◎曹海燕 桂 花 李維峰 陳小龍 王婭玲

超聲波輔助酶法優(yōu)化油茶粕蛋白的提取條件

◎曹海燕 桂 花 李維峰 陳小龍 王婭玲

為提高油茶粕蛋白的提取率，先對(duì)油茶粕進(jìn)行超聲波輔助、酶預(yù)處理，然后利用傳統(tǒng)堿提酸沉法進(jìn)行提取。采用單因素和正交試驗(yàn)選出最佳的超聲參數(shù)、酶條件并得出最佳提取工藝條件：超聲溫度50℃，超聲功率300W，超聲時(shí)間60min，纖維素酶添加量1.0%，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間120min，料液比為1∶20（g/ml）pH為4.5。此條件下，油茶粕蛋白質(zhì)的提取率可達(dá)80.83%。而未經(jīng)超聲和酶處理蛋白質(zhì)提取率僅為49.30%，表明此法可顯著提高油茶粕蛋白的提取率。

油茶粕也叫茶籽餅、茶麩、茶枯，呈紫褐色顆粒，是油茶籽經(jīng)榨油后的渣餅，含有大量的活性物質(zhì)如酚類、皂苷、多糖、黃酮、蛋白質(zhì)等。由于茶粕的蛋白質(zhì)含量較高，可作為高效有機(jī)肥，應(yīng)用在農(nóng)作物及果樹(shù)栽種中，效果極佳。

目前，提取油茶粕蛋白研究較多的是采用堿溶酸沉法或油茶籽先用酶預(yù)處理再采用堿溶酸沉法提取，都或多或少限制了油茶籽蛋白的利用。為提高油茶籽蛋白的提取率，先對(duì)油茶粕進(jìn)行超聲波處理，再經(jīng)酶處理，再利用傳統(tǒng)的堿溶酸沉法提取，為提高油茶粕蛋白的利用提供了參考依據(jù)。

材料和方法

材料與試劑

材料：茶粕來(lái)源于普洱云南淳普油脂有限公司，茶粕經(jīng)干燥、粉碎、80目過(guò)篩等預(yù)處理備用。

試劑：無(wú)水乙醇、鹽酸、濃硫酸、硫酸銅、氫氧化鈉，均為分析純；活性炭；a-淀粉酶(活力單位2000～5000U／g)、纖維素酶(活力單位大于等于15000U／g)。

主要儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋(DSY-2.8)：浙江余姚工業(yè)儀表三廠；85.2型微型織物試樣粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；臺(tái)式離心機(jī)(TDL-5)：上海安亭科學(xué)儀器廠；TL-18M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：上海市安亭科學(xué)儀器廠；生化培養(yǎng)箱(PYX-280S. A)：寧波江南儀器有限公司；AB204-E型電子分析天平、pH計(jì)：Mettlertoledo，Switzerland；101-1-S型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱、101-1-S型真空干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；K9840型自動(dòng)凱氏定氮儀、SH220型石墨消解儀、SOX406型脂肪測(cè)定儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司；DF-1型集熱式磁力攪拌器：常州市國(guó)華電器有限公司；FZ102型微型植物粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；CX-500型超聲波清洗機(jī)：北京醫(yī)療設(shè)備二廠。

試驗(yàn)方法

原料預(yù)處理。油粕經(jīng)70℃～80℃的烘箱中烘干，粉碎，過(guò)80目篩。稱取適量的上述茶粕粉末，加入10倍體積的70%乙醇溶液，以功率100W，超聲波輔助處理10min以去除茶皂素，抽濾，取渣，得到脫脂脫皂茶粕。

茶粕蛋白的提取方法。茶葉籽→去殼→去皮→粉碎→烘干(真空干燥)→過(guò)篩(80目)→脫脂(有機(jī)溶劑萃取)→脫溶→溶解(加水)→超聲波處理→酶處理→浸提(堿液)→離心(4000r／min，30min)→提取液(上清液)→調(diào)等電點(diǎn)→離心(4000r／min,20min)→沉淀→調(diào)至中性→冷凍干燥→茶葉籽蛋白

實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)超聲波處理、酶預(yù)處理后，又參考丁丹華等堿提酸沉工藝的較佳條件進(jìn)行油茶粕蛋白的提取。

分析方法。粗蛋白含量的測(cè)定：微量凱氏定氮法，參照GB／T5009.5—2003；粗脂肪含量的測(cè)定：索氏抽提法，參照GB 5512—85；水分含量的測(cè)定：常壓烘干法，參照GB／T 3543．6一1995；粗纖維的測(cè)定：參照GB 5514—85；灰分的測(cè)定：參照GB／T 8307—2002；還原糖的測(cè)定3，5一二硝基水楊酸法，參考GB／T 5513—85。

