李喜香，潘從澤，王建良，李季文，畢映燕，張亞會(huì)，錢夢茹

(1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730020； 2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

補(bǔ)腦軟膠囊對血管性癡呆小鼠學(xué)習(xí)、記憶能力和海馬組織的影響*

李喜香1，潘從澤2，王建良2，李季文2，畢映燕2，張亞會(huì)2，錢夢茹2

(1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730020； 2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050)

目的：觀察補(bǔ)腦軟膠囊對血管性癡呆小鼠模型的學(xué)習(xí)、記憶能力和海馬組織的影響。方法：采用反復(fù)加閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈方法制備血管性癡呆小鼠模型。將造模成功的小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組,模型對照組,補(bǔ)腦軟膠囊高、中、低劑量組和尼莫地平組6組。給藥第20天進(jìn)行用跳臺實(shí)驗(yàn)檢測小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力；給藥第28天取小鼠海馬組織進(jìn)行HE染色，觀測CA1區(qū)的組織病理學(xué)改變。結(jié)果：學(xué)習(xí)成績方面，各給藥組與模型對照組對比，學(xué)習(xí)反應(yīng)時(shí)間均縮短，錯(cuò)誤次數(shù)均減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；補(bǔ)腦軟膠囊高劑量組與尼莫地平組對比，反應(yīng)時(shí)間縮短，錯(cuò)誤次數(shù)減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。記憶成績方面，各給藥組與模型對照組對比，潛伏期時(shí)間均延長，錯(cuò)誤次數(shù)均減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；補(bǔ)腦軟膠囊高劑量組與尼莫地平組對比，潛伏時(shí)間延長，錯(cuò)誤次數(shù)減少，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；補(bǔ)腦軟膠囊高劑量組與低劑量組對比，錯(cuò)誤次數(shù)減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各給藥組均可減輕海馬組織CA1錐體細(xì)胞的損傷，補(bǔ)腦軟膠囊高劑量組優(yōu)于尼莫地平組。結(jié)論：補(bǔ)腦軟膠囊能夠改善血管性癡呆小鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力，減輕海馬組織損傷，對血管性癡呆小鼠有一定的治療作用。

補(bǔ)腦軟膠囊/藥效學(xué)；跳臺實(shí)驗(yàn)；學(xué)習(xí)記憶；海馬病理；動(dòng)物；小鼠

血管性癡呆(vasculardementia，VD) 是各種腦血管病變引起的獲得性智能損害和認(rèn)知障礙的綜合征，是一種慢性進(jìn)行性疾病，表現(xiàn)為記憶、計(jì)算、定向、判斷能力下降，可伴有情感障礙、行為異常、認(rèn)知功能障礙和相關(guān)腦血管病的神經(jīng)功能障礙[1]。如何改善和提高VD患者的學(xué)習(xí)、記憶能力，已成為醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。補(bǔ)腦膏(批準(zhǔn)文號甘藥制字Z04000828)是甘肅省中醫(yī)院院內(nèi)制劑。近30a的臨床實(shí)踐證實(shí)，其對腦外傷性神經(jīng)損傷及后遺癥，腦炎、腦膜炎后遺癥，脊髓變性等腦部疾病療效確切，同時(shí)對血管性癡呆的治療和預(yù)防有明顯的臨床效果[3-4]。補(bǔ)腦軟膠囊是在補(bǔ)腦膏原處方基礎(chǔ)上，運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)研制而成。本實(shí)驗(yàn)將補(bǔ)腦軟膠囊內(nèi)容物作用于血管性癡呆小鼠模型，探討其療效及部分作用機(jī)制，從而為補(bǔ)腦軟膠囊的臨床用藥提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

健康SPF級KM小鼠，雄性，體質(zhì)量22～25g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號：SCXK(甘)2011-0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

補(bǔ)腦軟膠囊由川芎、當(dāng)歸、黃芪、枸杞子、黃精、仙茅、淫羊藿等藥物組成，將浸膏粉加入大豆油基質(zhì)、潤濕劑司盤-80、助懸劑蜂蠟、助流劑微粉硅膠，1g內(nèi)容物含浸膏粉0.48g；尼莫地平片，四川科倫藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號B140901015；注射用硝普鈉，湖南科倫制藥有限公司產(chǎn)品，批號B14050503。水合氯醛，天津市大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品，批號20141013；40g/L多聚甲醛，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品，批號20141223。DT200小鼠跳臺測試儀，成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品；TEC-VEMJ2 全自動(dòng)組織包埋機(jī)、VIP-5Jr-J2自動(dòng)組織脫水機(jī)、IVS-410石蠟切片機(jī)，均為日本SakuraFinetekJapanCo.Ltd產(chǎn)品；Bio-Rad680多功能酶標(biāo)儀，美國伯樂公司產(chǎn)品；OlympusCKS41倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；SIGMA3-18K低溫高速離心機(jī)，德國希格瑪公司產(chǎn)品。

