖，平均產(chǎn)氫速率提高了198.6%。

1.3 燃料乙醇

乙醇被視為替代和節(jié)約汽油的最佳燃料，具有廉價(jià)、清潔、環(huán)保、安全和可再生等優(yōu)點(diǎn)[17]。目前，研究的熱點(diǎn)是利用非糧食原料，如農(nóng)業(yè)秸稈等生產(chǎn)乙醇。木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物主要是由葡萄糖、甘露糖、半乳糖等六碳糖和木糖、阿拉伯糖等五碳糖組成，水解液中還含有多種有毒性副產(chǎn)物，如酚、酸、醛等[8]，傳統(tǒng)的釀酒酵母純培養(yǎng)技術(shù)無(wú)法對(duì)其高效利用轉(zhuǎn)化。Du等[18]從16個(gè)不同的天然微生物菌群中篩選出了一組可以相對(duì)高效地生產(chǎn)乙醇 (7 g/L的纖維素可以產(chǎn)生2.06 g/L的乙醇，55 ℃，6 d) 的天然菌群，并對(duì)16個(gè)微生物菌群的結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)微生物菌群的組成影響纖維素生產(chǎn)乙醇的性能。杜然等[19]通過(guò)限制性培養(yǎng)條件和連續(xù)繼代培養(yǎng)，篩選獲得了一組具有高效穩(wěn)定降解纖維素能力的復(fù)合菌群H。當(dāng)pH 6-9時(shí)，3 d可以完全降解置于100 mL PCS緩沖液培養(yǎng)基中的濾紙，并產(chǎn)生1.54 g/L 乙醇。自然界中的微生物菌群能夠產(chǎn)生多種纖維素酶，可以適應(yīng)不同木質(zhì)纖維素的降解要求，例如有研究人員對(duì)不同食草哺乳動(dòng)物的糞便樣本進(jìn)行微生物組學(xué)分析，從中分離出3種新的腸道微生物：厭氧鞭菌屬Anaeromyces robustus、新美鞭菌屬Neocallimastix californiae和梨囊鞭菌屬Piromyces finnis[20]。這些微生物細(xì)胞分泌的酶具有很強(qiáng)的分解木質(zhì)纖維素的能力，尤其是P. finnis分泌的酶分解植物細(xì)胞壁的能力比市售酶高出3倍。因此利用微生物菌群生產(chǎn)纖維素乙醇是一種非常有前景的方法。

1.4 1,3-丙二醇

1,3-丙二醇 (1,3-PD) 作為聚對(duì)苯二甲酸丙二酯 (PTT) 和聚呋喃二甲酸丙二酯 (PTF) 的單體，市場(chǎng)需求量逐年增多。傳統(tǒng)微生物發(fā)酵法是利用純培養(yǎng)法生產(chǎn)1,3-PD，如利用天然菌株以甘油為底物或者利用基因工程大腸桿菌以葡萄糖為底物來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD[21-24]。隨著生物柴油副產(chǎn)物——粗甘油產(chǎn)量的日益增加，使得轉(zhuǎn)化粗甘油生產(chǎn)1,3-PD越來(lái)越受到人們的重視。粗甘油通常含有醇類、鹽類、酯或脂類、色素等雜質(zhì)，一般需要純化后才能用于純培養(yǎng)過(guò)程，無(wú)疑增加了生產(chǎn)成本[25]。近年來(lái)人們開(kāi)始關(guān)注利用混菌發(fā)酵粗甘油生產(chǎn)1,3-PD，一些研究小組已證明該方法是可行的[12,26-32]。Dietz等[27]從污水處理廠的活性污泥中篩選出能夠發(fā)酵甘油生產(chǎn)1,3-PD的混合菌群。1,3-PD的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到0.56-0.76 mol/mol甘油，在批次流加實(shí)驗(yàn)中1,3-PD的濃度高達(dá)70 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到2.6 g/(L·h)。研究結(jié)果表明在不滅菌條件下與無(wú)菌條件下具有相同水平的1,3-PD的產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度。Daria等[32]學(xué)者通過(guò)利用丁酸梭菌Clostridium butyricum DSP1在1,3-PD純培養(yǎng)過(guò)程中加入另一株具有代謝副產(chǎn)物有機(jī)酸功能的糞產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes faecalis JP1構(gòu)成共培養(yǎng)體系，1,3-PD的質(zhì)量轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.53 g/g，同時(shí)大部分副產(chǎn)物有機(jī)酸降解，顯著降低后期分離成本。這種新型混菌培養(yǎng)方式為生物基化學(xué)品生產(chǎn)過(guò)程中目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化提供了新的解決思路。

