趙云霞，崔芳芹

（蚌埠醫(yī)學院病理生理學教研室，蚌埠 233030）

血管內(nèi)皮生長因子-D在乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移中的臨床意義

趙云霞*，崔芳芹

（蚌埠醫(yī)學院病理生理學教研室，蚌埠 233030）

目的 探討乳腺癌中血管內(nèi)皮生長因子-D（VEGF-D）對淋巴管生成的作用及其與臨床病理指標和預后的關系。方法 應用免疫組織化學S-P法檢測120例乳腺癌組織中VEGF-D的免疫反應性，同時以D2-40、podoplanin標記微淋巴管，計數(shù)微淋巴管密度（LVD），分析其與臨床病理指標及預后的關系。結(jié)果 乳腺癌組織中VEGF-D蛋白免疫反應陽性率、LVD值均明顯高于乳腺纖維腺瘤組織；乳腺癌組織中VEGF-D蛋白免疫反應與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關，且LVD值與VEGF-D表達呈線性相關。結(jié)論 VEGF-D參與乳腺癌淋巴管生成，影響乳腺癌的預后。

乳腺癌；血管內(nèi)皮生長因子D；微淋巴管密度

乳腺癌轉(zhuǎn)移以淋巴轉(zhuǎn)移為主，是乳腺癌進展中較早發(fā)生的事件。乳腺癌的淋巴道侵襲和轉(zhuǎn)移是導致病人預后不良的重要因素，因此抗淋巴道轉(zhuǎn)移成為乳腺癌治療的新方向。腫瘤新生淋巴管在淋巴轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用［1-3］。血管內(nèi)皮生長因子-D（vascular endothelial growth factor-D，VEGF-D）與其受體結(jié)合，通過酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導通路促進淋巴道內(nèi)皮的增生和遷移［4］。有研究表明VEGF-D可促進瘤內(nèi)淋巴管的生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［5］。Podoplanin是目前較特異的淋巴管標記物之一，D2-40特異性表達于淋巴管內(nèi)皮細胞，而不表達于血管內(nèi)皮細胞，因此目前被認為是淋巴管內(nèi)皮細胞特異性標記物。腫瘤微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LVD）可反映腫瘤淋巴管的生成，是腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移獨立的危險因子［6］。為揭示VEGF-D在乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移中的作用，本研究觀察了乳腺癌中VEGFD的反應性和LVD變化及其與臨床病理指標的關系。

材料和方法

1 標本

收集2008年6月至2012年6月間蚌埠醫(yī)學院病理學教研室（蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科）存檔的手術切除的乳腺癌石蠟標本120例。術前患者未接受放、化療及內(nèi)分泌治療，所有標本再次復查確認?；颊吣挲g31～85歲，平均年齡53歲（中位年齡50歲）。標本中浸潤性導管癌98例，其他22例。病理分級：Ⅰ級 18例；Ⅱ級78例；Ⅲ級 24例。參照TNM分期［7］，將標本按腫瘤大小分為3組：最大直徑≤2.0cm者12例，直徑為2.0～5.0cm者88例，最大直徑＞5.0cm者20例。76例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，44例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。另隨機選取同期乳腺纖維腺瘤標本30例作為對照。

2 試劑和方法

所有標本均經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋、切片（厚4μm），分別行HE染色和S-P法免疫組織化學染色，用已知陽性組織切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。兔抗人VEGF-D、鼠抗人D2-40單克隆抗體購自福州邁新生物技術開發(fā)公司，鼠抗人podoplanin單克隆抗體購自上海晶美生物技術有限公司，工作濃度分別為1：500、1：70和1：200。

3 結(jié)果判斷

VEGF-D在乳腺癌細胞的免疫反應陽性產(chǎn)物定位于細胞質(zhì)。用染色強度、陽性細胞比例兩個指標評定VEGF-D陽性表達水平。按染色強度評分：不著色0分，著色弱1分，著色清晰為2分，著色強3分。按陽性細胞所占的百分率評分：無細胞著色0分，著色細胞0～10%1分，10%～30%2分，30%～50%3分，50%以上4分。染色強度與陽性細胞比例相加，0～2分為陰性，3分（＋），4～5分（＋＋），6分（＋＋＋），7分（＋＋＋＋）。

