顧斌濤，黃 朝，黃國昌，邱小忠，呂 珺，張 婷

(江西省科學院微生物研究所，江西南昌 330096)

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里氏木霉纖維素酶水解稻草的研究

顧斌濤，黃 朝，黃國昌，邱小忠，呂 珺，張 婷

(江西省科學院微生物研究所，江西南昌 330096)

[目的]探討碳氮源對里氏木霉發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響，以及纖維素酶水解稻草的條件。[方法]通過添加不同的碳源和不同濃度的酵母粉，探討里氏木霉合適的發(fā)酵條件；使用不同添加量的纖維素酶對稻草進行酶解；分別利用纖維素酶、纖維素酶和木聚糖酶混合酶對稻草進行酶解反應。 [結(jié)果]利用乳糖和稻草的復合碳源和12 g/L的酵母粉進行水解時，纖維素酶活性較高。酶解適宜的酶用量為每克稻草底物200 U的濾紙酶。用纖維素酶及木聚糖酶混合酶酶解稻草96 h的酶解得率為65.4%。[結(jié)論]該研究可為里氏木霉纖維素酶生產(chǎn)和酶解稻草的應用提供一定的依據(jù)。

纖維素酶；里氏木霉；稻草酶解

纖維素是自然界存在的最豐富的可再生資源，稻草、玉米秸稈、麥稈和甘蔗渣等都是纖維素的來源。纖維素酶是一組能夠水解纖維素中β-1，4葡萄糖苷鍵的復合酶，包括纖維二糖水解酶(又稱外切葡聚糖酶)、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶[1-5]。纖維素酶的3種組分通過協(xié)同作用，將纖維素降解為葡萄糖。利用纖維素酶將含纖維素的農(nóng)林副產(chǎn)物進行降解糖化，進而發(fā)酵生產(chǎn)出燃料乙醇和各類生物化工產(chǎn)品，這對于解決能源短缺、保護環(huán)境和促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。

將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為燃料乙醇需要一系列復雜的工藝，主要包括原料預處理、酶解糖化和發(fā)酵等步驟[6]。減少產(chǎn)酶成本和增加糖化酶解得率是該工藝中的技術(shù)難點。Li等[7]利用纖維素酶降解甘蔗渣纖維素，當酶解量為7.5 FPIU/g時纖維素的酶解率高達 82%，通過進一步發(fā)酵最終產(chǎn)乙醇濃度為40.6 g/L。Singhania等[8]通過試驗提高了纖維素酶中的β-葡萄糖苷酶活性，能更有效水解纖維素，說明β-葡萄糖苷酶是酶解糖化的關(guān)鍵組分之一。Hu等[9]報道，增加木聚糖酶用量可以提高纖維素酶水解纖維素的酶解得率。筆者用稻草秸稈作為里氏木霉發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的碳源，并利用所產(chǎn)纖維素酶對稻草秸稈進行酶解糖化，旨在為稻草秸稈的生物利用和高效轉(zhuǎn)化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 ①里氏木霉E4由江西省科學院微生物研究所實驗室保存。稻草采自江蘇省蘇州市吳江區(qū)黎里，烘干后密封冷藏保存。②化學試劑均為國產(chǎn)分析純。③種子培養(yǎng)基：葡萄糖16.0 g/L、酵母粉20.0 g/L、(NH4)2SO42.5 g/L、MgSO41.0 g/L、CaCl20.6 g/L、KH2PO45.0 g/L、FeSO4·7H2O 5.0 mg/L、MnSO4·H2O 1.5 mg/L、ZnSO4·7H2O 1.5 mg/L、CoCl2·6H2O 3.0 mg/L；產(chǎn)酶培養(yǎng)基：乳糖18.0 g/L、稻草20.0 g/L、酵母粉12.0 g/L、(NH4)2SO45.0 g/L、MgSO41.0 g/L、CaCl20.6 g/L、KH2PO45.0 g/L、FeSO4·7H2O 5.0 mg/L、MnSO4·H2O 1.5 mg/L、ZnSO4·7H2O 1.5 mg/L、CoCl2·6H2O 3.0 mg/L。

1.2 試驗方法

1.2.1 稻草預處理。稻草秸稈剪至2 cm左右，與2%的氫氧化鈉溶液混合，常壓37 ℃下放置24 h，再在高壓105 ℃條件下反應50 min。反應結(jié)束后，用自來水反復沖洗，再用蒸餾水沖洗3次。