1.5 聚羥基脂肪酸酯

聚羥基脂肪酸酯 (Polyhydroxyalkanoates，PHA) 是微生物合成的一種細(xì)胞內(nèi)聚酯，是一種天然的高分子生物材料。因PHA同時(shí)具有良好的生物相容性、生物可降解性和塑料的熱加工性，可以作為生物醫(yī)用材料和生物可降解包裝材料，已成為近年來(lái)生物材料領(lǐng)域最為活躍的研究熱點(diǎn)。純培養(yǎng)生產(chǎn)PHA的缺點(diǎn)包括：利用純底物和細(xì)菌的無(wú)菌預(yù)培養(yǎng)成本高；生產(chǎn)過(guò)程中需要進(jìn)行無(wú)菌操作。而混菌發(fā)酵沒(méi)有滅菌要求，可以顯著地降低成本。Moita等[33]利用混菌發(fā)酵粗甘油來(lái)生產(chǎn)PHA。研究表明篩選的混合菌群可以直接利用粗甘油，而不用對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，降低了生產(chǎn)成本，增加了經(jīng)濟(jì)上的競(jìng)爭(zhēng)力。

2 微生物菌群發(fā)酵與純種發(fā)酵的比較

與傳統(tǒng)純種發(fā)酵相比，微生物菌群發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在：1) 原料的多樣性：更為廉價(jià)、復(fù)雜的基質(zhì)，如木質(zhì)纖維素、乳清、糖蜜、粗甘油、馬鈴薯加工廢水、玉米浸泡液等，都可以成為發(fā)酵原料用于生產(chǎn)化學(xué)品；2) 產(chǎn)物的多樣化或單一化：通過(guò)協(xié)調(diào)菌群組成既可以利用不同微生物的代謝途徑獲得多個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物，又可以使產(chǎn)物范圍變窄，利于下游物質(zhì)分離純化，降低成本；3) 操作的簡(jiǎn)易性和安全性：微生物菌群具有很高的生物多樣性，可以在不滅菌的條件下操作，抗噬菌體感染能力和生產(chǎn)操作上的安全性得以提升。

以1,3-丙二醇 (1,3-PD) 的生物法生產(chǎn)為例對(duì)微生物菌群發(fā)酵和純種發(fā)酵進(jìn)行比較，見(jiàn)表1。目前，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-PD的研究還主要集中在菌株的篩選[34-36]、工程菌的構(gòu)建[24]以及發(fā)酵條件的優(yōu)化[37-38]等方面，這些都是以微生物純培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)。微生物純種發(fā)酵過(guò)程需要進(jìn)行嚴(yán)格的無(wú)菌操作，使用的原料具有一定的純度，這都增加了生物法生產(chǎn)1,3-PD的成本。此外，在利用微生物純種發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD的過(guò)程中，由于需要平衡反應(yīng)過(guò)程中的還原力，常伴隨乙酸、乳酸、琥珀酸等有機(jī)酸和其他副產(chǎn)物的產(chǎn)生。有機(jī)酸的積累常常抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，并且降低基質(zhì) (甘油) 轉(zhuǎn)化為1,3-PD的收率，副產(chǎn)物的存在也為下游產(chǎn)品的分離純化帶來(lái)了困難。為了克服純種發(fā)酵的缺點(diǎn)，進(jìn)一步降低生物法生產(chǎn)1,3-PD的成本，微生物菌群發(fā)酵近年來(lái)受到了越來(lái)越多的關(guān)注。

在微生物菌群發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵甘油產(chǎn)生的有機(jī)酸可以被同一個(gè)反應(yīng)器或后續(xù)階段中的產(chǎn)甲烷菌轉(zhuǎn)化為甲烷排放出去[43]。Temudo等[28]從酒廠廢水和土豆淀粉加工廠的污泥中篩選出了可以利用甘油生產(chǎn)1,3-PD的混合菌群。該菌群的甘油利用濃度為4?25 g/L，主產(chǎn)物為乙醇，1,3-PD的轉(zhuǎn)化率僅為0.16 mol/mol。雖然該研究的產(chǎn)業(yè)化價(jià)值不大，但是為工業(yè)生產(chǎn)1,3-PD提供了一種新的思路，也是對(duì)純種發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD的一種新的突破和挑戰(zhàn)。