蛋白質(zhì)提取率。采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

蛋白質(zhì)提取率=(干燥后茶粕蛋白中蛋白質(zhì)含量／原料中蛋白質(zhì)含量)×100%。

油茶籽粕蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定。稱取10g樣品，料液比為1∶20,用NaOH調(diào)pH至10,溫度30℃磁力攪拌浸提1h。離心（3000r/min，20min）取上清液,分別取上清液7份各10mL,加鹽酸調(diào)pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,離心（3000r/ min，20min),棄上清液后稱重,重復(fù)一次，繪出沉淀量與pH值的曲線圖,圖1中沉淀量最大時(shí)的pH為蛋白質(zhì)等電點(diǎn)。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

采用單因素和正交試驗(yàn)選出最佳的提取參數(shù)，以堿浸提液pH、浸提溫度、浸提時(shí)間、超聲頻率、酶用量、酶解溫度、酶解時(shí)間、液料比為變量因素，以茶葉籽蛋白提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)．優(yōu)化超聲波輔助提取茶葉籽蛋白的工藝條件。

結(jié)果與分析

油茶籽粕蛋白等電點(diǎn)測(cè)定

油茶籽餅粕蛋白等電點(diǎn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

加酸至等電點(diǎn)是從提取液中分離蛋白的最簡(jiǎn)便方法，它能確保提取液中蛋白質(zhì)最大量的沉淀。因此，等電點(diǎn)的選擇是關(guān)鍵步驟。由圖1可知，油茶籽粕蛋白的沉淀量在pH為4.5時(shí)最大，故油茶籽蛋白提取最佳等電點(diǎn)為4.5。

超聲處理?xiàng)l件對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

超聲溫度對(duì)油茶籽蛋白提取率的影響。將過(guò)80目篩的脫脂粕取等量，按料液比

1∶20、pH10、超聲時(shí)間60min、超聲功率300W，考察超聲溫度對(duì)油茶籽蛋白提取率由圖2可知，超聲溫度為50℃時(shí)，油茶籽提取率最大。因?yàn)槌暅囟鹊陀?0℃時(shí)，分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)小，油茶籽粕中的蛋白質(zhì)與溶劑的相互作用不夠完全，從而降低了油茶籽蛋白提取率；而溫度高于50℃后，由于物料略有糊化，且部分蛋白質(zhì)發(fā)生局部變性可能使得油茶籽蛋白提取率降低，故選擇超聲波處理溫度為50℃。

超聲時(shí)間對(duì)油茶籽蛋白提取率的影響。將80目篩的脫脂粕取等量，在料液比1∶20、pH10、超聲溫度50℃、超聲功率300W的條件下，考察超聲時(shí)間對(duì)油茶籽蛋白提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，一開(kāi)始油茶籽蛋白提取率隨時(shí)間的增加而增大，當(dāng)超聲波處理時(shí)間為60min時(shí)，達(dá)到最大值，之后隨時(shí)間的延長(zhǎng)得率逐漸下降。這是由于在前60min內(nèi)超聲波對(duì)細(xì)胞膜的破碎作用較強(qiáng)，蛋白溶出物增多，得率不斷升高；而60min后內(nèi)蛋白質(zhì)得率下降，這可能是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間的增加，溫度急劇升高，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解或變性所致，故超聲波處理時(shí)間選擇60min。

超聲功率對(duì)油茶籽蛋白提取率的影響。將過(guò)80目篩的脫脂粕取等量，按料液比1∶20、pH10、超聲溫度50℃、超聲時(shí)間60min，考察超聲功率對(duì)油茶籽蛋白提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，起初油茶籽蛋白提取率隨著超聲功率的增大而逐漸增大，在300W時(shí)達(dá)到最大值，之后蛋白提取率下降，這可能是超聲波功率未達(dá)到300W前對(duì)細(xì)胞的空化作用逐漸增大，導(dǎo)致細(xì)胞破壁更充分，蛋白分離出來(lái)，到達(dá)300W后，油脂又和蛋白結(jié)合，導(dǎo)致蛋白提取率下降，所以選擇超聲波處理功率300W。

纖維素酶預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)茶粕蛋白質(zhì)提取的影響

纖維素酶添加量的確定。稱取一定量的脫脂脫皂茶粕，過(guò)80目篩后平均分為3份。設(shè)定預(yù)處理溫度為50℃，時(shí)間為9.0h，纖維素酶添加量分別為0.1%、0.4%、0.7%、1.0%、1.3%。測(cè)定茶粕蛋白質(zhì)含量并計(jì)算蛋白質(zhì)提取率確定合適的加酶量范圍。提取結(jié)果見(jiàn)圖5。

