宋益哲，任 英，婁茹云，王秀麗，于煒婷，馬小軍

(1. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連 116023；2. 大連醫(yī)科大學(xué) 組胚教研室，遼寧 大連 116622； 3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100039)

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膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的構(gòu)建及其對細胞行為的影響*

宋益哲1,3，任 英1,3，婁茹云1,3，王秀麗2，于煒婷1，馬小軍1

(1. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連 116023；2. 大連醫(yī)科大學(xué) 組胚教研室，遼寧 大連 116622； 3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100039)

利用溶液共混法制備了膠原/海藻酸鈉混合液，建立了制備膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的方法，并證實互穿網(wǎng)絡(luò)凝膠中，膠原與海藻酸鈣二者共存且相互獨立，膠原結(jié)構(gòu)保持完好。與傳統(tǒng)海藻酸鈣水凝膠相比，本文建立的膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面疏水性增強且凝膠結(jié)構(gòu)更加疏松，更利于細胞粘附與物質(zhì)傳遞。以人源成纖維細胞為模型，通過考察細胞在凝膠表面與凝膠內(nèi)部的形態(tài)，進一步證實膠原分子在膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的表面與內(nèi)部均有分布。細胞遷移實驗結(jié)果也表明該膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠不僅能有效保持細胞活性，且為細胞遷移行為的研究提供了一種新的研究模型。

海藻酸鈉；膠原；互穿網(wǎng)絡(luò)；理化性質(zhì)；細胞行為

0 引 言

海藻酸鈉是來自褐藻的一種天然多糖，由D-甘露糖醛酸(M單元)和L-古洛糖醛酸(G單元)通過1,4-糖苷鍵連接而成[1-2]。海藻酸鈣凝膠不僅具有良好的力學(xué)性能以進行空間支撐或填充，還具有良好的生物相容性、低免疫原性，是目前常用的三維(3D)細胞培養(yǎng)支架[3]。然而，海藻酸鈉的親水性太強，細胞很難在海藻酸鈣凝膠表面粘附和內(nèi)部伸展，并且部分細胞如胰島細胞[4]，原代肝細胞[5]和干細胞[6]等在海藻酸鈣凝膠內(nèi)部很難保持比較好的細胞活性和功能。膠原是動物體內(nèi)含量最豐富的細胞外基質(zhì)成分，其在組織、器官形成和細胞功能方面起到重要作用[7]，但是純的膠原凝膠力學(xué)性能差，無法廣泛使用。

互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(interpenetrating polymer network, 簡稱IPN)技術(shù)是由兩種或兩種以上的聚合物通過網(wǎng)絡(luò)相互貫穿纏結(jié)形成的一類獨特的聚合物結(jié)構(gòu)[8-9]。共混是制備互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的常用方法，同時也是改善高分子材料性能及細胞粘附和伸展行為的重要手段[10-11]。本文利用溶液共混法將膠原溶液與海藻酸鈉溶液共混，采用分步互穿法制備膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。先調(diào)節(jié)pH值和溫度使膠原凝膠化，再通過Ca2+引入使海藻酸鈉凝膠化，從而制備成膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。

本文重點考察了膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的表面結(jié)構(gòu)、親疏水性和表面形貌及膠原的二級結(jié)構(gòu)。與傳統(tǒng)海藻酸鈣凝膠網(wǎng)絡(luò)相比，膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠呈現(xiàn)更疏水、更高孔徑的物化性質(zhì)。并以人源成纖維細胞為模型，研究細胞在膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面和內(nèi)部的粘附、伸展和遷移行為，證實本文建立的膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠可作為支架模型用于研究細胞的生物學(xué)行為。

1 實 驗

1.1 實驗材料

海藻酸鈉：青島晶巖生物科技開發(fā)有限公司，分子量(Mw)為430 kDa；膠原I型：西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。人源成纖維(HSF)細胞：中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細胞庫。

1.2 實驗方法

1.2.1 平板海藻酸鈣及膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的制備

海藻酸鈣凝膠(Alg)的制備：將300 μL濃度為1.5%(質(zhì)量分數(shù))海藻酸鈉(NaAlg)溶液流延平鋪于經(jīng)鉻酸洗液洗滌并干燥的圓形蓋玻片(直徑為3 cm)上，靜置5 min后浸于1.1%(質(zhì)量分數(shù)) CaCl2溶液中形成海藻酸鈣凝膠。

膠原/海藻酸互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠(Col/Alg)的制備：采用10×HG-DMEM溶液和1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)3.6 mg/mL膠原溶液的滲透壓和pH值，置于冰上待用。將1.5%(質(zhì)量分數(shù))海藻酸鈉和膠原溶液按照1∶2體積比進行混合后平鋪于玻片上，將其置于37 ℃含5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，使膠原凝膠化，再將其浸于1.1%(質(zhì)量分數(shù)) CaCl2溶液中使其中海藻酸鈉凝膠化，從而制備成膠原/海藻酸互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。

1.2.2 傅里葉紅外光譜(FT-IR)

