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        益腎生精膠囊對鄰苯二甲酸二丁酯所致大鼠生殖功能損害的影響*

        2016-12-12 05:24:43李俊濤曲曉偉張蜀武李鄭生張培海
        中醫(yī)研究 2016年11期
        關(guān)鍵詞:附睪睪丸生殖

        李俊濤,曲曉偉,張蜀武,李鄭生,張培海

        (1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院男科,河南 鄭州 450000; 2.鄭州人民醫(yī)院泌尿外科,河南 鄭州 450003; 3.四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院男科,四川 成都 610041)

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        ·實(shí)驗(yàn)研究·

        益腎生精膠囊對鄰苯二甲酸二丁酯所致大鼠生殖功能損害的影響*

        李俊濤1,曲曉偉2,張蜀武3,李鄭生1,張培海3

        (1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院男科,河南 鄭州 450000; 2.鄭州人民醫(yī)院泌尿外科,河南 鄭州 450003; 3.四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院男科,四川 成都 610041)

        目的:探討益腎生精膠囊對鄰苯二甲酸二丁酯所致大鼠生殖功能損害的作用機(jī)制。方法:以鄰苯二甲酸二丁酯制備大鼠生殖功能損害模型;將大鼠分為空白對照組、模型對照組和益腎生精膠囊高、中、低劑量組;益腎生精膠囊高、中、低劑量組大鼠依次給予0.178,0.089,0.044 g/mL益腎生精膠囊混懸液10 μL/g灌胃,空白對照組、模型對照組大鼠給予生理鹽水10 μL/g灌胃,1 d 1次,連續(xù)用藥4周。4周后處死各組大鼠,檢測睪丸指數(shù)、附睪指數(shù)和睪丸基因Dzip1、Cat1 、Fas、C-jun的表達(dá)情況。結(jié)果:模型對照組、益腎生精膠囊低劑量組大鼠睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)較空白對照組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);益腎生精膠囊高劑量組、中劑量組大鼠睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)較模型對照組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);模型對照組、益腎生精膠囊低劑量組大鼠睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)較益腎生精膠囊高劑量組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。除益腎生精膠囊高劑量組外,各組大鼠睪丸基因Cat1、C-jun、Fas、Dzip1表達(dá)較空白對照組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);益腎生精膠囊高、中劑量組上述基因表達(dá)較模型對照組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);益腎生精膠囊中、低劑量組上述基因表達(dá)較益腎生精膠囊高劑量組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論:鄰苯二甲酸二丁酯可致大鼠睪丸與附睪指數(shù)下降,基因Cat1和Dzip1表達(dá)下調(diào),C-jun、Fas表達(dá)上調(diào);益腎生精膠囊可提高大鼠睪丸指數(shù)、附睪指數(shù),上調(diào)Dzip1和Cat1表達(dá),下調(diào)Fas、C-jun表達(dá)。

        不育癥;益腎生精膠囊/藥效學(xué);鄰苯二甲酸二丁酯;Dzip1;Cat1;Fas;C-jun;動(dòng)物;大鼠

        鄰苯二甲酸二丁酯(di-butyl phthalate,DBP)是當(dāng)前工作和生活中存在較多的環(huán)境毒物,作為增塑劑和軟化劑被廣泛應(yīng)用于食品包裝材料、醫(yī)學(xué)儀器、室內(nèi)裝潢材料、塑料、容器等[1]。研究表明:DBP可造成生殖器官發(fā)育畸形、生精功能障礙、雄激素水平下降等[2-4]。因此,研究有關(guān)DBP所致不育發(fā)病機(jī)制和藥物干預(yù)機(jī)制具有重要意義。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在改善男性生殖能力方面具有確切療效。本研究制備DBP致青春期Wistar雄性大鼠生殖功能損傷動(dòng)物模型,以大鼠睪丸、附睪指數(shù)和睪丸生殖相關(guān)基因?yàn)闄z測指標(biāo),研究DBP對青春期Wistar雄性大鼠生殖功能的損害作用,以及中藥復(fù)方益腎生精膠囊對其的干預(yù)作用,探討益賢生精腦囊可能的作用機(jī)制為男性不育癥臨床用藥提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 動(dòng) 物

        清潔級(jí) 2月齡青春期雄性Wistar大鼠100只,體質(zhì)量180~220 g,購自山東魯抗醫(yī)藥公司實(shí)驗(yàn)中心,質(zhì)量合格證號(hào):SCXF(魯)2008-0002。實(shí)驗(yàn)期間飼養(yǎng)于室溫(20±3.0)℃、相對濕度40%~60%、光照12 h∶12 h(光:暗)環(huán)境中,自由攝食、飲水。