近年來(lái)，我們課題組從大連海岸海泥中篩選出了一組兼性微生物菌群 (GenBank Accession No. SRP066989)。該菌群可以將甘油轉(zhuǎn)化為1,3-PD，并且具有良好的底物耐受性，間歇發(fā)酵甘油的初始濃度可達(dá)200 g/L，1,3-PD產(chǎn)量達(dá)到81.40 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為0.63 mol/mol；且發(fā)酵產(chǎn)物中副產(chǎn)物較少，尤其是不含2,3-丁二醇，有利于主產(chǎn)物1,3-PD的分離[42]。我們課題組還從厭氧活性污泥中篩選出一組天然微生物菌群C2-2M，可以高效轉(zhuǎn)化粗甘油為1,3-PD。經(jīng)16S rRNA基因檢測(cè)，C2-2M以丁酸梭菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌 (97.34%)，還含雙酶梭菌 (0.81%)、谷糠乳桿菌 (0.01%) 及未鑒定梭菌屬(1.82%)。批式流加發(fā)酵結(jié)果表明，連續(xù)補(bǔ)料能生成85.21 g/L 1,3-PD，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.73 mol/mol，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.73 g/(L·h)，副產(chǎn)物為8.52 g/L乙酸及16.11 g/L丁酸。微生物菌群發(fā)酵克服了單一菌株底物耐受性差、副產(chǎn)物多的缺點(diǎn)，提高了生產(chǎn)效率，為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-丙二醇的工業(yè)化提供了簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的發(fā)酵工藝。

3 微生物菌群中細(xì)胞間的相互作用

在同一生態(tài)環(huán)境中微生物之間不僅有營(yíng)養(yǎng)上的協(xié)同與競(jìng)爭(zhēng)，還有代謝產(chǎn)物之間的相互影響。在微生物菌群中，同種微生物細(xì)胞之間可以通過(guò)群體感應(yīng)效應(yīng) (Quorum sensing，QS) 來(lái)進(jìn)行信號(hào)傳遞，不同種微生物細(xì)胞間則可通過(guò)互利共生、協(xié)同作用、競(jìng)爭(zhēng)作用等相互作用影響混菌體系中代謝物質(zhì)的類型和目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。

表1 微生物菌群發(fā)酵與純種發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇的比較Table 1 Comparison of 1,3-propanediol production by microbial consortia and pure cultures

3.1 群體感應(yīng)效應(yīng)

群體感應(yīng)效應(yīng)是一種依賴細(xì)胞密度大小進(jìn)行信息交流，調(diào)節(jié)微生物細(xì)胞間相互作用的基因調(diào)控機(jī)制。微生物細(xì)胞能夠自發(fā)產(chǎn)生和釋放一些特定的信號(hào)分子并感知其濃度變化，從而調(diào)節(jié)微生物的群體行為。將高密度細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)收集的無(wú)菌上清液加入到低細(xì)胞密度的培養(yǎng)液中，會(huì)誘發(fā)效應(yīng)基因的表達(dá)[44]。革蘭氏陰性菌普遍使用酰基高絲氨酸內(nèi)酯 (N-acylhomoserine lactones，AHLs) 作為群感效應(yīng)信號(hào)分子，而革蘭氏陽(yáng)性菌則使用短肽[45]。在所有的群感效應(yīng)系統(tǒng)中信號(hào)分子都是在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，再轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外環(huán)境中。小分子的高絲氨酸內(nèi)酯會(huì)通過(guò)自由擴(kuò)散的方式跨過(guò)細(xì)菌的細(xì)胞膜，而肽類和大分子量的高絲氨酸內(nèi)酯則需要通過(guò)泵進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。隨著細(xì)胞密度的增加，信號(hào)分子的濃度不斷積累并對(duì)周圍細(xì)胞產(chǎn)生影響。當(dāng)信號(hào)分子的濃度達(dá)到一定閾值時(shí)，會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)結(jié)果：一是激活信號(hào)感應(yīng)和效應(yīng)調(diào)節(jié)子用于信號(hào)分子的傳導(dǎo)，進(jìn)而觸發(fā)多個(gè)基因的表達(dá)；二是激活自動(dòng)誘導(dǎo)正反饋來(lái)擴(kuò)大信號(hào)分子的產(chǎn)生。張志偉和吳勝[46]通過(guò)在大腸桿菌群落中建立信號(hào)分子高絲氨酸內(nèi)酯 (AHL) 介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞交流機(jī)制，在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的AHL積累到一定濃度啟動(dòng)靶基因表達(dá)，通過(guò)在細(xì)胞生長(zhǎng)的不同階段啟動(dòng)AHL降解酶的表達(dá)，控制環(huán)境中信號(hào)分子AHL的濃度水平，從而控制靶基因的轉(zhuǎn)錄效率，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)靶蛋白表達(dá)水平的精確控制。肽類和一些高絲氨酸內(nèi)酯類信號(hào)分子通過(guò)膜受體引發(fā)磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而控制靶基因的表達(dá)[47]。簡(jiǎn)而言之，群體感應(yīng)效應(yīng)的作用就是保證了細(xì)胞在表達(dá)特定功能之前達(dá)到一定的密度。

