王春伶，張富鐵，曹文宣，王劍偉

(1.中國科學(xué)院水生生物研究所，武漢430072；2.中國科學(xué)院水生生物多樣性與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430072；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

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王春伶1, 2, 3，張富鐵1, 2*，曹文宣1, 2，王劍偉1, 2

(1.中國科學(xué)院水生生物研究所，武漢430072；2.中國科學(xué)院水生生物多樣性與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430072；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

重金屬包括鎘和鉛等污染嚴(yán)重威脅人類健康。為從基因水平研究魚類應(yīng)答重金屬脅迫的分子機(jī)理，本研究利用抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建稀有鯽Gobiocyprisrarus對(duì)鎘處理反應(yīng)的正、反向抑制消減文庫。文庫質(zhì)量檢測表明消減效率達(dá)210倍，通過對(duì)正、反向文庫中部分表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行序列測定，獲得9條表達(dá)豐度較高的表達(dá)序列標(biāo)簽，平均長度為438 bp。利用快速擴(kuò)增cDNA末端技術(shù)克隆獲得核糖體蛋白s18(Rps18)基因的完整編碼區(qū)，序列長度為525 bp，其中編碼區(qū)459 bp，編碼152個(gè)氨基酸，3’非翻譯區(qū)38 bp，5’非翻譯區(qū)28 bp。并利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)Rps18基因在鉛脅迫下的表達(dá)譜進(jìn)行了研究，結(jié)果表明稀有鯽肝組織中Rps18基因的表達(dá)量變化較明顯。

稀有鯽；重金屬；抑制消減雜交；核糖體蛋白s18

鎘(Cd)和鉛(Pb)等重金屬污染對(duì)生物的生理活動(dòng)、生長發(fā)育及基因表達(dá)產(chǎn)生重要影響(Zhuetal.，2011)。水體重金屬污染不僅影響生活在其中的水生生物，還威脅人類健康，這種情況已經(jīng)受到我國政府的高度重視。本研究將稀有鯽Gobiocyprisrarus作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，希望闡述其應(yīng)答重金屬脅迫的分子機(jī)理，尋找適合監(jiān)測水體重金屬污染的分子標(biāo)記物。

抑制消減雜交(suppression subtractive hybridization，SSH)是Diatchenko等(1996)在mRNA差別顯示基礎(chǔ)上建立的一種新的消減雜交方法，它具有靈敏度高、操作簡單、假陽性低、速度快及效率高等特點(diǎn)，是目前克隆差異表達(dá)基因的重要手段之一，可以克隆出極為重要的基因。James等(2010)對(duì)印度明對(duì)蝦Fenneropenaeusindicus感染白斑綜合癥病毒后的肝胰腺組織進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)抗菌肽相關(guān)的克隆在所建消減庫中最為豐富，另外還包括信號(hào)轉(zhuǎn)換、能量傳導(dǎo)以及抗氧化酶類方面的克隆，這為甲殼類動(dòng)物先天免疫及差異表達(dá)基因作用的研究奠定了基礎(chǔ)。

核糖體是合成蛋白質(zhì)的細(xì)胞器，主要成分是核糖體RNA(rRNA)和核糖體蛋白(ribosomal protein，RP)，它們?cè)诘鞍踪|(zhì)合成中發(fā)揮重要作用，也參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、RNA加工、DNA修復(fù)等過程(Wool，1996)。有文獻(xiàn)報(bào)道，RP基因家族在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，RP的異常表達(dá)將引發(fā)各種疾病，包括腫瘤發(fā)生、免疫疾病、代謝病等(陳宏等，2005；李英華等，2012)。目前有研究表明，部分核糖體大亞基和小亞基蛋白能參與調(diào)控p53信號(hào)傳遞反應(yīng)。p53是重要的腫瘤抑制因子，具有DNA損傷修復(fù)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、分化及增殖抑制等功能，并通過調(diào)控細(xì)胞周期行進(jìn)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腫瘤抑制功能(李小光等，2013)，其過表達(dá)或激活可引發(fā)細(xì)胞死亡，低表達(dá)或失活會(huì)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生(Mirzayansetal.，2012)。在斑馬魚Daniorerio中，核糖體S7、S8、S15a、S18、S29、L7、L13、L23a、L35、L36等基因發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致斑馬魚癌癥的產(chǎn)生(Amsterdametal.，2004)，這可能與RP執(zhí)行的相關(guān)功能有關(guān)。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)魚飼養(yǎng)

