榮春書，連 鑫，王偉剛，鄭宗宇，高寶山*

(1．長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，吉林 長春130021；2.吉林大學第一醫(yī)院，吉林 長春130021)

?

血漿蛋白可屏蔽人類循環(huán)中IgG抗體對凋亡細胞的反應(yīng)活性

榮春書1，連 鑫2，王偉剛2，鄭宗宇2，高寶山2*

(1．長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，吉林 長春130021；2.吉林大學第一醫(yī)院，吉林 長春130021)

目的 明確血漿蛋白影響循環(huán)中IgG抗體對凋亡細胞的反應(yīng)性，并探索檢測此類抗體活性的最佳條件。方法 分別檢測純化前及純化后的IgG抗體對凋亡細胞的反應(yīng)性。檢測所用樣本來源于：(1)10例發(fā)生移植腎抗體介導(dǎo)排異反應(yīng)(AMR)患者的血漿樣本；(2)從以上10例患者血漿中純化的IgG抗體；(3)分泌IgG抗體的永生化B淋巴細胞克隆培養(yǎng)上清液；(4)從同一永生化B淋巴細胞克隆培養(yǎng)上清液中純化的IgG抗體。結(jié)果 當IgG從血漿中純化出來時，其對凋亡細胞的反應(yīng)性顯著增強。對于某些單克隆B細胞分泌的IgG抗體，只有將此抗體從細胞培養(yǎng)上清液中純化，才能檢測到其對凋亡細胞的反應(yīng)性。而胎牛血清(FCS)可部分阻滯純化IgG抗體對凋亡細胞的反應(yīng)性。結(jié)論 當血漿蛋白存在時，循環(huán)中IgG抗體對凋亡細胞的反應(yīng)性可被屏蔽。在檢測此類抗體的活性時，有必要將其從血漿中純化出來以提高檢測的準確性。

多反應(yīng)性抗體；凋亡細胞；蛋白；腎臟移植

(ChinJLabDiagn,2016,20:1892)

健康人群中具有凋亡細胞反應(yīng)性的自然抗體以IgM為主，但此類抗體也可以IgG類型存在[1-4]。自然抗體的IgM類型具有重要的免疫調(diào)節(jié)特性，但通過類型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生的IgG的功能尚不清楚。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)在腎移植患者中，與移植腎功能正常的患者相比較，經(jīng)歷抗體介導(dǎo)的移植腎排異反應(yīng)(Antibody mediated rejection，AMR)的患者血漿IgG對凋亡細胞的反應(yīng)性明顯升高[5]。功能檢測發(fā)現(xiàn)，此類IgG抗體可以激活補體途徑，導(dǎo)致C4d沉積于凋亡細胞的表面。我們的研究結(jié)果提示，在生理條件下分泌自然抗體IgM的B淋巴細胞在AMR進程中可通過類型轉(zhuǎn)換分泌IgG。正因為此類IgG有補體激活的特性，因此可能在疾病的病理過程中具有潛在作用。

在平行研究中，我們從一位AMR患者的血細胞中成功永生化了一系列B細胞克隆，通過對克隆的鑒定，我們發(fā)現(xiàn)多反應(yīng)性克隆分泌的抗體可以與諸如DNA、LPS等結(jié)構(gòu)毫不相關(guān)的抗原發(fā)生反應(yīng)。在研究中偶然發(fā)現(xiàn)，從血漿樣本中將IgG純化后，其對凋亡細胞的反應(yīng)性顯著升高。因此我們假設(shè)，血漿蛋白對自然IgG抗體的活性起到了屏蔽作用，可以部分影響其對凋亡細胞的反應(yīng)性。本研究中，我們應(yīng)用多克隆及單克隆的自然抗體IgG來驗證此假設(shè)，并旨在探尋檢測人類血漿標本中自然IgG抗體的最佳條件。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究所用血漿樣本來源于：腎移植術(shù)后出現(xiàn)移植腎AMR的患者10例；所用外周血細胞來源于一位經(jīng)歷移植腎AMR的患者及健康志愿者。

