朱舟，韓靜，張遐，徐逸

（1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)科，武漢 430030；2陜西師范大學(xué)現(xiàn)代教學(xué)技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710061；3加拿大渥太華大學(xué) IMHR，渥太華 K1Z7H3；4華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院整形外科，武漢 430030）

I型大麻素受體介導(dǎo)大麻素HU210對(duì)星型膠質(zhì)細(xì)胞CXCR4水平下調(diào)

朱舟1，韓靜2，張遐3，徐逸4*

（1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)科，武漢 430030；2陜西師范大學(xué)現(xiàn)代教學(xué)技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710061；3加拿大渥太華大學(xué) IMHR，渥太華 K1Z7H3；4華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院整形外科，武漢 430030）

目的 探尋大麻素抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應(yīng)的機(jī)制，為大麻素臨床藥物的合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法用不同濃度的HU210刺激培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，利用Western blot檢測(cè)并比較刺激組和未刺激組細(xì)胞CXCR4蛋白水平的差異，進(jìn)而用I型大麻素受體（type-1 cannabinoid receptor，CB1R）拮抗劑AM281刺激細(xì)胞后，觀察HU210對(duì)CXCR4表達(dá)的影響。結(jié)果 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，高濃度HU210能下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞CXCR4表達(dá)，AM28能阻斷HU210所致的CXCR4下調(diào)。結(jié)論 HU210經(jīng)由CB1R下調(diào)CXCR4，這可能是大麻發(fā)揮免疫抑制作用的機(jī)理之一。

大麻素；1型大麻素受體；CXCR4；星形膠質(zhì)細(xì)胞

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）是趨化因子 CXC亞家族的一員，其受體為CXCR4。在中樞神經(jīng)系統(tǒng) SDF-1／CXCR4對(duì)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的遷移／分化和生存起重要的作用［1，2］。膠質(zhì)細(xì)胞的 CXCR4與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性反應(yīng)和神經(jīng)毒性反應(yīng)密切相關(guān)。在多發(fā)性硬化、Alzheimer病及腦腫瘤的病理過(guò)程中，星形膠質(zhì)細(xì)胞、白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的CXCR4表達(dá)明顯增高［3，4］。另外，作為HIV病毒的中樞神經(jīng)系統(tǒng)受體之一［5，6］，CXCR4參與HIV導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡和癡呆［7，8］。因此，阻斷CXCR4受體，可能是潛在的神經(jīng)保護(hù)途徑。

越來(lái)越多研究已經(jīng)證實(shí)大麻素能抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)，緩解多發(fā)性硬化、腦卒中等疾病的進(jìn)展［9-12］，但其機(jī)制尚不明確。為了揭示大麻素抑制免疫功能的機(jī)制，為大麻素臨床藥物的合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，我們利用人工合成大麻素HU210和I型大麻素受體（type-1 cannabinoid receptor，CB1R）拮抗劑AM281，觀察HU210對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte，AS）內(nèi)CXCR4水平的影響及其機(jī)制。

材料與方法

1 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為出生0～2天的Sprague-Dawley（SD）大鼠，由Charles River Laboratories（美國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司加拿大渥太華分部）提供。動(dòng)物飼養(yǎng)條件和實(shí)驗(yàn)程序嚴(yán)格按加拿大國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)動(dòng)物使用和管理?xiàng)l例執(zhí)行。

2 主要試劑

HU210購(gòu)于Tocris，AM281購(gòu)于Sigma，小鼠抗GFAP單克隆抗體、多克隆兔抗CB1R購(gòu)于Chemicon，多克隆兔抗CXCR4購(gòu)于Abcam，多克隆兔抗βactin購(gòu)于Santa Cruz，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG購(gòu)于Sigma，Alexa Fluor 488羊抗小鼠IgG和Alexa Fluor 568羊抗兔IgG購(gòu)于Molecular Probes，ECL顯色試劑盒及蛋白測(cè)試BCA試劑盒購(gòu)于Pierce。

3 星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定

取0～2d的SD大鼠幼崽大腦皮層，吹打分散成106／ml細(xì)胞懸液，接種于涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱，第2d更換培養(yǎng)基，以后每3d換1次培養(yǎng)基，培養(yǎng)第6d將培養(yǎng)瓶置于37°C恒溫?fù)u床150r／min振搖2h，棄培養(yǎng)基后用0.125%的胰酶消化貼壁細(xì)胞，吹打成細(xì)胞懸液后以種植密度106個(gè)／cm2接種于涂有多聚賴氨酸的蓋玻片的6孔板。對(duì)AS進(jìn)行AS特異性蛋白GFAP熒光標(biāo)記和DAPI染核，計(jì)算AS的培養(yǎng)純度。AS培養(yǎng)純度達(dá)99.05%±2.20%。

4 實(shí)驗(yàn)分組

將生長(zhǎng)融合的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入不同濃度HU210，HU210由DMSO溶解，分為對(duì)照組（僅加入DMSO）、3μmol／L組、6μmol／L組和12μmol／L組。