采用傅里葉光譜儀TENSOR27 (德國BRUKER公司) 進行測定：用傅里葉衰減全反射紅外光譜模式對凝膠表面進行掃描，掃描波長范圍為400～4 000 cm-1[12]。

1.2.3 接觸角的測定

凝膠經(jīng)30%，50%，70%，90%，95%和100%(質(zhì)量分數(shù))乙醇梯度脫水真空干燥后，采用接觸角測量儀(德國KRUSS公司)表征凝膠(或凝膠膜)的親疏水性。以蒸餾水為標準溶液測量凝膠的接觸角。測量時所用的水滴體積為3.0 μL。滴注后10 s內(nèi)測量。數(shù)據(jù)是在3個不同位置測量的平均值[13]。

1.2.4 圓二色光譜

稱取一定量的膠原與(或)海藻酸鈉溶解于1 mmol/L的醋酸鈉緩沖液(pH值=4.0)中，制備終濃度分別為200 μg/mL膠原溶液和100 μg/mL海藻酸鈉溶液混合液、200 μg/mL膠原溶液和100 μg/mL海藻酸鈉溶液，于4 ℃環(huán)境中靜置12 h。采用圓二色光譜儀MOS450(法國BioLogic)分別對上述3種樣品在190～260 nm進行掃描[14]。

1.2.5 掃描電鏡

凝膠經(jīng)30%，50%，70%，90%，95%和100%(質(zhì)量分數(shù))乙醇梯度脫水后，采用CO2臨界點干燥儀K850(英國Quorum公司)進行干燥。樣品噴金后，采用用掃描電鏡Supra 55 VP (德國 Zeiss公司)觀察表面形貌[8]。

1.2.6 細胞粘附及伸展

將一定細胞密度的人源成纖維細胞(HSF)分別接種在凝膠內(nèi)部及凝膠表面，觀察細胞在凝膠內(nèi)部或凝膠表面粘附及伸展情況。

1.2.7 細胞死活情況檢測—live/dead染色

將染色工作液(2 μmol/L Calcein AM，4 μmol/L ED-1溶于0.9%NaCl溶液)加入到載有細胞的凝膠中，37 ℃孵育1 h。孵育后采用生理鹽水清洗2次，于激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞染色情況：活細胞由Calcein標記在485 nm波長下發(fā)出綠色熒光；死細胞由ED-1標記在530 nm下發(fā)出紅色熒光。

1.2.8 細胞遷移

采用細胞探針DiO標記HSF細胞，再將熒光標記HSF細胞接種在凝膠表面，培養(yǎng)14 d后，采用激光共聚焦進行觀察，層層掃描、三維重建后，觀察細胞能否從凝膠表面遷移至凝膠內(nèi)部[15-16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 Col/Alg凝膠結(jié)構(gòu)分析

圖1 干燥后Alg凝膠、Col凝膠和Col/Alg表面的紅外光譜圖

Fig 1 FT-IR spectra of the surface of dried Alg gels, Col gels and Col/Alg gels

2.2 膠原二級結(jié)構(gòu)分析

通常，天然存在的膠原在190～260 nm波長范圍存在兩個峰：198 nm處的負峰和221 nm處的正峰。從圖2可以看出，與海藻酸鈉混合的膠原混合液及膠原溶液在198和221 nm處均有明顯的吸收峰，表明在膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠中，膠原仍然保持其天然的三股螺旋結(jié)構(gòu)。

圖2 Collagen和Col/Alg混合液的圓二色光譜

Fig 2 CD spectra of the collagen solution and Col/Alg solution

2.3 親疏水性分析

采用躺滴法測量了干燥后Alg凝膠和Col/Alg凝膠表面的水接觸角以分析其親疏水性。由圖3可知，與傳統(tǒng)海藻酸鈣凝膠相比，膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面接觸角由(21.08±1.19)°降低至(10.55±0.95)°，接觸角顯著降低。結(jié)果表明，膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面的疏水性顯著增強，較傳統(tǒng)海藻酸鈣凝膠更利于細胞粘附。

圖3 不同凝膠或凝膠膜的水接觸角

Fig 3 Water contact angles of Alg gels and Col/Alg solution

2.4 表面形貌分析

由于本文制備的海藻酸鈣水凝膠和膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠都是高含水量的水凝膠(含水量高達90%以上)，因此傳統(tǒng)的真空干燥方法將極大破壞凝膠結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致SEM觀測的表面形貌嚴重失真。為了最大程度保持凝膠表面形貌，本文采用CO2超臨界流體干燥法干燥水凝膠。圖4可以看出，Alg凝膠和Col/Alg混合凝膠表面均高度多孔，且多為貫穿孔。與海藻酸鈣凝膠相比，膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠結(jié)構(gòu)更為疏松，凝膠孔徑更大，因此，更利于營養(yǎng)物質(zhì)在凝膠網(wǎng)絡(luò)的傳遞，利于保持細胞活性。

2.5 細胞在膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的粘附及伸展研究

以人源成纖維HSF細胞為模型細胞，考察了HSF細胞在膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面及內(nèi)部的形態(tài)學(xué)。圖5為HSF在Col/Alg凝膠和Alg凝膠表面粘附及在Col/Alg凝膠和Alg凝膠內(nèi)部伸展情況。