3.2 互利共生和協(xié)同作用

互利共生是指兩種微生物在一起，彼此有利，兩者分開(kāi)以后雙方的生活都要受到很大影響，甚至死亡。在混菌發(fā)酵工藝中，有很多互利共生關(guān)系的例子。如厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷過(guò)程中，細(xì)菌和古細(xì)菌就是互利共生的關(guān)系[48]。在乳制品產(chǎn)業(yè)中，利用嗜熱鏈球菌Streptococcus thermophilus和德氏乳桿菌保加利亞亞種Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus來(lái)生產(chǎn)酸奶。與純培養(yǎng)相比，兩者的合作關(guān)系對(duì)產(chǎn)品的品質(zhì)和穩(wěn)定性具有重要的影響[49]。

協(xié)同作用是微生物互利共生關(guān)系的一種表現(xiàn)形式，在利用微生物菌群進(jìn)行有機(jī)物降解過(guò)程中尤為重要。Du等[18]從自然界中篩選出可以降解纖維素生產(chǎn)乙醇的微生物菌群，通過(guò)對(duì)菌群結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)了一株假黃單胞菌Pseudoxanthomonas taiwanensis。盡管該菌沒(méi)有產(chǎn)生乙醇的能力，但是具有分泌葡萄糖苷酶的能力，其在纖維素利用上具有很重要的作用。該菌的存在有利于纖維素的降解及乙醇的產(chǎn)量提高，并對(duì)菌群的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。Kato等[50]從堆肥中富集了可以降解纖維素的微生物菌群并從中分離了兩種菌株：一種是在厭氧條件下水解纖維素的梭狀芽孢桿菌Clostridium straminisolvens CSK1，另一種是不具有水解纖維素能力的好氧菌。在纖維素降解過(guò)程中由于好氧菌創(chuàng)造了厭氧環(huán)境并消耗代謝產(chǎn)物，因此好氧菌的存在對(duì)纖維素的降解起著至關(guān)重要的作用。

3.3 競(jìng)爭(zhēng)作用和拮抗作用

競(jìng)爭(zhēng)作用是微生物在菌群中競(jìng)爭(zhēng)有限的自然資源和空間，被認(rèn)為是促進(jìn)抗菌物質(zhì)生物合成的選擇性壓力。在自然環(huán)境中，某種微生物通常利用產(chǎn)生抗菌物質(zhì)來(lái)抑制不同競(jìng)爭(zhēng)者的生長(zhǎng)來(lái)達(dá)到生存的目的。實(shí)際上，抗菌物質(zhì)一直是個(gè)備受爭(zhēng)議的話題，有些研究者認(rèn)為這些物質(zhì)的真正作用是作為一種中間信號(hào)分子[51]。另有研究表明在混菌發(fā)酵生產(chǎn)乳制品中微生物的生長(zhǎng)速率和菌群動(dòng)力學(xué)主要是由氨基酸的利用能力決定的[52]。

拮抗作用是指一種微生物對(duì)其他微生物產(chǎn)生有害影響，但對(duì)自身沒(méi)有影響。這種情況常常發(fā)生在食品發(fā)酵過(guò)程中，微生物菌群會(huì)有效抑制病原微生物的生長(zhǎng)[53]。另外，產(chǎn)乳酸的細(xì)菌在食物發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)，在混合菌群動(dòng)力學(xué)中具有重要的作用。

關(guān)于協(xié)同和競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系在微生物菌群穩(wěn)定性方面起何作用一直是個(gè)懸而未決的問(wèn)題，最近有研究人員用數(shù)學(xué)模型證明不同種類細(xì)胞之間的協(xié)作關(guān)系會(huì)擾亂菌群生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，而益生菌間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系反而會(huì)通過(guò)負(fù)反饋抵消菌群多樣性造成的不穩(wěn)定，從而使腸道生態(tài)系統(tǒng)保持穩(wěn)定[54]，這一論斷與先前人們的推測(cè)或想象恰好相反，需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 微生物菌群的設(shè)計(jì)與應(yīng)用展望