1.3 模型的建立與動(dòng)物分組

60只小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組(生理鹽水10μL/g)、模型對照組(生理鹽水10μL/g)、補(bǔ)腦軟膠囊高劑量(800μg/g)組、補(bǔ)腦軟膠囊中劑量(400μg/g)組、補(bǔ)腦軟膠囊低劑量(200μg/g)組和尼莫地平組(尼莫地平14μg/g)6組，每組10只。術(shù)前12h禁食、不禁水；以水合氯醛(500μg/g)腹腔注射麻醉小鼠，仰臥固定于手術(shù)臺上，常規(guī)消毒，頸部正中切口；分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)；在夾閉雙側(cè)CCA之前，腹腔注射硝普鈉(2.5μg/g)，隨即用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)CCA10min；再通10min；再夾閉10min；再通后縫合切口，放回籠中保溫飼養(yǎng)。假手術(shù)組僅分離雙側(cè)CCA，不夾閉雙側(cè)CCA，不注射硝普鈉[5-6]。術(shù)中小鼠肛溫保持在36.5～37.5 ℃之間。術(shù)后連續(xù)3d肌肉注射青霉素以預(yù)防感染。各組手術(shù)后第1天均以灌胃方式給藥(按體質(zhì)量10μL/g)，連續(xù)給藥28d，1d1次。藥物均精密稱定，以滅菌后的生理鹽水配置為混懸液。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 跳臺實(shí)驗(yàn)

灌胃第20天進(jìn)行跳臺實(shí)驗(yàn)，將小鼠置于反射箱內(nèi)適應(yīng)5min后輕放于平臺上，小鼠在平臺的停留時(shí)間為潛伏期。小鼠從平臺跳下、接觸銅柵視為錯(cuò)誤，將受到電刺激后跳回平臺以躲避傷害性刺激視為正常反應(yīng)。記錄小鼠首次受到電刺激跳回平臺所需時(shí)間(即反應(yīng)時(shí)間)、跳下安全臺次數(shù)(即錯(cuò)誤次數(shù))作為學(xué)習(xí)成績。于訓(xùn)練后24h進(jìn)行測驗(yàn)，記錄第1次跳下平臺的潛伏期、5min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)作為記憶成績[7]。

1.4.2 組織病理學(xué)

灌胃第28天進(jìn)行小鼠海馬部位取材。用冰的生理鹽水進(jìn)行心臟灌注后，分離兩側(cè)小鼠海馬組織，一側(cè)海馬組織以40g/L多聚甲醛進(jìn)行固定，洗滌，脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，貼片，烤片，二甲苯脫蠟及水化，HE染色，封片等，采用光學(xué)顯微鏡(200倍)觀察海馬組織的變化。每個(gè)標(biāo)本連續(xù)切片5張，切片厚度4μm。正常海馬組織形態(tài)為CA1區(qū)錐體細(xì)胞分4層排列，排列整齊，形態(tài)完整，層次分明；胞質(zhì)均質(zhì)染色，核大而圓，胞核無固縮；纖維結(jié)構(gòu)清晰可辨，未有淋巴細(xì)胞浸潤[8～9]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠學(xué)習(xí)成績和記憶成績對比

學(xué)習(xí)成績：與假手術(shù)組對比，模型對照組小鼠的反應(yīng)時(shí)間延長，錯(cuò)誤次數(shù)增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明小鼠的學(xué)習(xí)成績下降。與模型對照組對比，各治療組反應(yīng)時(shí)間均縮短，錯(cuò)誤次數(shù)均減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。補(bǔ)腦軟膠囊高劑量組與尼莫地平組對比，反應(yīng)時(shí)間縮短，錯(cuò)誤次數(shù)減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與中、低劑量組對比，反應(yīng)時(shí)間均明顯縮短，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明：各治療組均能提高血管性癡呆小鼠跳臺實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)能力，且在改善反應(yīng)時(shí)間方面補(bǔ)腦軟膠囊呈量效關(guān)系。

記憶成績：與假手術(shù)組對比，模型對照組小鼠的潛伏時(shí)間縮短，錯(cuò)誤次數(shù)增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明記憶成績下降。與模型對照組對比，各治療組潛伏時(shí)間均延長，錯(cuò)誤次數(shù)均減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。補(bǔ)腦軟膠囊高劑量組與尼莫地平對照組對比，潛伏時(shí)間延長，錯(cuò)誤次數(shù)減少，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與低劑量組對比，錯(cuò)誤次數(shù)減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明：各治療組均可提高血管性癡呆小鼠跳臺記憶成績，且在增加潛伏時(shí)間方面有量效關(guān)系的趨勢。見表1。

組 別劑量/(μg·g-1)學(xué)習(xí)成績(灌胃第20天)反應(yīng)時(shí)間/s錯(cuò)誤次數(shù)/次記憶成績(灌胃第21天)反應(yīng)時(shí)間/s錯(cuò)誤次數(shù)/次假手術(shù)組15.06±5.04**2.50±1.20**165.88±18.06**2.70±1.44模型對照組53.94±11.577.60±2.5280.14±21.407.80±2.40補(bǔ)腦軟膠囊高劑量組80024.42±5.40**##△**4.30±1.56**#△150.95±20.49**△△4.10±1.32*補(bǔ)腦軟膠囊中劑量組40030.36±5.04**5.20±1.60*135.77±30.09**5.60±2.28補(bǔ)腦軟膠囊低劑量組20035.21±7.97**6.30±1.36139.49±38.63**5.90±1.88尼莫地平組1433.11±8.77**5.70±1.50123.92±21.68**5.10±1.54*