5 免疫熒光染色

取出培養(yǎng)皿中蓋玻片，0.01mol／L PBS沖洗3次后，用100%甲醇固定30min，10%牛血清白蛋白封閉30min后，在不同的玻片上分別加入一抗小鼠抗GFAP單克隆抗體（1∶500）／兔抗CB1R抗體（1∶300）和一抗小鼠抗GFAP單克隆抗體（1∶500）／兔抗CXCR4（1∶300），4℃孵育過(guò)夜后，PBS充分洗去一抗，加入Alexa Fluor 488羊抗小鼠（1∶500）和Alexa Fluor 568羊抗兔（1∶500），PBS充分漂洗后在熒光顯微鏡（Zeiss LSM510 META）下觀察、拍照；陰性對(duì)照用PBS替代一抗。

6 Western blot檢測(cè)

分別用不同濃度HU210和50μmol／L AM281刺激生長(zhǎng)融合的星形膠質(zhì)細(xì)胞5h后，去除細(xì)胞培養(yǎng)基，用D-Hanks清洗兩遍，按說(shuō)明書用M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，5min后收集細(xì)胞裂解液，離心14，000g（4°C）20min，收集上清，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度；加40μg蛋白樣到12%SDS-PAGE中進(jìn)行垂直電泳分離，然后全濕式電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至 PVDF膜上；用含5%脫脂奶粉的TBS-T室溫封閉2h，兔抗CXCR4（1∶500）、兔抗CB1R（1∶500）及兔抗β-actin（1∶500）。4°C慢搖過(guò)夜，次日充分漂洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG（1∶2，500），在室溫下?lián)u動(dòng)孵育2h，ECL試劑盒顯色，用數(shù)字照相成像系統(tǒng)（Alpha Innotech）拍照并進(jìn)行條帶分析（AlphaEase FC software），以測(cè)定目的蛋白水平。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 高濃度HU210下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)CXCR4

為了明確培養(yǎng)的AS是否表達(dá)CXCR4及CB1R，對(duì)分離培養(yǎng)的AS進(jìn)行GFAP／CXCR4和GFAP／CB1R免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)。結(jié)果顯示，AS特異性標(biāo)記蛋白GFAP在胞質(zhì)表達(dá)，CXCR4和CB1在胞質(zhì)和細(xì)胞膜均有表達(dá)（圖1）。

用不同濃度HU210刺激AS 5h后收集細(xì)胞，提取蛋白，進(jìn)行 Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示，與用溶媒（vehicle）DMSO刺激的對(duì)照組細(xì)胞相比，3μmol／L HU210刺激AS對(duì)CXCR4水平無(wú)明顯明顯影響，6μmol／LHU210刺激后CXCR4的水平顯著降低，12μmol／L HU210刺激后CXCR4水平 6μmol／LHU210刺激后相似，即高濃度HU210下調(diào)AS內(nèi)CXCR4水平的影響并非劑量依賴性（圖2）。

圖1　培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP、CXCR4和CB1R表達(dá)的免疫熒光染色。比例尺，50 μmFig.1　Immunofluorescent staining for detection of the expression of GFAP，CXCR4 and CB1R in the cultured astrocytes.Scale bar，50μm

圖2　HU210對(duì)培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)CXCR4水平的影響。A，HU210刺激　AS后，CXCR4水平的　western blot檢測(cè)；B，HU210刺激　AS后，CXCR4水平變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；**，與溶媒刺激細(xì)胞相比，P＜0.01；n＝4Fig.2　The effect of HU210 on CXCR4 level in the cultured astrocytes.A，Western blot detection of CXCR4 level in the cultured astrocytes after HU210 treatment；B，statistical analysis of the change in CXCR4 level in the cultured astrocytes after HU210 treatment；**，P＜0.01 versus astrocytes treated with the vehicle；n＝4

2 CB1R拮抗劑阻斷HU210對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)CXCR4的下調(diào)作用

為了明確CB1R是否參與HU210對(duì)CXCR水平的下調(diào)作用，繼而檢測(cè)了CB1R的選擇性拮抗劑AM281對(duì)HU210下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi) CXCR4水平作用的影響。將AS分為對(duì)照組、HU210組及HU210＋AM281組，各自分別以DMSO、6μmol／L HU210以及6μmol／L HU210聯(lián)合50 μmol AM281，對(duì)AS進(jìn)行孵育5h后進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果表明，AM281能阻斷HU210導(dǎo)致的CXCR4蛋白水平下降，提示HU210作用于CB1R而降低CXCR4的蛋白水平（圖3）。

圖3　AM281阻斷 HU210對(duì)培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)CXCR4水平的下調(diào)作用。A，HU210和 AM281對(duì)培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)　CXCR4水平影響的Western blot檢測(cè)；B，HU210和AM281對(duì)培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)CXCR4水平影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；**，與溶媒刺激細(xì)胞相比，P＜0.01；n＝4Fig.3　AM281 blocked the down-regulation of CXCR4 by HU210 in the cultured astrocytes.A，Western blot detection of the effect of HU210 and AM281 on CXCR4 level in the cultured astrocytes；B，statistical analysis of the effect of HU210 and AM281 on CXCR4 level in the cultured astrocytes；**，P＜0.01 versus astrocytes treated with the vehicle；n＝4