1.2.2 產(chǎn)酶試驗。在PDA平板上培養(yǎng)里氏木霉120 h，轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，再按照10%的接種量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基(50 mL裝液量)，在溫度28 ℃和轉(zhuǎn)速180 r/min的條件下培養(yǎng)，定時取樣檢測酶活力。其中，產(chǎn)酶培養(yǎng)基的碳源條件分別為乳糖38.0 g/L、稻草38.0 g/L以及混合碳源(乳糖18.0 g/L、稻草20.0 g/L)。

1.2.3 酶活性測定。①內(nèi)切葡聚糖酶活性(EGA)。用pH 4.8的檸檬酸緩沖液配制1%的羧甲基纖維素鈉，與適當稀釋的酶液在50 ℃水浴中反應30 min，采用DNS法測定還原糖含量。1個活力單位為1 h由底物產(chǎn)生 1.0 mg還原糖所需酶量，用U/mL表示。②纖維二糖水解酶活性(CBHA)。底物微晶纖維素與稀釋酶液在50 ℃水浴中反應30 min，采用DNS法測定還原糖含量。1個活力單位為1 h由底物產(chǎn)生 1.0 mg還原糖所需酶量，用U/mL表示。③β-葡萄糖苷酶活性(BGA)。采用葡萄糖氧化酶法測定β-葡萄糖苷酶活性，底物為纖維二糖。1個單位的β-葡萄糖苷酶活力為1 h產(chǎn)生2.0 mg葡萄糖所需的酶量，用U/mL表示。④濾紙酶活性(FPA)。取Whatman 1號濾紙與適當稀釋的酶液在50 ℃水浴中反應30 min后，采用DNS法測定還原糖含量。1 h生成1.0 mg還原糖所需的酶量計為1個單位的濾紙酶活，用U/mL表示。

1.2.4 稻草酶解試驗。將pH 4.8的檸檬酸緩沖液配制的纖維素酶與經(jīng)堿處理的稻草殘渣混合，放入恒溫水浴振蕩器，在50 ℃、100 r/min的條件下反應48 h，采用DNS法測定酶解反應液中還原糖的含量。纖維素酶添加量分別為1 g底物50、100、150、200、250和300 U(FPA)的酶液，另外添加木聚糖酶試驗的用酶量為1 g底物200 U。按照以下公式計算酶解得率：酶解得率(%)=還原糖總量(g)×0.9×100%/0.658 g，其中 0.658 g為1 g底物中纖維素和半纖維素的質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對里氏木霉產(chǎn)酶的影響 從圖1可以看出，乳糖對里氏木霉產(chǎn)纖維素酶有一定的誘導作用，酶活力在發(fā)酵初期上升很快，但由于乳糖為可溶性糖，消耗過快，發(fā)酵48 h后酶活不再增加。使用不溶性的稻草為碳源時，酶活力緩慢上升，最后酶活力水平不高，而且發(fā)酵時間長；使用乳糖和稻草的復合碳源纖維素酶活力高，發(fā)酵120 h時纖維素酶活力為55.4 U/mL。

圖1 不同碳源對產(chǎn)纖維素酶活力的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on cellulase production

2.2 不同濃度酵母粉對里氏木霉產(chǎn)酶的影響 利用不同濃度的酵母粉進行發(fā)酵產(chǎn)酶，結(jié)果表明當酵母粉濃度為12 g/L時里氏木霉產(chǎn)纖維素酶活力最高，進一步增加酵母粉濃度并不利于纖維素酶活力的提高(表1)，這主要由于酵母粉濃度過高引起木霉菌體生長過度所致。

2.3 纖維素酶添加量對稻草酶解的影響 從圖2可以看出，當酶液添加量從50 U/g增加至200 U/g，稻草酶解得率顯著增加，當酶液添加量為200 U/g時的酶解得率為58%。當酶液添加量從200 U/g增加至300 U/g，稻草酶解得率的增加幅度相對較少，當酶液添加量為300 U/g時的酶解得率為62%?？紤]到實際應用中纖維素酶的成本，選取1 g底物200 U濾紙酶活的發(fā)酵酶液酶解稻草。

表1 不同濃度酵母粉對產(chǎn)纖維素酶的影響

Table 1 Effect of yeast powder at different concentration on cellulase production