注：與模型對照組對比，*P<0.05，**P<0.01；與補(bǔ)腦軟膠囊低劑量組對比，#P<0.05，##P<0.01;與尼莫地平組對比，△P<0.05，△△P<0.01；與補(bǔ)腦軟膠囊中劑量對比，＊＊P<0.01。

2.2 各組小鼠海馬組織CA1區(qū)組織病理學(xué)改變

光鏡下，假手術(shù)組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞分4層排列，排列整齊，形態(tài)完整，層次分明；胞質(zhì)均質(zhì)染色，核大而圓，胞核無固縮；纖維結(jié)構(gòu)清晰可辨，未見淋巴細(xì)胞浸潤。模型對照組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)量明顯減少，排列散亂，層次不清；局部可見淋巴細(xì)胞浸潤；部分錐體細(xì)胞明顯受損，胞漿內(nèi)可見空泡形成，細(xì)胞核固縮，纖維結(jié)構(gòu)零亂不清。各治療組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞輕度損傷或者損傷不明顯，未見錐體細(xì)胞數(shù)量明顯減少；局部細(xì)胞排列紊亂，纖維結(jié)構(gòu)略零亂、不清晰；局部錐體細(xì)胞可見胞漿空泡形成。其中補(bǔ)腦軟膠囊高劑量組小鼠海馬 CA1區(qū)有少量脫失的錐體細(xì)胞，少數(shù)細(xì)胞核固縮，錐體細(xì)胞纖維排列較為整齊；中、低劑量組小鼠海馬 CA1區(qū)錐體細(xì)胞部分脫失，部分細(xì)胞核固縮為三角形或多角形；尼莫地平組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞損傷不明顯，未見錐體細(xì)胞數(shù)量明顯減少，局部細(xì)胞排列紊亂、纖維結(jié)構(gòu)零亂、不清晰，局部少量錐體細(xì)胞可見胞漿空泡形成。結(jié)果表明：藥物對海馬組織細(xì)胞起到了保護(hù)作用，補(bǔ)腦軟膠囊高劑量作用優(yōu)于尼莫地平。見圖1。

A.假手術(shù)組;B.模型對照組;C.補(bǔ)腦軟膠囊高劑量組;D.補(bǔ)腦軟膠囊中劑量組;E.補(bǔ)腦軟膠囊低劑量組;F.尼莫地平組

3 討 論

跳臺實(shí)驗(yàn)通過記錄實(shí)驗(yàn)小鼠到安全平臺的時(shí)間和受到電擊的次數(shù)來反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尋找安全平臺的空間認(rèn)知能力和學(xué)習(xí)記憶能力[8]。本研究結(jié)果表明：補(bǔ)腦軟膠囊對VD小鼠的學(xué)習(xí)記憶有一定的改善作用，與模型對照組對比，高劑量組反應(yīng)時(shí)間、潛伏時(shí)間、錯(cuò)誤次數(shù)均有顯著性差別，中、低劑量改善作用相對較弱，有明顯的量效關(guān)系趨勢，呈劑量依賴性。海馬是與認(rèn)知功能密切相關(guān)的重要腦區(qū)，是學(xué)習(xí)、記憶的高級中樞之一，直接參與信息的整合與貯存；是空間學(xué)習(xí)記憶能力的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，損害海馬則影響空間學(xué)習(xí)記憶；因此，選擇海馬作為研究學(xué)習(xí)、記憶能力的主要部位，有著極其重要的意義。腦組織中海馬區(qū)對缺血、缺氧最為敏感，其中海馬CA1區(qū)是海馬中最易受損的區(qū)域。急、慢性腦血管病變后海馬CA1區(qū)細(xì)胞明顯受損，伴隨記憶力明顯下降。海馬組織中神經(jīng)元的存活數(shù)量直接影響神經(jīng)元突觸的可塑性效應(yīng)，影響信息的整合、儲(chǔ)存和傳遞。因此，急、慢性腦血管病變后腦組織缺血、缺氧導(dǎo)致海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞遲發(fā)性壞死，神經(jīng)元的大量凋亡丟失，可能是患者腦卒中后發(fā)生 VD 的病理學(xué)基礎(chǔ)[9-11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：補(bǔ)腦軟膠囊高、中、低劑量組和尼莫地平組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞輕度損傷或者損傷不明顯，未見錐體細(xì)胞數(shù)量明顯減少。結(jié)果表明：補(bǔ)腦軟膠囊對VD有一定的改善作用。

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(編輯 陶 珠)

1001-6910(2016)11-0067-04

R749.1+

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2016.11.28

李喜香(1968-)，女(漢族)，甘肅秦安人，主任中藥師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥制劑工藝研究。

蘭州市科技計(jì)劃(2012-2-78)

2016-05-16；

2016-09-06