D2-40、Podoplanin免疫反應陽性產(chǎn)物均定位于淋巴管內(nèi)皮細胞，以胞質(zhì)或胞膜呈棕黃色或棕褐色為陽性表達。本研究中D2-40、podoplanin標記均以表達陽性的淋巴管作為有意義的淋巴管，以此計算LVD值。淋巴管密度計數(shù)的方法參照文獻［8］：先于低倍鏡（×10物鏡）下確定3個淋巴管數(shù)目最多的熱點，然后在高倍鏡（×40物鏡）下計數(shù)，每個熱點計數(shù)5個高倍鏡視野的淋巴管數(shù)目，最終取3個熱點格5個高倍鏡下淋巴管平均數(shù)目作為腫瘤LVD值。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，LVD值兩種不同檢測方法間的比較采用t檢驗，VEGF-D免疫反應性與臨床病理指標間關系的比較采用χ2檢驗和Fisher精確檢驗，VEGF-D免疫反應性與LVD值間關系的比較采用t檢驗及單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)　果

1 乳腺癌組織中VEGF-D免疫反應性增強

VEGF-D免疫反應陽性產(chǎn)物為棕黃色或棕褐色的顆粒，位于細胞質(zhì)中（圖1）。乳腺癌組織中VEGF-D免疫反應性陽性率（82.50%）明顯高于同期乳腺纖維腺瘤組織（23.33%）。

圖1　VEGF-D免疫反應性在乳腺癌組織細胞質(zhì)內(nèi)的定位。比例尺，100μmFig.1　Localization of VEGF-D immunoreactivity in the cytoplasm of the mammary carcinoma tissue.Scale bar，100μm

2 乳腺癌組織中LVD增加

D2-40、podoplanin標記陽性的淋巴管管壁由單層內(nèi)皮細胞排列而成，壁薄，管腔具有不規(guī)則形態(tài)，管腔中無紅細胞。在癌周組織中淋巴管豐富，壁薄管腔大；中心區(qū)淋巴管少且管腔狹窄或呈條索狀。以癌周組織中的淋巴管數(shù)目計數(shù)淋巴管密度，結(jié)果顯示，癌周組織中D2-40陽性標記（圖2A，圖2B）的LVD值（28.32±6.63）和podoplanin標記陽性（圖2C，圖2D）的LVD值（27.88±6.19）明顯高于同期乳腺纖維腺瘤組織，兩者同時陽性的LVD值26.66 ±6.56。D2-40、podoplanin標記淋巴管數(shù)目的陽性率具有一致性（表1）。

圖2　乳腺癌癌旁組織淋巴管的D2-40（A和B）和podoplanin（C和D）免疫組織化學標記。比例尺，100μmFig.2　D2-40（A and B）and podoplanin（C and D）immunohistochemical labelling of lymphatic vessels in the tissue adjacent to the breast carcinoma.Scale bar，100μm

表1　乳腺癌癌旁組織中　D2-40與　Podoplanin標記的微淋巴管密度Table 1　D2-40-and podoplanin-labelled LVD in the tissue adjacent to the breast carcinoma

3 乳腺癌中VEGF-D免疫反應性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關

76例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中VEGF-D免疫反應陽性率為88.16%，高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，VEGF-D免疫反應性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關，而與腫瘤病理類型、腫瘤分級及大小等其他多個病理指標間無相關性（表2）。

4 VEGF-D免疫反應性與LVD值的關系

120例乳腺癌患者中，99例VEGF-D免疫反應陽性病例中LVD值為28.66±4.90，高于陰性組的LVD值17.24±5.07，兩者之間呈線性相關（表3）。

表2　VEGF-D免疫反應性與乳腺癌臨床病理指標的關系Table 2　Correlation between VEGF-D-immunoreactivity and clinicopathological features in breast carcinoma

表3　乳腺癌組織中VEGF-D免疫反應性與LVD值的關系Table 3　Relationship between VEGF-D-immunoreactivity and LVD in breast carcinoma

討　論

長期以來人們試圖阻斷腫瘤的血道轉(zhuǎn)移以改善腫瘤預后，但效果并不理想。而臨床觀察證實，淋巴轉(zhuǎn)移是多種腫瘤發(fā)展過程中的早期事件。淋巴轉(zhuǎn)移也是決定乳腺癌分期和治療方案的關鍵因素之一，是影響乳腺癌療效和預后的重要因素。因此阻斷腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移成為改善腫瘤預后的可能途徑。D2-40目前被認為是特異性較強的淋巴管內(nèi)皮細胞標記物，它在成熟的淋巴管上不表達，但在多種腫瘤新生淋巴管內(nèi)皮呈免疫反應陽性［9］，例如，在胃癌［10］、前列腺癌、和腎癌［11］等腫瘤的淋巴管內(nèi)皮都呈D2-40免疫反應陽性。本研究發(fā)現(xiàn)，D2-40標記的乳腺癌組織中的微淋巴管在癌周區(qū)域管腔大，密度高，而癌中心區(qū)僅為裂隙狀或條索狀微淋巴管結(jié)構(gòu)，且數(shù)量少。由此提示，腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移可能是通過癌周的新生淋巴管實現(xiàn)的。Podoplanin亦被認為是較特異的淋巴管內(nèi)皮標記物之一，是檢測腫瘤內(nèi)部新生的淋巴管較可靠的指標［12］。本研究中采用D2-40和podoplanin標記同一乳腺癌組織中的淋巴管內(nèi)皮細胞并分別計數(shù)LVD值，發(fā)現(xiàn)兩者免疫反應性相似，用兩種方法標記乳腺癌組織測得的LVD值相近，且都與對照組有顯著差異。因此認為兩種標記物在淋巴管內(nèi)皮細胞的表達無差異，均能客觀地反應腫瘤組織內(nèi)部淋巴管新生情況，均為可靠的特異性的淋巴管內(nèi)皮細胞標記物。此結(jié)果與文獻報道一致［13］。