1.2 方法

1.2.1 B淋巴細胞的分離及體外永生化

將液氮凍存的腎移植患者及健康志愿者外周血細胞復(fù)蘇，CD19+(BD公司)磁珠將B淋巴細胞從外周血細胞中分離。將免疫純化后的B淋巴細胞進行有限稀釋，在96 孔V 底細胞培養(yǎng)板的每孔中加入50 μl 由EBV 轉(zhuǎn)染的狨猴B95-8 細胞株培養(yǎng)上清液(其內(nèi)含EBV)，含50000個經(jīng)5Gy 射線照射的Jurkat細胞做為支持細胞，并向每孔中加入CpG 2006(InvivoGen公司)，最終濃度為2.5 μg/ml。定期更換細胞培養(yǎng)基，待細胞集落擴增后，收集細胞培養(yǎng)上清液待檢測。通過檢測最終獲得具有多反應(yīng)性的IgG抗體(克隆編號D8C6、D8H9、E17B2及E16F6)，抗體濃度3-5 μg/ml。

1.2.2 血清IgG細胞培養(yǎng)上清液中IgG的純化

將血漿與純化緩沖液以1∶10混勻后加入預(yù)裝有吸附膠體及濾膜的純化容器(Thermo Scientific)，6 000 rpm 離心2 min，通過濾膜落入Eppendorf試管中的即純化后的IgG抗體。細胞培養(yǎng)上清液中的IgG抗體應(yīng)用protein G 微球(NEB公司)純化。1.2.3 血清及細胞培養(yǎng)上清液中IgG對凋亡細胞的反應(yīng)性人類T淋巴細胞白血病Jurkat細胞株應(yīng)用紫外線照射(240×10-3焦)并于37℃孵育箱內(nèi)孵育20 h誘導(dǎo)凋亡，將分別從腎移植患者、健康志愿者血漿及細胞培養(yǎng)上清液中純化的IgG抗體與1×106誘導(dǎo)凋亡后的Jurkat細胞株混勻，37℃孵育30 min，低溫洗滌二次，分別向標本中加入FITC耦聯(lián)的抗IgG的二抗(Invitrogen公司)，40℃避光孵育30 min。低溫洗滌二次，流式細胞儀(C6，BD)檢測IgG對凋亡細胞的反應(yīng)性。反應(yīng)強度用平均熒光強度(MFI)表示。

1.2.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件，Student配對t檢驗用以比較純化前IgG抗體及純化后IgG抗體對凋亡細胞的反應(yīng)性，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 純化前后血漿IgG對凋亡細胞的反應(yīng)性比較

我們檢測了10位AMR腎移植患者純化前血清及純化后血清IgG對凋亡細胞的反應(yīng)性。如圖1所示，與純化前血漿相比較，絕大部分血漿純化后IgG對凋亡細胞的反應(yīng)性顯著升高(P=0.0321)。我們在實驗中加入了胎牛血清(Fetal calf serum，F(xiàn)CS)來進一步驗證血漿蛋白對IgG反應(yīng)性的屏蔽作用。結(jié)果顯示，以Pt.8為例，F(xiàn)CS對純化IgG反應(yīng)活性的屏蔽作用為劑量依賴性的(圖2A)。當AMR患者純化IgG中加入10%濃度的FCS后，大多數(shù)患者血漿IgG對凋亡細胞的反應(yīng)性顯著降低(P=0.0055)(圖2B)。