1.2 RNA提取

將1.1中的組織放入研磨器中加RNA Lysis Buffer進(jìn)行充分研磨，取175 μL裂解液移至1.5 mL EP管中，加入350 μL RNA Dilution Buffer，按SV Total RNA Isolation System(Promega，USA)試劑盒說明書進(jìn)行操作，用紫外分光光度儀和0.8%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA進(jìn)行定量定性分析。

1.3 mRNA分離純化

用約300 μg合并后的總RNA分離純化mRNA，按照PolyATtractRmRNA Isolation Systems說明書進(jìn)行mRNA分離。

1.4 抑制消減雜交

具體操作按Clontech PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit說明書進(jìn)行。以重金屬處理組為試驗(yàn)方(tester)，以對(duì)照組為驅(qū)動(dòng)方(driver)進(jìn)行正向消減雜交；以對(duì)照組為試驗(yàn)方，重金屬處理組為驅(qū)動(dòng)方進(jìn)行反向消減雜交。

1.5 cDNA消減文庫的構(gòu)建

分別從正向和反向消減雜交的2次PCR產(chǎn)物中各取2 μL與1 μL PGEM-T Vector連接，4 ℃過夜。從體系中取5 μL轉(zhuǎn)化受體菌(大腸桿菌EscherichiacoliDH5α)，于氨芐抗性篩選的瓊脂糖平板上挑取單克隆于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，按常規(guī)保存菌種。

1.6 PCR鑒定插入片段

取1 μL細(xì)菌培養(yǎng)液作PCR模板，以插入片段兩側(cè)的載體序列M13F和M13R作引物，PCR擴(kuò)增插入片段。PCR體系(20 μL)：10×PCR Buffer 2 μL，M13F和M13R(10 mmol·L-1)各0.6 μL，dNTP Mix(2.5 mmol·L-1)0.5 μL，Mg2+2 μL，Taq酶0.3 μL，菌液1 μL，滅菌水13 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃30 s，49 ℃40 s，72 ℃1 min, 35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。

1.7 快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)技術(shù)獲得Rps18基因序列

RACE操作過程按照Clontech SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit具體說明進(jìn)行?；蛱禺愐?GSPs)分別為：GSP1：5’-AGTAGTCTTTGCGCGGAACCAGC-3’；GSP2： 5’-GTCACCACCCTCTCAACCTCATCCT-3’。5’-RACE過程：第一鏈由總RNA、5’-CDS primer A和SMARTⅡA oligo經(jīng)過GSP1和10×universal primer A mix PCR反應(yīng)獲得；3’-RACE過程：第一鏈由總RNA和3’-CDS primer A經(jīng)過GSP2和10×universal primer A mix PCR反應(yīng)獲得，PCR反應(yīng)條件：94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃3 min。反應(yīng)產(chǎn)物克隆至載體PGEM-T中進(jìn)行測序。所得序列經(jīng)BLAST分析比對(duì)，并用Clustal X和MEGA 4.0分別對(duì)不同物種Rps18基因的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行分析。

