洪勝輝，倪利鋒，王芊芊，陳曉娟，劉迪文

(1.浙江大學 實驗動物中心，浙江杭州 310058； 2.杭州師范大學 實驗動物中心)

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試驗研究

還原型谷胱甘肽(GSH)在小鼠體外受精中的作用初探

洪勝輝1，倪利鋒2，王芊芊1，陳曉娟1，劉迪文1

(1.浙江大學 實驗動物中心，浙江杭州 310058； 2.杭州師范大學 實驗動物中心)

為研究還原型谷胱甘肽(GSH)在小鼠體外受精中的作用，試驗選用C57BL/6J小鼠(雄鼠12周齡，雌鼠4周齡)、ICR受體鼠(8-10周齡)。GSH添加濃度分別為終濃度0、1 mmol/L、2 mmol/L，每組超排雌鼠5只，轉基因小鼠凈化試驗每個品系超排雌鼠10只。結果顯示，在受精液(HTF)中添加GSH 1 mmol/L時，小鼠體外受精效果最好，受精率達70.8%，胚胎形狀正常，未受精單細胞與異形胚較少，胚胎移植平均妊娠率達93.5%。

還原型谷胱甘肽；體外受精；受精率；產(chǎn)仔率；小鼠

還原型谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸以肽鍵形式縮合而成的三肽化合物，是機體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑，能把體內(nèi)的有害毒物轉化為無害物質(zhì)排出體外。GSH對巰基酶具有激活作用，在生物氧化、氨基酸轉運、保護血紅蛋白過程中發(fā)揮著重要作用。

哺乳動物的精子細胞對脂質(zhì)過氧化作用非常敏感，極易導致精子結構損傷，降低精子的運動能力和新陳代謝。研究表明，在冷凍稀釋液中添加一定濃度的GSH能顯著增強牛、羊冷凍解凍精子的活力及精子質(zhì)膜、頂體膜和DNA的完整性[1-2]；提高牛卵母細胞體外受精率和胚胎發(fā)育率[3]。盡管國內(nèi)有很多報道證明GSH能提高精子活力，但其研究都以牛、羊為對象，在小鼠上鮮有報道，筆者在日常小鼠凈化實驗中，通過在小鼠體外受精液中添加GSH，探索到最適合小鼠體外受精的GSH添加量，大大提高了小鼠體外受精率和小鼠凈化效率，現(xiàn)報告如下，供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 C57BL/6J小鼠(雄鼠12周齡、雌鼠4周齡)、ICR受體鼠(8-10周齡)購自上海某實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于SPF級動物屏障中，待凈化轉基因小鼠飼養(yǎng)于隔離待凈化區(qū)域。

1.2 供試試劑 孕馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)購自寧波某制藥有限公司。精子獲能液(c-TYH)和受精液(HTF)由本中心配制，所用成分均購自sigma公司。GSH、M2培養(yǎng)液、礦物油購自sigma公司。

1.3 超排和取卵 每只小鼠腹腔注射PMSG 5 IU，間隔48 h后腹腔注射HCG 5IU。注射HCG后15 h左右取卵，將卵團細胞移入預先平衡的200 μL 受精液微滴中培養(yǎng)。GSH用HTF稀釋，添加濃度分別為終濃度0 、1 mmol/L、2 mmol/L的受精液，每組超排C57BL/6J 雌鼠5只。轉基因小鼠凈化試驗每個品系超排C57BL/6J雌鼠10只。

1.4 體外受精 將C57BL/6J及轉基因雄鼠 脫頸椎處死，取附睪尾精子，精子團移入精子獲能液c-TYH中，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.5 h后，鏡檢精子活力和密度，輕柔吸取微滴邊緣的精子懸液加至含卵母細胞團的受精滴中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后洗卵，移入HTF中培養(yǎng)過夜。次日記錄2細胞胚胎數(shù)、未受精卵數(shù)、異常卵數(shù)和取卵總數(shù)，統(tǒng)計受精率和異常卵比例，同時觀察胚胎細胞形態(tài)。

