鄭沖 溫海 郭芳 樊一斌

(1.福建醫(yī)科大學附屬龍巖第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，龍巖 364000；2.上海長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所全軍真菌病重點實驗室 第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院皮膚科，上海 200003；3.浙江省人民醫(yī)院皮膚科，杭州 310024)

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·論著·

隱球菌性腦膜炎小鼠模型腦組織中VEGFR表達變化的研究

鄭沖1溫海2郭芳1樊一斌3

(1.福建醫(yī)科大學附屬龍巖第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，龍巖 364000；2.上海長征醫(yī)院皮膚病與真菌病研究所全軍真菌病重點實驗室 第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院皮膚科，上海 200003；3.浙江省人民醫(yī)院皮膚科，杭州 310024)

目的 探尋隱球菌性腦膜炎小鼠模型中腦組織血管內(nèi)皮生長因子受體 (vascular endothelial growth factor recepter,VEGFR)在感染隱球菌后的變化規(guī)律。方法 通過尾靜脈接種隱球菌菌懸液的方法構(gòu)建中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌感染小鼠模型 (n=30)為實驗組，根據(jù)模型建立后5個時間點 (6 h、12 h、24 h、48 h、72 h)分為5組，每組6只；對照組 (n=6)尾靜脈接種等量生理鹽水。采用Western blotting技術(shù)測定小鼠腦組織中VEGFR1和VEGFR2蛋白。結(jié)果 實驗組小鼠腦組織中VEGFR1和VEGFR2蛋白測定結(jié)果與對照組相比有下降，差別有統(tǒng)計學意義。結(jié)論 隱球菌性腦膜炎小鼠感染隱球菌后腦組織VEGFR表達下調(diào)，可能是隱球菌感染致腦水腫的繼發(fā)保護機制。

隱球菌性腦膜炎；小鼠模型；血管內(nèi)皮生長因子受體

[Chin J Mycol，2016，11(5):257-260]

隱球菌性腦膜炎是一種嚴重的深部真菌感染，死亡率極高，常發(fā)生于HIV陽性的免疫缺陷患者，偶可出現(xiàn)在免疫功能正常人群[1-3]?；颊叨嘁蝻B內(nèi)壓明顯增高、腦疝等導(dǎo)致死亡，通過治療性腰穿、側(cè)腦室穿刺持續(xù)引流等降低顱內(nèi)壓，可顯著降低死亡率[4-5]。腦水腫是隱球菌性腦膜炎患者顱內(nèi)壓增高的重要原因之一。2008年范娟等[6]建立的隱球菌性腦膜炎小鼠模型中觀察到其腦組織含水量在隱球菌感染后6 h開始明顯升高，24 h達到高峰，以后開始下降。2012年樊一斌等[7]在這個模型基礎(chǔ)上提出水通道蛋白4的表達對隱球菌性腦膜炎導(dǎo)致腦水腫有保護作用。本研究通過測定隱球菌性腦膜炎小鼠模型腦組織中VEGFR蛋白在感染后不同時間段的表達情況，進一步探討隱球菌性腦膜腦炎腦水腫發(fā)生的機制。

1 材料和方法

1.1 主要材料

新生隱球菌H99 (MATα)來自第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院皮膚科真菌保藏實驗室；C57BL/6小鼠36只，購自中科院實驗動物中心，體重 (24±0.5) g，雌性，室溫常規(guī)分隔飼養(yǎng)；采用常規(guī)方法[6]配成終濃度為1.0×107CFU/mL的新生隱球菌懸液，1 h內(nèi)使用。

1.2 模型構(gòu)建和組織取材

36只小鼠隨機分為實驗組和對照組，腹腔注射環(huán)磷酰胺進行免疫抑制，劑量為200 mg/kg；3 d后，將小鼠尾常規(guī)消毒，自尾靜脈緩慢注射0.6 mL新配制的菌懸液，對照組注射等量生理鹽水；實驗組小鼠分別于接種菌懸液后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 5個時間點,對照組小鼠于生理鹽水注射完24 h進行麻醉，多聚甲醛 (paraformaldehyde,PFA)全身灌注處死，取腦組織及各主要臟器PFA固定，-70℃冰箱保存。

1.3 VEGF受體蛋白的測定

樣本制備 將實驗組30只 (根據(jù)接種菌懸液后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 5個時間點再分為5組，每組6只)和對照組6只免疫抑制的C57BL/6小鼠腦組織標本，勻漿，離心，取上清夜分裝，-80℃保存待用 (另留少量以測定蛋白濃度)。采用BCA法，獲得每個樣品上樣量為40 μg。

Western blot法檢測腦VEGFR的表達 分別于6 h、12 h、24 h、48 h、72 h各時相點通過Western blotting技術(shù)分析得出VEGF1條帶 (80 kd)及VEGF2條帶 (80 kd)灰度值 (見圖1a、1b)。