結(jié)果表明，隨著加酶量的增加，蛋白質(zhì)提取率也不斷增大；加酶量在0.4%至0.7%區(qū)域，蛋白質(zhì)提取率增幅較小并略有降低；加酶量在0.1%至0.4%和0.7%至1.0%區(qū)域，蛋白質(zhì)提取率增福最大，但加酶量在0.1%時(shí)，蛋白質(zhì)提取率最高，達(dá)74.2%；加酶量為1.0%至1.3%區(qū)域，蛋白質(zhì)提取率增福平緩。經(jīng)酶處理后的蛋白質(zhì)提取率比不加酶時(shí)的提取率(49.30%)明顯增加。最后,考慮到成本等因素,纖維素酶1.0%。

酶解時(shí)間的確定。在淀粉酶2.0%、纖維素酶1%，酶解溫度50℃，pH5條件下對(duì)茶粕處理，酶解時(shí)間分別為30、60、90、120、150min，酶滅活后按較佳堿提工藝對(duì)茶粕蛋白提取，提取結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)提取率相應(yīng)提高。酶解時(shí)間為30min時(shí)，茶粕蛋白提取率在62.5%，酶解時(shí)間為150min時(shí)，茶粕蛋白提取率在76.5%。酶解時(shí)間為120min時(shí)，茶粕蛋白提取率趨于平穩(wěn)。但考慮到節(jié)約能源等因素，酶預(yù)處理茶粕蛋白時(shí)間為120min。

酶解溫度的確定。淀粉酶添加量2.0%、纖維素酶添加量1%，酶解時(shí)間120min，pH為5條件下對(duì)茶粕蛋白預(yù)處理，酶解溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，酶滅活后按較佳堿提工藝對(duì)茶粕蛋白提取，提取結(jié)果見(jiàn)圖7。

由圖7可知，溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取有較大影響。蛋白質(zhì)提取率在溫度30℃至40℃范圍內(nèi)不斷升高，40℃至50℃范圍內(nèi)變化不大，當(dāng)溫度超過(guò)50℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率開(kāi)始下降，可能由于高溫使酶蛋白變性失活所致，所以在提取茶粕蛋白時(shí)選取50℃為最適溫度。

pH的確定。在淀粉酶添加量2.0%、纖維素酶添加量1%，料液比1∶20，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間120min的條件下對(duì)茶粕預(yù)處理，pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，酶滅活后按較佳提取工藝對(duì)油茶粕蛋白提取，提取結(jié)果見(jiàn)圖8。

由圖8可知，隨著pH值的變化，茶粕蛋白的提取率變化較大.在pH4.5時(shí)，提取率達(dá)到最大值，為77.40%。在pH5.0時(shí)，油茶粕蛋白的提取率為73.10%。此后，隨著pH值的增加，提取率繼續(xù)下降,但下降緩慢。所以在提取茶粕蛋白時(shí)選擇酶預(yù)處理的pH值為4.5。

討論

對(duì)于提取油茶粕蛋白，報(bào)道最多是酶預(yù)處理方法的研究，實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助，酶預(yù)處理后，再采用傳統(tǒng)的堿溶酸沉法提取。超聲輔助酶預(yù)處理后再結(jié)合堿溶酸沉法提取油茶籽粕蛋白，與傳統(tǒng)的堿溶酸沉法相比，具有提取時(shí)間更短、提取溫度更低、油茶籽蛋白提取率更高等優(yōu)點(diǎn)。

結(jié)論。油茶籽粕蛋白的等電點(diǎn)pH值為4.5時(shí)，此時(shí)蛋白質(zhì)的沉淀量最大。采用超聲波輔助，酶預(yù)處理油茶籽粕的最佳條件為：超聲波處理溫度為50℃,超聲處理時(shí)間60min，超聲波處理功率為300W，料液比1∶20，纖維素酶1.0%，酶預(yù)處理時(shí)間為120min，酶解溫度50℃，酶預(yù)處理的pH值為4.5，在此條件下，按照堿溶酸沉法提取油茶籽粕蛋白，蛋白質(zhì)的提取率可達(dá)80.83%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用傳統(tǒng)的堿溶酸沉法再結(jié)合超聲輔助和酶預(yù)處理，能夠從油茶籽粕中獲得較高提取率的油茶籽蛋白。這對(duì)于油茶籽蛋白的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。

(作者單位：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院熱帶作物與食品工程系)