圖4 Col/Alg混合凝膠和Alg凝膠表面SEM形貌圖

Fig 4 Scanning electron micrograph of Col/Alg and Alg hydrogels

圖5 HSF在Col/Alg凝膠和Alg凝膠表面粘附及在Col/Alg凝膠和Alg凝膠內(nèi)部伸展情況

Fig 5 Cell adhesion on the surface of Col/Alg and Alg hydrogels and cell spread in the Col/Alg and Alg hydrogels

從圖5可以看出，HSF細胞可以粘附在膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面，而不能粘附在海藻酸鈣水凝膠表面；HSF細胞在膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠內(nèi)部伸展，而在單獨海藻酸鈣水凝膠內(nèi)部呈球形不伸展。上述結(jié)果均提示，在膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的表面和內(nèi)部均有膠原分子分布，細胞在膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的表面和內(nèi)部均能保持良好的伸展形態(tài)；同時，圖6(a)和(b)的細胞活性結(jié)果也表明本文建立的膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠可以使細胞保持良好活性。

圖6 HSF細胞在Col/Alg混合凝膠表面和凝膠內(nèi)部的細胞活性及其在Col/Alg混合凝膠表面的遷移行為

Fig 6 Cell viability and cell migration behavior on the surface of Col/Alg hydrogel and in the Col/Alg hydrogel

2.6 細胞在膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的遷移行為研究

采用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察HSF細胞在膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的遷移行為。圖6(c)結(jié)果表明，HSF細胞可以從膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面遷移至凝膠內(nèi)部，再次表明膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面存在貫穿孔，并且其孔徑大于HSF細胞大小。因此，本文制備的膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠作為可用于細胞遷移行為研究。

3 結(jié) 論

采用在海藻酸鈉溶液中共混膠原溶液的方法，通過調(diào)節(jié)pH值與溫度先引發(fā)膠原凝膠化，再向混合體系中引入鈣離子引發(fā)海藻酸鈉凝膠化，成功制備出膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠。通過紅外光譜與圓二色光譜分析證實：該方法制備的凝膠體系中，膠原與海藻酸鈣之間并沒有發(fā)生相互作用，且很好保留了膠原的二級結(jié)構(gòu)以保證其生物學(xué)功能的正常發(fā)揮。與傳統(tǒng)的海藻酸鈣水凝膠相比，膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠表面的疏水性增強，凝膠結(jié)構(gòu)更為疏松，更利于細胞在凝膠表面的粘附與物質(zhì)傳遞。以人源成纖維細胞為模型，通過考察細胞在凝膠表面與凝膠內(nèi)部的形態(tài)學(xué)，進一步證實膠原分子在膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的表面與內(nèi)部均有分布，發(fā)揮細胞外基質(zhì)功能。細胞遷移實驗結(jié)果也表明該膠原/海藻酸鈣互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠不僅能有效保持細胞活性，且為細胞遷移行為的研究提供了一種新的研究模型。

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Construction of collagen/alginate interpenetrating network hydrogel and influence of the hydrogel on cell behavior

SONG Yizhe1,3, REN Ying1,3, LOU Ruyun1,3, WANG Xiuli2, YU Weiting1, MA Xiaojun1

(1. Laboratory of Biomedical Material Engineering, Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences, 457 Zhongshan Road, Dalian 116023, China;2. Department of Histology and Embryology, College of Basic Medical Science,Dalian Medical University, Dalian 116044, China 3. University of the Chinese Academy of Sciences, 19 Yuquan Road, Beijing 100049, China)

Methodologies to prepare alginate/collagen interpenetrating polymeric network (IPN) hydrogel were established by mixing sodium alginate and collagen together. Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and the circular dichroism (CD) measurement indicate that the structure integrity of collagen is still maintained after the alginate treatment, while the analysis of water contact angle and SEM suggest that the hydrophobicity of the gels was improved and the structure of Col/Alg hydrogel was looser compared to pure calcium alginate gel, which was good for cell adhesion. HSF cells became well attached on the Col/Alg hydrogel and were elongated and spread out well in the Col/Alg hydrogel, which indicated that the collagen molecules existed in the surface and inner of the IPN hydrogel. Cell viability could be highly maintained in the Col/Alg hydrogel compartment, which will be a new mode to study the behavior of cell migration.

sodium alginate; collagen; interpenetrating polymeric network; physicochemical properties; cell behavior

1001-9731(2016)11-11136-05

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)資助項目(2012CB720801)；國家自然科學(xué)基金資助項目(81173125)；中科院先導(dǎo)資助項目(XDA01030603)

2016-01-03

2016-04-20 通訊作者：王秀麗，E-mail: panpan1210@dicp.ac.cn，于煒婷

宋益哲 (1986-)，男，山東臨清人，在讀博士，師承馬小軍研究員，從事海藻酸/膠原-殼聚糖復(fù)合凝膠膜用于構(gòu)建間接接觸共培養(yǎng)體系研究。

O63-0；Q28

A

10.3969/j.issn.1001-9731.2016.11.027