討 論

在正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞可持續(xù)低水平表達(dá)SDF-1和其受體CXCR4。SDF-1／CXCR4對(duì)細(xì)胞定向趨化發(fā)揮重要作用，研究表明多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎動(dòng)物模型及多種腦部原發(fā)腫瘤均存在病變部位CXCR4的表達(dá)上調(diào)［12］。研究認(rèn)為CXCR4的上調(diào)與神經(jīng)系統(tǒng)損傷及神經(jīng)元死亡相關(guān)，在新生小鼠腦組織缺血缺氧模型中，利用地塞米松干預(yù)能下調(diào)CXCR4的表達(dá)，影響炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［13］。星形膠質(zhì)細(xì)胞參與CXCR4相關(guān)的神經(jīng)元死亡，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷局部SDF-1分泌增多，星形膠質(zhì)細(xì)胞被升高的SDF-1趨化到損傷部位，聚集的星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量炎性因子和神經(jīng)毒性物質(zhì)，比如TNF-α和谷氨酸，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷死亡［14］。因此阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞CXCR4可能起到神經(jīng)保護(hù)作用。

桑科植物大麻是最早被人類認(rèn)識(shí)的成癮性植物之一，因其具有特殊的藥理學(xué)作用，日益受到研究者的廣泛重視。目前，大麻素免疫抑制及抗炎功效已被認(rèn)為對(duì)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如缺血性腦卒中、多發(fā)性硬化、帕金森病、阿爾茨海默病等有治療效果［9-12］。大麻的抗炎效應(yīng)及免疫抑制機(jī)制尚不明確，可能與大麻素抑制突觸前谷氨酸釋放減輕神經(jīng)毒性反應(yīng)，并能抑制TNF-α、NO和IL-1等細(xì)胞因子的生成。

對(duì)體外培養(yǎng)AS的研究表明，低濃度（3μmol／L）HU210對(duì)CXCR4水平無(wú)顯著影響，但高濃度（6μmol／L和12μmol／L）HU210干預(yù)5h后可以顯著降低CXCR4水平。人工合成大麻素 HU210的化學(xué)名為1，l-乙基庚基-1l-羥基四氫大麻酚，是大麻素的活性成分四氫大麻酚（△9tetrahydrocannabinol，△9THC）的結(jié)構(gòu)類似物，通過(guò)作用于CB1R發(fā)揮作用，和△9THC比，與受體的親和力更強(qiáng)，作用持續(xù)時(shí)間更久。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于大麻素與SDF-1／CXCR4相關(guān)性研究較少，為數(shù)不多的研究發(fā)現(xiàn)高濃度的大麻素WIN 55，212-2顯著抑制SDF-1導(dǎo)致的淋巴細(xì)胞趨化［15］；大麻素THC能抑制HIV感染所致的免疫反應(yīng)，而CXCR4作為HIV進(jìn)入宿主細(xì)胞的輔助受體之一，提示THC和CXCR4間可能存在相互作用［16］。我們的研究檢測(cè)了大麻素對(duì)CXCR4水平的影響，證實(shí)大麻素的確能通過(guò)CB1R下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞CXCR4，可能是大麻發(fā)揮免疫抑制作用的機(jī)理之一。如前所述，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病存在廣泛CXCR4表達(dá)上調(diào)，CXCR4的上調(diào)與炎性反應(yīng)及神經(jīng)損傷密切相關(guān)，大麻素對(duì)CXCR4的下調(diào)作用則為大麻素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

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Type-I cannabinoid receptor mediates down-regulation of CXCR4 in astrocytes by cannabinoid HU210

Zhu Zhou1,Han Jing2,Zhang Xia3,Xu Yi4*
（1Department of Neurology，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China；2The Modern Teaching Technology Key Laboratory of the Ministry of Education，Shaanxi Normal University，Xi＇an 710061，China；3IMHR，University of Ottawa，Ottawa K1Z 7H3，Canada；4Plastic Surgery Department，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China）

Objective This research aimed to explore the mechanism of cannabinoids in restraining immunoreaction in the central nervous system to seek the theoretical basis for clinical application.Methods The cultured astrocytes were stimulated with various concentrations of HU210；the expression levels of CXCR4 protein were detected by western blot,and compared between groups with and without cannabinoid treatment.The cells were then treated with AM 281,an antagonist of type-1 cannabinoid receptor(CB1R), and the change of CXCR4 expression was measured.Results Western blot results showed that high concentration HU210 could downregulate CXCR4 expression in astrocytes；however,CB1R antagonist AM281 was able to block this effect.Conclusion HU210 downregulates CXCR4 expression through CB1R,which might be one of the mechanisms for the immunosuppression effect of cannabinoids.

Cannabinoids；type-1 cannabinoid receptor；CXCR4；astrocyte

R931.71

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.05.002

2016-08-01

2016-10-08

華中科技大學(xué)自主創(chuàng)新研究基金（2015ZHYX011）；湖北省科技支撐計(jì)劃（2015BKA220）

朱舟，女（1978年），漢族，副教授

（To whom correspondence should be addressed）：stmartin2005＠foxmail.com