2 結果與分析

2.1 最佳GSH濃度確定 C57BL/6J小鼠體外受精添加GSH試驗結果，詳見表1。

由表1可見，HTF中未添加GSH時，小鼠體外受精率較低，且異形胚胎數(shù)較多。添加2 mmol/L GSH 時，小鼠體外受精率較高，近50% 2-cell胚胎透明帶內(nèi)插入較多精子，胚胎似毛茸茸“小球“，這類胚胎移植成活率較低。結合體外受精率及胚胎形態(tài)，確定GSH添加量為1 mmol/L 時，小鼠體外受精率較高、異形胚較少，試驗結果最佳。

2.2 轉基因小鼠凈化結果 詳見表2。

表1 確定GSH 最佳濃度添加量的試驗結果

表2 轉基因小鼠體外受精及產(chǎn)仔結果

由表2可見，添加1 mmol/L GSH后，小鼠平均體外受精率由58.9%提高到73.6%，平均每只供體獲得的2-cell胚胎數(shù)由12.9例提高到18.2例。且移植受體的平均妊娠率及平均胚胎移植產(chǎn)仔率無顯著差異，在相同凈化條件下，可以減少超排供體的數(shù)量，從而節(jié)約成本，提高供體利用率。

3 小結與討論

在養(yǎng)殖業(yè)中，GSH最早被添加于牛、羊精子冷凍稀釋液中以提高冷凍精子的質(zhì)量和受精率。多項研究表明，在冷凍稀釋液中添加GSH后的冷凍精子復蘇后體外受精率高于未添加組。有關研究認為GSH是通過清除精細胞中的ROS 和減少精細胞內(nèi)抗氧化酶泄露來達到保護精細胞免受過多氧化物質(zhì)損害的目的[1，2,4]。研究表明，GSH能促進卵母細胞體外受精胚胎發(fā)育，減少ROS，提高抗氧化作用。同時，GSH還可增加胚胎對溫度升高的耐受性，對移植后胚胎的存活和發(fā)育有著重要作用。

本研究結果表明，在小鼠體外受精液中添加適量GSH能明顯提高小鼠體外受精率，當GSH添加量為1 mmol/L 時，效果最佳，與Takeo T.等(2001)[5]研究結果基本一致。通過添加GSH，可明顯提高小鼠體外受精效率和小鼠的生物凈化效率，減少小鼠的超排量，節(jié)約成本，切實貫徹實驗動物使用中的“3R”原則。

[1]Tuncer P B,Bucak M N,Buyukleblebici S,et al.The effect of cysteine and glutathione on sperm and oxidative stress parameters of post-thawed bull semen[J].Cryobiology,2010,61:303-307.

[2]Muhammad S A,Bushra A R,Syed M H,et al.Glutathione supplement tris-citric acid extender improves thep post-thaw quality and in vivo fertility of buffalo(Bubalus bubalis)bull spermatoza[J].Reproductive Biology,2012,271-276.

[3]魏紅芳，張長興，徐照學.谷胱甘肽(GSH)對牛卵母細胞體外受精胚胎發(fā)育的的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37(33)：16398-16404.

[4]Bilodeau J F,Blanchette S,Gagnon C,et al.Thiols prevent H2O2-mediated loss of sperm motility in cryopreserved bull semen[J].Theriogenology,2001,56:275-286.

[5]Takeo T,Nakagata N.Reduced Glutathione Enhances Fertility of Frozen/Thawed C57BL/6 Mouse Sperm after Exposure to Methyl-Beta-Cyclodextrin[J]. Blology of Reproduction.2011,85:1066-1072.

2016-08-16

洪勝輝(1986-)，男，碩士，初級實驗員，主要研究方向為種資凈化與保存。

S865.1+30.3

A

1005-7307(2016)06-0001-002