1.8 qPCR技術(shù)分析Rps18基因表達(dá)情況

用SuperReal PreMix(SYBR Green)(TIANGEN)對(duì)Pb處理后肝組織和肌肉組織不同時(shí)間點(diǎn)的Rps18基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。qPCR在CFX96TMReal-Time System(Bio-Rad)上進(jìn)行，β-actin作為內(nèi)參基因(Liuetal.，2008；Suetal.，2008)。qPCR體系(20 μL)：2×SuperReal PreMix 10 μL，引物各0.5 μL，模板1 μL。目的基因和內(nèi)參基因的引物見表1。PCR反應(yīng)條件：95 ℃15 min；95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃25 s，39個(gè)循環(huán)；熔解曲線：65 ℃5 s至95 ℃。內(nèi)參基因和管家基因引物的擴(kuò)增效率分別為96.8%和97.5%。用2-△△Ct計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量變化，其中Ct為達(dá)到閾值時(shí)擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)，具體公式為：相對(duì)表達(dá)量變化=2-△△Ct，△△Ct=[Ct(目的)-Ct(內(nèi)參)]處理組-[Ct(目的)-Ct(內(nèi)參)]對(duì)照組(Livak & Schmittgen，2001)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

1.9 數(shù)據(jù)分析

用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)方法(One-Way ANOVA)和Duncan’s多重比較方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，當(dāng)P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

譯文2：そういえば子供のころ、筋向かいの豆腐屋に、楊おばさんという人が一日じゅう座っていて、「豆腐屋小町」と呼ばれていたっけ。(竹內(nèi)好譯)

2 結(jié)果

2.1 消減文庫篩選結(jié)果

2.2 Rps18基因的序列分析

從SSH文庫篩選出245 bp Rps18基因的表達(dá)序列標(biāo)簽。經(jīng)3’-RACE和5’-RACE擴(kuò)增得到2段長度分別為418 bp和306 bp的片段，利用DNAMAN及BLAST進(jìn)行序列分析、比對(duì)及拼接，最后得到Rps18基因序列長度為525 bp(GenBank 登錄號(hào)為KF836434)?？寺〉玫降南∮婿aRps18基因包括3’非翻譯區(qū)38 bp，5’非翻譯區(qū)28 bp，編碼區(qū)459 bp，編碼152個(gè)氨基酸殘基，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA(圖4)。該序列中A、T、G、C的含量分別為28.4%、20.6%、22.6%和28.4%。

圖1 PCR檢測β-actin cDNA的消減效率電泳圖

M.100 bp DNA marker; 1～4.未消減cDNA在20, 25, 30和35個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物 PCR products of unsubtracted cDNA in 20, 25, 30 and 35 cycles, respectively; 5～8.消減后cDNA在20, 25, 30和35個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物 PCR products of subtracted cDNA in 20, 25, 30 and 35 cycles, respectively.

圖2 消減cDNA文庫外源插入片段的檢測

M.100 bp DNA marker; 1～12.cDNA片段 cDNA fragments.

圖3 稀有鯽經(jīng)Cd暴露后肝組織不同時(shí)間點(diǎn)

M.100 bp DNA marker; 1.暴露24 h時(shí)空白組的mRNA豐度 24 h in the blank; 2.暴露24 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組的mRNA豐度 24 h-post exposure to Cd; 3.暴露48 h時(shí)空白組的mRNA豐度 48 h in the blank; 4.暴露48 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組的mRNA豐度 48 h-post exposure to Cd.

使用MEGA 4.0軟件的鄰接法(Neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并用 bootstraps 進(jìn)行了500次重復(fù)(圖6)。繪制進(jìn)化樹所用物種包括：人Homosapiens、家犬Canisfamiliaris、牛Bostaurus、野豬Susscrofa、黑鼠Rattusrattus、褐家鼠R.norvegicus、熱帶爪蟾X.(Silurana)tropicalis、非洲爪蛙、長牡蠣、痢疾變形蟲Entamoebahistolytica、果蠅Drosophilamelanogaster和斑馬魚，結(jié)果表明稀有鯽Rps18基因和斑馬魚Rps18基因聚在一起，親緣關(guān)系最近。