近來的研究表明，腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移并非是被動的，而是一個主動過程。某些因子刺激會促進淋巴管的生成，而新生淋巴管是導致淋巴轉(zhuǎn)移的先決條件［14］。目前研究最多的促淋巴轉(zhuǎn)移的因子就是血管內(nèi)皮生長因子VEGF-C和VEGF-D及其受體。VEGF-D及其受體在直腸癌、宮頸癌和胃癌等多種腫瘤中被認為與淋巴轉(zhuǎn)移密切相關，且被認為是腫瘤獨立的預后不良指標［13，15，16］，但對乳腺癌的預后價值仍存在較大爭議。目前研究表明，VEGF-D通過旁分泌和自分泌的形式發(fā)揮作用，腫瘤細胞合成和分泌的VEGF-D可誘導其受體 VEGFR-3表達，進而活化CRB2／ERX1／2及PI3K／AKT信號通路，觸發(fā)MAPK級聯(lián)反應，促使淋巴管內(nèi)皮細胞增殖及淋巴管新生，為腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移提供條件。前期研究已證實VEGF-3在乳腺癌的淋巴轉(zhuǎn)移中具有作用，是乳腺癌淋巴管生成的重要誘導因子［17］。本研究結(jié)果顯示，VEGF-D在乳腺癌腫瘤細胞中表達顯著增高，其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關，且VEGF-D免疫反應陽性的乳腺癌組織中LVD值顯著高于陰性組，由此推斷在乳腺癌組織中VEGF-D合成和分泌增多，與其受體結(jié)合后通過相應的信號轉(zhuǎn)導通路促使腫瘤內(nèi)部淋巴管的生成，導致淋巴轉(zhuǎn)移，而淋巴轉(zhuǎn)移是乳腺癌預后的重要影響因素，因此認為VEGF-D的高表達與乳腺癌的淋巴轉(zhuǎn)移和不良預后有關［18，19］。由此可見，VEGF-D在乳腺癌的淋巴管生成中具有重要作用，影響乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，可作為乳腺癌重要的預后指標。

乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移往往發(fā)生較早且預后差，因此抗淋巴轉(zhuǎn)移治療是乳腺癌治療的重要方向。本研究結(jié)果提示腺癌組織中的D2-40、podoplanin和VEGFD的表達可以初步評估腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，為乳腺癌患者的下一步臨床治療提供參考，且 VEGF-D所涉及的信號轉(zhuǎn)導通路可能成為乳腺癌靶向治療的新路徑。

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The clinical significance of vascular endothelial growth factor-D in lymphatic metastasis of breast cancer

Zhao Yunxia*,Cui Fangqin
（Department of Physiopathology，Bengbu Medical College，Anhui 233030，China）

Objective To investigate the role of vascular endothelial growth factor-D(VEGF-D)in the lymphangiogenesis of breast cancer and to evaluate its relationship with the clinicopathological characteristics and prognosis.Methods The S-P immunohistochemical method was used to detect VEGF-D immunoreactivity in 120 cases of breast cancer,and lymphatic endothelial cells were marked with D2-40 and podoplanin simultaneously.Lymphatic vessel density(LVD)was then counted,and its relationship with the clinical pathological parameters and prognosis of breast cancer was analyzed.Results Both the positive rates of VEGF-D and LVD were significantly higher in breast cancer than in breast fibro-adenoma tissue.VEGF-D immunoreactivity was positively associated with the lymph node metastasis of breast cancer.LVD was linearly correlated with the expression of VEGF-D.Conclusion VEGF-D affects breast cancer prognosis through facilitating lymphangiogenesis.

Breast cancer；vascular endothelial growth factor-D；lymphatic vessel density

R73-37

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.05.011

2015-11-21

2016-10-08

安徽省教育廳高校自然科學基金項目（KJ2015B106by，KJ2016A867）

趙云霞，女（1977年），漢族，講師

（To whom correspondence should be addressed）：zhyx201312＠163.com