        1.2 藥品與試劑

        益腎生精膠囊由以山茱萸、熟地黃、山藥、桑葚、枸杞子、五味子、鱉甲膠、淫羊藿、牡丹皮、川牛膝、酒大黃、敗醬草等藥物組成,0.33 g/粒,由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供,批號(hào)121112。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.7%的鄰苯二甲酸二丁酯,東莞市泰耀化工有限公司的產(chǎn)品,批號(hào)為130809;TRIZOL試劑盒、Super Quick RT cDNA試劑盒、Ultra SYBR Mixture試劑盒,均由康為世紀(jì)生物有限公司提供,批號(hào)依次為20130715,20130713,20130611。

        1.3 模型的建立、分組與給藥

        參照參考文獻(xiàn)[5-6]方法,以DBP灌胃來制備生殖功能損傷大鼠模型。將100只大鼠隨機(jī)分為空白對照組(20只)和造模組(80只)。以花生油溶解DBP,配制成100 g/L的混懸液。造模組大鼠灌胃體積為5 μL/g體質(zhì)量,灌胃劑量為500 μg/(g·d);空白對照組大鼠給予等量花生油灌胃;1 d 1次,連續(xù)灌胃4周。4周后,隨機(jī)抽取造模組和空白組大鼠各8只,麻醉處死,收集附睪精液,測定精子濃度、活力與畸形率;另取睪丸組織,使用顯微測微器測量睪丸橫切面曲細(xì)經(jīng)管直徑、生精上皮高度。將兩組大鼠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對比,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),提示造模成功。 將造模成功的64只大鼠隨機(jī)分為模型對照組和益腎生精膠囊高、中、低劑量組4組,每組16只。益腎生精膠囊高、中、低劑量組大鼠依次給予0.178,0.089,0.044 g/mL益腎生精膠囊混懸液10 μL/g灌胃,空白對照組、模型對照組大鼠給予生理鹽水10 μL/g灌胃,1 d 1次,連續(xù)用藥4周。

        1.4 檢測指標(biāo)標(biāo)本采集

        用藥4周后,稱量大鼠體質(zhì)量;麻醉,固定,腹部備皮;局部皮膚消毒,切開陰囊皮膚、皮下組織,摘取雙側(cè)睪丸、附睪,稱量質(zhì)量,并詳細(xì)記錄;使用雙面刀將右側(cè)睪丸組織沿其最大切面切開,放入實(shí)驗(yàn)標(biāo)本凍存管中,以液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.4.1 睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)

        計(jì)算公式:睪丸指數(shù)=睪丸質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g);附睪指數(shù)=附睪質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

        1.4.2 睪丸生殖相關(guān)基因檢測

        每份睪丸組織剪取50~100 mg,放入研缽中,以眼科剪剪碎,并加入液氮,研磨為粉末狀;加1 mL Trizol試劑,研磨至均勻混懸液;將上述混懸液轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中,室溫中放置5 min;加200 μL 氯仿,混勻30 s,室溫放置3 min;以低溫高速離心機(jī)(4 ℃,12 000 g)離心15 min后,將上層水相輕輕轉(zhuǎn)入另一支1.5 mL EP管中;加入500 μL 4 ℃ 預(yù)冷的異丙醇溶液,手動(dòng)顛倒輕輕混勻,室溫中放置10 min;以低溫高速離心機(jī)(4 ℃,12 000 g)離心10 min后,可見白色膠狀沉淀物即為RNA;加入1 mL 預(yù)冷的750 mL/L乙醇溶液(以無菌1mL /L DEPC水配制),溫和振蕩離心管,懸浮沉淀;于低溫高速離心機(jī)(4 ℃,7 500 g)離心5 min;洗滌RNA,棄上清;于低溫高速離心機(jī)(4 ℃,7 500 g)離心2 min,重復(fù)洗滌RNA,槍頭吸棄上清,室溫干燥5 min;加入20 μL 無菌的1mL/L DEPC水,56 ℃助溶5 min;于-76 ℃冷藏保存以備用。睪丸生殖相關(guān)基因Dzip1、Cat1、 Fas、C-jun檢測均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        2 結(jié) 果

        2.1 大鼠一般情況

        造模過程中因灌胃操作失誤致大鼠死亡9只,其中空白組1只,造模組8只。藥物干預(yù)過程中因灌胃操作失誤、大鼠斗咬致死等致大鼠死亡8只,其中模型對照組3只,益腎生精膠囊高劑量組3只,益腎生精膠囊中、低劑量組各1只。