整合生物工藝 (Consolidated bioprocessing，CBP) 在生物能源和化學(xué)品的研發(fā)中形成并不斷完善，即在一步生物過(guò)程中整合所有的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)[55]。傳統(tǒng)的CBP策略是利用基因工程菌，將所需要的功能集中在一個(gè)菌體上。然而，許多實(shí)驗(yàn)證明在一個(gè)微生物中設(shè)計(jì)并優(yōu)化多種功能挑戰(zhàn)性很大。盡管經(jīng)歷了幾十年的研究，真正應(yīng)用于商業(yè)化的例子卻很少。同樣近幾年新興的合成生物學(xué)也面臨著類似的巨大挑戰(zhàn)。

與CBP利用基因工程菌的策略相比，在絕大多數(shù)的自然環(huán)境中微生物以菌群的形式存在，每一種微生物都行使著特定的功能，相互合作、共同生活。自然界中的微生物菌群具有許多吸引人的特點(diǎn)，如菌群穩(wěn)定性、功能魯棒性、底物廣譜性、可以進(jìn)行復(fù)雜工作等。正是受到了自然菌群特點(diǎn)的啟發(fā)，人們對(duì)微生物菌群的設(shè)計(jì)和應(yīng)用產(chǎn)生了濃厚的興趣，而設(shè)計(jì)微生物菌群也逐漸成為合成生物學(xué)的前沿問(wèn)題。Brenner等[56]對(duì)設(shè)計(jì)不同微生物間的交流方式來(lái)構(gòu)建人工微生物菌群的相關(guān)研究進(jìn)行了綜述。這些人工微生物菌群可以用來(lái)研究在最小的菌群中種間的相互作用關(guān)系 (如共生、競(jìng)爭(zhēng)和寄生) 或在特定條件下模擬微生物間的相互作用關(guān)系。另外，還可以通過(guò)數(shù)學(xué)模型來(lái)描述這些成分確定的人工菌群，并用于更為復(fù)雜系統(tǒng)模型的開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證。在工業(yè)生物技術(shù)的應(yīng)用上，從自然界中篩選合適的微生物菌株并把它們組合在一起行使新的功能將更具吸引力、也更具潛力。

隨著人們對(duì)微生態(tài)關(guān)系的積極探索和了解，微生物菌群的優(yōu)勢(shì)正逐漸被人們所重視，并在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品等諸多領(lǐng)域得到拓展和應(yīng)用，但是仍然存在一些亟待解決的問(wèn)題，如新的微生物菌群培養(yǎng)技術(shù)、菌種的定量和定性分析工具、菌種間相互作用的確定、細(xì)胞交流和信號(hào)分子的研究方法、數(shù)學(xué)模型的構(gòu)建等。尤其是微生物菌群的功能基因組研究和系統(tǒng)生物學(xué)都處于剛剛起步的階段，許多技術(shù)和概念上的問(wèn)題需要解決。在此基礎(chǔ)上，包含確定的或者幾個(gè)菌種的小型微生物菌群具有很好的應(yīng)用前景，它們可以作為方法和技術(shù)發(fā)展的模式系統(tǒng)，并有利于用合成生物學(xué)的方法設(shè)計(jì)微生物菌群。綜上所述，對(duì)微生物菌群進(jìn)行深入研究，不僅具有深遠(yuǎn)的理論意義，更具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，能更多地造福人類，極具發(fā)展?jié)摿Α?/p>

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Progress in chemicals production by microbial consortia

Lili Jiang, Jinjie Zhou, Xudong Wang, Yaqin Sun, and Zhilong Xiu
School of Life Science and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China

Using cheap biomass resources is a hotspot of research on industrial biotechnology. It is difficult for traditional fermentations with single strain to treat so complex components and more impurities, which becomes the key problem in industrialization. In this review, some existing industrial bioprocesses involving microbial consortia were described. Comparison of 1,3-propanediol production by microbial consortia and pure cultures were then introduced and the relationship between cells in microbial consortia were summarized. Finally, the perspective was also addressed to design and apply microbial consortia in the future.

industrial microbiome, microbial consortia, fermentation, biomass, biorefinery, bio-based chemicals, biofuels

February 16, 2016; Accepted: May 6, 2016

Zhilong Xiu. Tel: +86-158-41165970; Fax: +86-411-84706369; E-mail: zhlxiu@dlut.edu.cn

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 21476042), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. SQ2011AAZY2805-2).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 21476042)，國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. SQ2011AAZY2805-2) 資助。

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