圖4 稀有鯽Rps18基因核苷酸和氨基酸序列

2.3 Rps18基因qPCR分析

3 討論

SSH技術(shù)通過去除試驗(yàn)方和驅(qū)動(dòng)方中相同基因，并富集差異表達(dá)基因來篩選目的基因，這種方法可以消除cDNA群體內(nèi)部各分子間豐度的差異，從而分離與低豐度轉(zhuǎn)錄對(duì)應(yīng)的cDNA克隆(Diatchenko Hs.人Homosapiens, Cf.家犬Canisfamiliaris, Bt.牛Bostaurus, Ssc.野豬Susscrofa, Rr.黑鼠Rattusrattus, Rn.褐家鼠R.norvegicus, Xt.熱帶爪蟾Xenopus(Silurana)tropicalis, Xl.非洲爪蟾X.laovis, Cg.長牡蠣Crassostreagigas, Eh.痢疾變形蟲Entamoebahistolytica, Dm.果蠅Drosophilamelanogaster.Dr.斑馬魚Daniorerio.etal., 1996)。因此，對(duì)于篩選稀有鯽經(jīng)重金屬暴露后差異表達(dá)的基因有很大幫助。本研究從消減文庫中獲得多個(gè)差異表達(dá)的cDNA片段，序列分析表明，這些片段均與防御反應(yīng)有關(guān)。主要包括Apolipoprotein C-I、金屬硫蛋白、Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2a、Na+/K+ATPase、heat shock protein 27、phosphoenolpyruvate carboxykinase及ribosom-al protein S18基因等。這說明稀有鯽為應(yīng)對(duì)重金屬暴露的刺激，自身產(chǎn)生防御反應(yīng)，引起一些基因的表達(dá)量變化。

圖5 稀有鯽的Rps18基因和其他物種Rps18基因的氨基酸序列比對(duì)

Fig.5 Comparison ofGobiocyprisrarusRps18 amino acid sequence with other species

圖6 構(gòu)建的核糖體蛋白基因家族進(jìn)化樹

圖7 稀有鯽鉛(3.9 mg·L-1)暴露后肝臟組織(A)和肌肉組織(B)中不同時(shí)間點(diǎn)Rps18基因的相對(duì)表達(dá)量

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Construction and Analysis of the Subtractive cDNA Library ofGobiocyprisrarusTreated by Cd and Pb

WANG Chunling1, 2, 3, ZHANG Futie1, 2*, CAO Wenxuan1, 2, WANG Jianwei1, 2

(1.Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China;2.The Key Laboratory of Aquatic Biodiversity and Conservation, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China;3.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Heavy metals, such as cadmium (Cd), lead (Pb), can pose serious toxin to human and aquatic organisms.Suppression subtractive cDNA library ofGobiocyprisrarustreated by Cd was constructed to investigate the underlying mechanism.The efficiency of subtractive cDNA was reach up to 210folds.A total of 9 expressed sequence tags with average sequence length of 438 bp and enriched in the cDNA library were obtained.The complete coding sequence of ribosomal protein s18 (Rps18) fromG.raruswas amplified by rapid amplification of cDNA ends technology, and it is found that this gene comprised of 5’-UTR (28 bp), ORF region (459 bp) that encoded 152 amino acids (aa) and 3’-UTR (38 bp).Then the expression of Rps18 inG.rarusafter exposure to Pb was determined by real-time PCR, and the results showed that the expression difference of Rps18 was more obvious in liver than in muscle after Pb treatment.

Gobiocyprisrarus; heavy metal; suppression subtractive hybridization; ribosomal protein s18

2015-12-17 接受日期：2016-03-24 基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30900154); 中國科學(xué)院水生生物研究所青年人才創(chuàng)新項(xiàng)目(Y15E011101); 中國長江三峽集團(tuán)公司項(xiàng)目(0799522)

王春伶(1984—), 女, 博士, 實(shí)驗(yàn)師, 主要從事魚類遺傳學(xué)方面的研究, E-mail：chwang@ihb.ac.cn

*通信作者Corresponding author，男, 博士, 副研究員, 主要研究方向?yàn)轸~類保護(hù)遺傳學(xué)、分子生態(tài)學(xué)及分子生物學(xué), E-mail：futiezhang@ihb.ac.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20150403

Q9594; Q78

A

1000-7083(2016)03-0372-06