        2.2 各組大鼠睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)對比

        模型對照組、益腎生精膠囊低劑量組大鼠睪丸與附睪指數(shù)明顯降低,較空白對照組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。益腎生精膠囊高、中劑量組大鼠睪丸與附睪指數(shù)明顯增大,較模型對照組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);模型對照組、益腎生精膠囊低劑量組大鼠睪丸與附睪指數(shù)明顯降低,較益腎生精高劑量組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

        組 別動(dòng)物數(shù)睪丸指數(shù)附睪指數(shù)空白對照組1110.35±0.821.98±0.36模型對照組137.54±0.44**△△1.37±0.31**△△益腎生精膠囊高劑量組1310.41±0.79##2.03±0.35##益腎生精膠囊中劑量組159.98±0.75##1.89±0.32##△△益腎生精膠囊低劑量組157.67±0.46**△△1.39±0.48**△△

        注:與空白對照組對比,** P<0.01;與模型對照組對比,## P<0.01;與益腎生精膠囊高劑量組對比,△△ P<0.01。

        2.3 各組大鼠睪丸生殖相關(guān)基因Dzip1、Cat1、Fas、C-jun表達(dá)對比

        2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

        本實(shí)驗(yàn)采用2-ΔΔCt法,分別對目的基因和參比基因繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(以Cat1基因?yàn)槔?,見圖1、圖2)。

        圖1 Cat1標(biāo)準(zhǔn)曲線

        圖2 GAPDH標(biāo)準(zhǔn)曲線

        2.3.2 擴(kuò)增曲線和溶解曲線

        各樣品同時(shí)擴(kuò)增目的基因和參比基因,每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置對照組。擴(kuò)增曲線初始為比較低平直線;當(dāng)循環(huán)達(dá)到閾值后,開始陡然升高,并隨循環(huán)數(shù)增加呈現(xiàn)指數(shù)型遞增;當(dāng)熒光強(qiáng)度達(dá)最大值后,循環(huán)數(shù)雖不斷增加,熒光強(qiáng)度不變;各曲線變化相似,未檢測到非特異曲線,擴(kuò)增效率較高。融解曲線初始為平臺(tái)型;當(dāng)達(dá)到一定溫度后,急速上升,并隨溫度增加而升高;當(dāng)溫度達(dá)到Tm值后,隨著溫度繼續(xù)增加,曲線下降;當(dāng)降到與初始水平相近時(shí),曲線則保持恒定不變;各曲線變化相似,熒光峰值陡峭而尖銳,無非特異峰。以4例樣本為例,下圖為各個(gè)目的基因及參比基因的擴(kuò)增曲線和溶解曲線。見圖3~圖10。

        左側(cè)為GAPDH擴(kuò)增線;右側(cè)為Cat1擴(kuò)增線

        左側(cè)為Cat1溶解曲線;右側(cè)為GAPDH溶解曲線

        左側(cè)為GAPDH擴(kuò)增線;右側(cè)為C-jun擴(kuò)增線

        左側(cè)為C-jun溶解曲線;右側(cè)為GAPDH溶解曲線

        左側(cè)為GAPDH擴(kuò)增線;右側(cè)為Dzip1擴(kuò)增線

        左側(cè)為Dzip1溶解曲線;右側(cè)為GAPDH溶解曲線

        左側(cè)為GAPDH擴(kuò)增線;右側(cè)為Fas擴(kuò)增線

        左側(cè)為Fas溶解曲線;右側(cè)為GAPDH溶解曲線

        2.3.3 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

        見表2。

        組 別動(dòng)物數(shù)Dzip1Cat1FasC-jun空白對照組111.17±0.171.24±0.171.07±0.171.08±0.17模型對照組130.47±0.16**0.56±0.13**1.88±0.17**1.75±0.15**益腎生精膠囊高劑量組130.98±0.14##1.09±0.15##1.04±0.16##1.05±0.18##益腎生精膠囊中劑量組150.76±0.15**##△△0.78±0.17**##△△1.35±0.14**##△△1.38±0.17**##△△益腎生精膠囊低劑量組150.58±0.16**△△0.57±0.17**△△1.57±0.17**△△1.56±0.18**△△