圖1 a.新生隱球菌感染后不同時間點小鼠腦組織VEGFR1的蛋白表達水平，b.新生隱球菌感染后不同時間點小鼠腦組織VEGFR2的蛋白表達水平

Fig.1 a.VEGFR1 protein expressions in brain tissure withCryptococcusneoformansinfection at different time points,b.VEGFR2 protein expressions in brain tissure withCryptococcusneoformansinfectionat different time points

由于上樣量的細微差別，同一膠帶不同上樣孔之間VEGF受體灰度值通過β-actin進行調(diào)整，不同膠帶之間VEGF受體灰度值通過空白對照進行調(diào)整，從而得出標準化小鼠腦組織VEGFR蛋白水平值，進一步反應(yīng)小鼠腦組織中VEGFR蛋白的表達變化。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 按照BCA法樣本稀釋10倍結(jié)果見表1。

2.2 VEGFR1和VEGFR2標準化蛋白測定結(jié)果

接種后6 h小鼠腦組織VEGFR1標準化蛋白水平值為 (0.53±0.07)，12 h為 (0.26±0.03)，24 h為 (0.35±0.04)，48 h為 (0.53±0.09)，72 h為 (0.53±0.09)，對照組的小鼠腦組織VEGFR1標準化蛋白水平值為 (1.67±0.24)，實驗組與對照組相比較蛋白表達量顯著下降 (見表2)。而VEGFR2標準化蛋白水平值接種后6 h為 (0.44±0.05)，12 h為 (0.55±0.07)，24 h為 (0.53±0.08)，48 h為 (0.41±0.06)，72 h為 (0.36±0.05)，對照組的小鼠腦組織VEGFR2標準化蛋白水平值為 (0.93±0.12)。實驗組小鼠腦組織VEGFR在各時間點的蛋白表達與對照組相比差異顯著 (P<0.05)，具有統(tǒng)計學意義。實驗組較對照組蛋白表達量顯著下降 (見表2)。

3 討 論

腦水腫分為細胞性水腫和血管性水腫，其病理生理機制可以是直接的血腦屏障破壞，或者分子信號傳遞使細胞膜上離子通道異常，其中代表血腦屏障功能狀態(tài)的腦微血管通透性對腦組織內(nèi)液體的平衡具有重要的意義，通透性增高可引起腦內(nèi)液體滯留，導(dǎo)致腦實質(zhì)細胞處于水腫狀態(tài)[8]。目前在黃斑水腫、腦損傷和腦腫瘤中的研究表明，在血腦屏障構(gòu)成細胞表面表達的血管內(nèi)皮生長因子受體對腦水腫的產(chǎn)生具有重要意義[8-13]。但在中樞系統(tǒng)感染中，比如隱球菌腦膜炎的腦水腫發(fā)生是否也與這些因子有關(guān)，目前尚不明確。

血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)也稱血管通透因子，為特異性作用于血管內(nèi)皮細胞的多功能細胞因子，增加微血管長度，從而增加血管的通透性，使血漿蛋白等物質(zhì)滲出血管外[9]。血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)家族包含有3 種亞型，即VEGFR1F1t-1)、VEGFR2 (KDR/Flk-1)和VEGFR3 (Flt-4)。VEGF有2個高度特異性的受體flt-1和flk-1，即VEGFR1和VEGFR2僅存在于血管內(nèi)皮細胞中，正常情況下表達水平甚低，但在缺血、缺氧、腫瘤等情況下，血管內(nèi)皮中的VEGFR表達增高[8-9,12]。VEGF在大腦缺血早期有較強的增加血管通透性的作用，可加重血管滲出傾向，加重腦水腫[12]。在顱內(nèi)腦膜瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子-A與內(nèi)皮細胞上的VEGFR2結(jié)合產(chǎn)生微血管再生作用，其腦膜瘤周圍腦組織中血管內(nèi)皮生長因子-A、VEGFR2等蛋白表達相對于微血管長度增加明顯，以此認為微血管長度和VEGF-A信號傳遞通路可能是腦膜瘤周圍腦組織水腫的必要條件[9]。由于隱球菌通過血腦屏障的關(guān)鍵步驟就是通過腦微血管內(nèi)皮細胞的緊密連接，隱球菌腦膜炎發(fā)病之初即表現(xiàn)為腦水腫的各種癥狀，因此推測在隱球菌與血腦屏障的相互作用中，血管內(nèi)皮細胞VEGFR的表達出現(xiàn)變化，這種變化可能影響腦水腫發(fā)生。研究VEGF受體在這個過程中所起到的作用，對于闡明隱球菌腦膜炎腦水腫的發(fā)生機制具有重要作用。