酶母粉濃度Concentrationofyeastpowderg/L發(fā)酵時間Fermentationtime∥h纖維素酶活力CellulaseactivityU/mL生產(chǎn)率ProductivityU/(h·mL)39627.30.28612042.50.35912048.60.411212055.40.461512053.20.441812050.40.42

圖2 纖維素酶添加量對酶解得率的影響Fig.2 Effect of cellulase dosage on yield of enzymatic hydrolysis

2.4 纖維素酶和木聚糖酶酶解稻草的進程 分別利用纖維素酶、纖維素酶和木聚糖酶混合酶對稻草進行酶解反應。從圖3可以看出，酶解反應前24 h酶解得率的增加幅度較大，24 h后酶解得率增加較為緩慢。由于能夠降解稻草中的木聚糖，用纖維素酶和木聚糖酶混合酶的酶解效果好于單獨使用纖維素酶，混合酶酶解稻草48 h的酶解得率為63%。

圖3 纖維素酶和木聚糖酶酶解稻草的時間進程Fig.3 Time courses of enzymatic hydrolysis of rice straw by cellulase and xylanase

3 結(jié)論與討論

該研究利用乳糖和稻草為復合碳源，用12.0 g/L的酵母粉為氮源，發(fā)酵120 h里氏木霉產(chǎn)纖維素酶酶活為55.4 U/mL。里氏木霉是目前重要的產(chǎn)纖維素酶的工業(yè)菌株，能分泌組分較為齊全、酶活力較高的木質(zhì)纖維素酶系[1，10-12]。木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為燃料乙醇的過程中，纖維素酶成本的降低和酶解效率的提高是生產(chǎn)生物質(zhì)燃料乙醇的關(guān)鍵。稻草秸稈在我國是價格低廉的大宗農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物，研究用稻草作為碳源能大大降低產(chǎn)纖維素酶的成本。

該研究利用里氏木霉纖維素酶對堿預處理稻草進行酶解，48 h酶解得率為58%。當使用添加木聚糖酶的混合酶進行酶解時，48 h酶解得率為63%。稻草秸稈的主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，稻草堿預處理比酸預處理能去除更多的木質(zhì)素，在去除木質(zhì)素和獲得可發(fā)酵性己糖和戊糖方面具有優(yōu)勢[13-14]。在酶解稻草方面，各類木質(zhì)纖維素降解酶系的組分越齊全，越能獲得較好的酶解效果。該研究可為利用稻草產(chǎn)纖維素酶及稻草的高效轉(zhuǎn)化利用奠定基礎。

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Enzymatic Hydrolysis of Rice Straw byTrichodermareeseiCellulase

GU Bin-tao, HUANG Zhao, HUANG Guo-chang et al

(Institute of Microbiology, Jiangxi Academy of Sciences, Nanchang, Jiangxi 330096)

[Objective] To investigate the effects of carbon and nitrogen sources on cellulase production byTrichodermareeseiand the conditions for enzymatic hydrolysis of rice straw. [Method] The fermentation conditions ofT.reeseiwere studied by adding different carbon sources and yeast powder of different concentration. Enzymatic hydrolysis of rice straw was carried out using different amounts of cellulase, and the enzymatic hydrolysis reaction of rice straw was carried out by cellulase and mixed enzyme of cellulase and xylanase. [Result] Cellulase activity was high when the compound carbon source of lactose and rice straw and yeast powder concentration of 12 g/L were used. The suitable amount of enzyme was 200 U (FPA) per gram of rice straw for enzymatic hydrolysis. After 96 h enzymatic hydrolysis of rice straw, the yield of 65.4% was achieved by combination of cellulase and xylanase. [Conclusion] The study provided a certain basis of application ofT.reeseicellulase production and enzymatic hydrolysis of rice straw.

Cellulase;Trichodermareesei; Enzymatic hydrolysis of rice straw

江西省科研院所基礎設施配套項目(20142BBA13030)；江西省科學院科研開發(fā)專項(2014-YYB-01)；江西省科學院協(xié)同創(chuàng)新專項資金普惠一類項目(2013-XTPH-29)。

顧斌濤(1980-)，男，江蘇蘇州人，助理研究員，博士，從事工業(yè)酶制劑的研究。

2016-09-09

Q 814.9

A

0517-6611(2016)31-0001-02