圖1 AMR患者血漿IgG及純化后IgG對凋亡細胞的反應(yīng)性

2.2 純化前后細胞培養(yǎng)上清液IgG抗體對凋亡細胞的反應(yīng)性比較

為進一步驗證上述發(fā)現(xiàn)在單克隆細胞及抗體水平是否適用，我們首先檢測了細胞培養(yǎng)上清液中純化的IgG對凋亡細胞的反應(yīng)性，如圖3A所示，將自然抗體IgG從含有FCS的培養(yǎng)上清液中純化后，其對凋亡細胞的反應(yīng)性均有升高，而作為沒有凋亡細胞反應(yīng)性的對照克隆E16F6，抗體純化后對凋亡細胞的反應(yīng)性無明顯變化。而且在單克隆的反應(yīng)體系中加入FCS也能不同程度的屏蔽IgG對凋亡細胞的反應(yīng)性(P=0.0674)(圖3B)。

3 討論

在既往研究中，我們報道了發(fā)生AMR的腎移植患者循環(huán)中多反應(yīng)性IgG抗體可對多種抗原及凋亡細胞發(fā)生反應(yīng)[5]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，當將IgG抗體從血漿中純化后，其對凋亡細胞的反應(yīng)性顯著升高(P=0.0321)，而將純化的IgG抗體中再次加入FCS后，其對凋亡細胞的反應(yīng)性則顯著降低(P=0.0055)。因此我們根據(jù)實驗結(jié)果推測，作為多反應(yīng)性抗體可以識別的某些蛋白諸如牛血清蛋白，可能屏蔽多反應(yīng)IgG對凋亡細胞的反應(yīng)活性。

圖2 (A)不同濃度FCS對Pt.8純化IgG凋亡細胞反應(yīng)性的影響；(B)AMR患者血漿純化IgG及加入FCS后分別對凋亡細胞的反應(yīng)性

圖3 (A) B淋巴細胞培養(yǎng)上清液IgG純化前及純化后對凋亡細胞的反應(yīng)性(B)B淋巴細胞培養(yǎng)上清液純化IgG及加入FCS后分別對凋亡細胞的反應(yīng)性

類似的發(fā)現(xiàn)曾被Spalter等學者報道[6]，通過檢測多反應(yīng)IgG 對ABO抗原的反應(yīng)性發(fā)現(xiàn)，未純化血清中的IgG抗體對自身A或B抗原的反應(yīng)性相對較低，而將IgG從同一份血清中純化后，其對自身A或B抗原的反應(yīng)性則顯著升高。以往人們認為，健康個體血清中所包含的抗體僅對非表達于紅細胞表面的血型抗原發(fā)生反應(yīng)，而這個發(fā)現(xiàn)對此觀點提出了挑戰(zhàn)。Spalter及其他學者也通過研究發(fā)現(xiàn)，對血清IgG結(jié)合能力的調(diào)節(jié)取決于個體基因的差異[6-8]，而自身反應(yīng)性的IgM抗體可通過V區(qū)依賴的相互作用從而阻礙多反應(yīng)性IgG與自身抗原的結(jié)合。

多反應(yīng)性抗體普遍存在于健康人群的血清中，并主要以IgM形式存在。盡管多反應(yīng)性IgM具有與自身抗原結(jié)合的能力，但此類抗體對健康個體并非有害。事實上，多反應(yīng)性IgM可通過對凋亡細胞的結(jié)合及抑制炎癥反應(yīng)，從而可能在維持個體在穩(wěn)定階段的平衡起到至關(guān)重要的作用[9]。與此相反，在健康人群中很少能檢測到多反應(yīng)性IgG，此類抗體與諸如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)等自身免疫性疾病的病理過程密切相關(guān)，在這個病程中，凋亡細胞的清除過程可能受到干擾[10-12]?；诒狙芯康陌l(fā)現(xiàn)，由于人類血漿中多反應(yīng)性IgG的活性可被部分血漿蛋白所屏蔽，因此所檢測到的活性遠遠低于此類抗體的實際活性，故人類血漿中多反應(yīng)性抗體IgG的活性可能被低估。我們建議在檢測人類多反應(yīng)性抗體IgG對凋亡細胞的結(jié)合能力及其功能時，有必要將此類抗體從血漿中純化出來以提高對其檢測的準確性。

[1]Peng Y,Kowalewski R,Kim S,et al.The role of IgM antibodies in the recognition and clearance of apoptotic cells[J].Mol Immunol,2005,42(7):781.