        注:與空白對照組對比,**P<0.01;與模型對照組對比,##P<0.01;與益腎生精膠囊高劑量組對比,△△P<0.01。

        3 討 論

        臟器指數(shù)是較常用的毒理實(shí)驗(yàn)指標(biāo),可在一定程度上反映組織器官的損傷或修復(fù)情況,敏感、有效,且檢測簡單易行。正常情況下,臟器指數(shù)為固定值。動(dòng)物染毒之后,臟器一旦受到損傷,其質(zhì)量可發(fā)生變化,臟器指數(shù)亦可發(fā)生改變。反映雄性動(dòng)物生育功能的最直接、最重要器官為睪丸與附睪,其中睪丸是產(chǎn)生精子的重要器官,附睪是精子成熟的重要場所,故本研究選定睪丸指數(shù)、附睪指數(shù)作為觀測指標(biāo)。

        Cat1特異性表達(dá)于睪丸與精子,對鞭毛鞭打運(yùn)動(dòng)起著一定調(diào)節(jié)作用,維持精子前向直線運(yùn)動(dòng)的能力,對維持精子運(yùn)動(dòng)起著重要的作用[7-9]。Fas基因?qū)儆谀[瘤壞死因子、神經(jīng)壞死因子受體超家族。有研究表明:支持細(xì)胞FasL高表達(dá),可以啟動(dòng)表達(dá)Fas基因的生精細(xì)胞凋亡性死亡過程,進(jìn)而調(diào)控生精細(xì)胞增值、分化、精子數(shù)量。C-jun原癌基因位于人類染色體1p31~32,對維持細(xì)胞正常的生理功能具有重要的作用,在生精細(xì)胞的增值分化中,尤其是對減數(shù)分裂、精子變態(tài)具有重要的調(diào)節(jié)作用[10]。Dzip1基因特異性表達(dá)于睪丸組織與生精細(xì)胞[11]。

        本研究結(jié)果顯示:模型對照組大鼠睪丸、附睪指數(shù)明顯下降,睪丸基因Dzip1、Cat1表達(dá)下調(diào),F(xiàn)as、C-jun表達(dá)上調(diào)。由此筆者推斷:DBP可導(dǎo)致大鼠的睪丸和附睪損傷,并影響相關(guān)生殖基因表達(dá),致生殖功能下降。

        男性不育癥屬中醫(yī)學(xué)“無子”“無嗣”等范疇。《黃帝內(nèi)經(jīng)》中指出“腎藏精”,主生殖與發(fā)育。男性不育癥主要為腎精虧損,辨證以腎虛為主。腎為生殖之根本,腎中精氣直接關(guān)系男性的生殖能力。腎精虧虛是男性不育的主要病理環(huán)節(jié);DBP作為一種致病“疫毒”邪氣,從口、鼻、皮膚而入,漸而蓄積成毒,久而內(nèi)舍臟腑,留滯經(jīng)脈;因此,腎虛精虧、瘀毒留滯是DBP所致男性不育的主要病機(jī),治療應(yīng)以補(bǔ)腎填精、祛瘀解毒為根本大法。益腎生精膠囊以山茱萸、熟地黃、山藥、桑葚、枸杞子、五味子、鱉甲膠、淫羊藿等補(bǔ)腎填精為主,佐以牡丹皮、川牛膝、酒大黃、敗醬草等祛瘀解毒,具有補(bǔ)腎益精、祛瘀解毒標(biāo)本兼顧之功效。

        本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:益腎生精膠囊可明顯改善DBP對大鼠睪丸、附睪造成的損傷,改善其生殖功能,能上調(diào)Dzip1、Cat1的表達(dá),下調(diào)Fas、C-jun的表達(dá)。因此,我們推測益腎生精膠囊提高生育能力機(jī)制可能為:改善睪丸附睪指數(shù),通過上調(diào)Dzip1、Catsper1表達(dá),下調(diào)Fas、C-jun表達(dá),促進(jìn)受損睪丸生精功能的恢復(fù),而保證精子的正常發(fā)生和成熟。

        此外,睪丸生精細(xì)胞凋亡、附睪精子成熟等過程都是極其復(fù)雜的,需要諸多分子協(xié)調(diào)、共同參與完成,而中藥復(fù)方具有多種藥理作用和生物活性,對生殖功能的調(diào)節(jié)作用是極其廣泛的,有多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn);因此,益腎生精膠囊改善生殖功能的具體作用環(huán)節(jié)尚有待進(jìn)一步深入研究。

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        (編輯 陶 珠)

        1001-6910(2016)11-0070-06

        R698+.2

        B

        10.3969/j.issn.1001-6910.2016.11.29

        李俊濤(1978-),男(漢族),河南洛陽人,主治醫(yī)師,醫(yī)學(xué)博士,從事男科學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究工作。

        曲曉偉,主治醫(yī)師,醫(yī)學(xué)博士, qu0371@126.com

        四川省教育廳課題(12ZA033)

        2016-08-24;

        2016-10-19

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