表1 VEGFR各組上樣量一覽表

Tab.2 VEGFR expression in mice brain tissus in diferent time point

組別例數(shù)(n)VEGFR1VEGFR2對照組61.67±0.240.93±0.12實驗組6h60.53±0.070.44±0.05實驗組24h60.35±0.040.53±0.08實驗組48h60.53±0.090.41±0.06實驗組72h60.53±0.090.36±0.05

注：P<0.005

在之前隱球菌性腦膜炎小鼠模型研究中提示小鼠感染隱球菌后腦組織水腫隨著時間的推移逐漸嚴重[6]，而本研究的結(jié)果顯示隱球菌性腦膜炎腦組織中VEGFR1及VEGFR2蛋白表達水平明顯下降。我們大膽推測隱球菌感染后引起VEGFR表達的下調(diào)，對腦組織水腫可能起保護作用，理由有以下兩點：第一，隱球菌性腦膜炎的死亡率與顱內(nèi)壓增高密切相關(guān)，而隱球菌性腦膜炎顱內(nèi)壓增高的原因不單單是腦組織水腫，更重要的是腦脊液分泌過多，所以一些研究認為進行診斷性腰穿或側(cè)腦室穿刺等手段釋放腦脊液，降低顱內(nèi)壓，可以顯著提高治愈率[4-5]。由此推斷，隱球菌腦膜炎腦膜病變導(dǎo)致腦脊液分泌增多是更重要的病理生理機制，而其腦組織水腫可能是繼發(fā)性，繼發(fā)于顱內(nèi)壓增高等因素。這跟在腦梗死、腦腫瘤等觀察到組織水腫的發(fā)病機制不一樣，腦梗死、腦腫瘤等這些水腫的組織觀察到的VEGFR蛋白表達是增高的。第二，一些研究[10-11,13]認為使用VEGFR拮抗劑可以減少微血管再生，減少組織再生，減輕水腫，亦支持VEGFR下調(diào)對水腫具有保護作用。因此我們推測當感染新生隱球菌后，隱球菌經(jīng)過血液循環(huán)作用于血腦屏障，在腦膜組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子分泌增多，影響與血腦屏障中信號傳導(dǎo)通路相關(guān)下游基因表達的下降，進而影響與血腦屏障通透性相關(guān)信號傳導(dǎo)通路改變，改變了血腦屏障通透性，使隱球菌易于通過血腦屏障而感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)，主要定位于腦膜系統(tǒng)，引起腦脊液分泌增加，導(dǎo)致顱內(nèi)壓增高，腦組織水腫，另一方面通過反作用機制引起VEGFR1和VEGFR2基因及蛋白表達下降，降低配體VEGF作用，使血腦屏障通透性下降，減輕腦組織水腫。目前的工作尚不完美，今后的工作可以進一步完善配體VEGF檢測，甚至采用RNA干擾技術(shù)，分析腦組織含水量變化，結(jié)合現(xiàn)在對VEGFR實驗結(jié)果，才能更好解釋VEGF配體及受體在隱球菌性腦膜炎腦水腫的作用機制，對VEGFR拮抗劑治療腦水腫提供依據(jù)。

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[本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮

The study of expression changes of VEGFR in mice brain tissue infected withCryptococcusneoformans

ZHENG Chong1，WEN Hai2，GUO Fang1，F(xiàn)AN Yi-bin3

(1.Departmentofneurology，TheLongyanaffiliatedhospitalofFujianMedicalUniversity，Longyan364000；2.Instituteofdermatologyandfungaldisease,KeyLaboratoryofthearmyfungaldisease,Departmentofdermatology,ChangzhengHospital,Shanghai200003；3.DepartmentofDermatology，ZhejiangProvincialPeople＇sHospital，Hangzhou310024)

Objective To investigate the expression changes of the vascular endothelial growth-factor receptors (VEGFR) in the mice brain tissus after being infected byCryptococcusneoformans.Methods Test group mice (n=30) were injected withCryptococcusneoformansvia the tail vein,while control group mice (n=6) received saline.Western blotting technology was used in 6 h,12 h,24 h,48 h,72 h to detect VEGFR1 and VEGFR2 expression changes in mice brain tissus.Rusluts Compared with the control group，VEGFR1 and VEGFR2 protein expressions in the test group were down.There was significant difference between the test group and control group (P<0.05).Conclusions VEGFR might play protective role in brain edema caused by cryptococcal meningitis.

cryptococcal meningitis；mice model；vascular endothelial growth factor recepter

鄭沖，男 (漢族)，碩士，主治醫(yī)師.E-mail:15880699252@163.com

樊一斌,E-mail:frankgets@sina.com

R 379.5

A

1673-3827(2016)11-0257-04

2016-06-30