[2]Ehrenstein MR,Notley CA.The importance of natural IgM:scavenger,protector and regulator[J].Nat Rev Immuno,2010,10(11):778.

[3]Kaveri SV.Intravenous immunoglobulin:exploiting the potential of natural antibodies[J].Autoimmun Rev,2012,11(11):792.

[4]Kaveri SV,Silverman GJ,Bayry J.Natural IgM in immune equilibrium and harnessing their therapeutic potential[J].J Immunol,2012,188(3):939.

[5]Porcheray F,Fraser JW,Gao B,et al.Polyreactive Antibodies Developing Amidst Humoral Rejection of Human Kidney Grafts Bind Apoptotic Cells and Activate Complement[J].Am J Transplant,2013,13(10):2590.

[6]Spalter SH,Kaveri SV,Bonnin E,et al.Normal human serum contains natural antibodies reactive with autologous ABO blood group antigens[J].Blood,1999,93(12):4418.

[7]Adib M,Ragimbeau J,Avrameas S,et al.IgG autoantibody activity in normal mouse serum is controlled by IgM[J].J Immunol,1990,145(11):3807.

[8]Melero J,Tarrago D,Nunez-Roldan A,et al.Human polyreactive IgM monoclonal antibodies with blocking activity against self-reactive IgG[J].Scand J Immunol,1997,45(4):393.

[9]Chen Y,Park YB,Patel E,et al.IgM antibodies to apoptosis-associated determinants recruit C1q and enhance dendritic cell phagocytosis of apoptotic cells[J].J Immunol,2009,182(10):6031.

[10]Cabral AR,Alarcon-Segovia D.Autoantibodies in systemic lupus erythematosus[J].Curr Opin Rheumato,1998,10(5):409.

[11]Lee JY,Huerta PT,Zhang J,et al.Neurotoxic autoantibodies mediate congenital cortical impairment of offspring in maternal lupus[J].Nature Medic,2009,15(1):91.

[12]Zhang J,Jacobi AM,Mackay M,et al.Identification of DNA-reactive B cells in patients with systemic lupus erythematosus[J].J Immunol Methods,2008,338(1-2):79.

Circulating human IgG reactive to apoptotic cells are masked by plasma proteins

RONGChun-shu1,LIANXin2,WANGWei-gang,etal.

(1.TheAffiliatedHospitaltoChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130021,China;2.TheFirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Objective To confirm the influence of plasma proteins on the reactivity of circulating IgG to apoptotic cells and to develop an optimal methodology for studying these antibodies.Methods IgG reactivity to apoptotic cells was assessed before and after purification.The following sources of IgG were used:(1) Plasma specimens from 10 kidney transplant recipients with AMR;(2) purified IgG from the same 10 AMR patients;(3) supernatant from IgG-producing immortalized B cell clones;(4) purified IgG from the same B cell clone supernatants.Results Results Plasma IgG reactivity to apoptotic cells was dramatically increased following purification.We observed that reactivity to apoptotic cells could only be detected after purification for some monoclonal IgG produced by B cell clones.Fetal calf serum (FCS) partially reversed the apoptotic-binding potential of purified IgG.Conclusion The reactivity of circulating IgG to apoptotic cells is modified in the presence of plasma proteins.These antibodies must first be purified to remove plasma proteins in order to accurately assess their reactivity.

Polyreactive antibodies;Apoptotic cells;Protein;Kidney transplantation

吉林省科技發(fā)展計劃資助項目(20160101100JC);吉林省衛(wèi)生計生科研計劃資助項目(2014Z042)

1007-4287(2016)11-1892-04

R392.4

A

2016-02-13)

*通訊作者