王吉平，張 堤，張春林，趙文靜，張 晶，翟素珍

(貴州醫(yī)科大學(xué)生物學(xué)教研室，貴州貴陽(yáng) 550025)

?

致倦庫(kù)蚊天蠶素CecB2基因的原核表達(dá)及蛋白純化

王吉平，張 堤，張春林*，趙文靜，張 晶，翟素珍

(貴州醫(yī)科大學(xué)生物學(xué)教研室，貴州貴陽(yáng) 550025)

構(gòu)建致倦庫(kù)蚊(貴陽(yáng)株)天蠶素B2(CecB2)基因原核表達(dá)載體，并原核表達(dá)獲得重組蛋白。定向克隆CecB2成熟肽序列至原核表達(dá)載體pET32a(+)上，將成功構(gòu)建的pET32a-CecB2重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Rosetta中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化后表達(dá)所得目的蛋白采用鎳離子親和層析純化，SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)鑒定表達(dá)蛋白。結(jié)果表明，成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a-CecB2，IPTG濃度和時(shí)間優(yōu)化結(jié)果為IPTG濃度為0.05 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為3 h。SDS-PAGE檢測(cè)獲得大小約25 ku的可溶性純化蛋白，Western blot鑒定純化蛋白可與鼠抗His-tag單克隆抗體發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)。說(shuō)明所構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a-CecB2能在大腸埃希菌中可溶表達(dá)，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

致倦庫(kù)蚊；天蠶素基因；原核表達(dá)；蛋白純化

天蠶素抗菌肽是一種陽(yáng)離子抗菌肽，由Boman等瑞典科學(xué)家最早于20世紀(jì)70年代至80年代從惜古比天蠶(Hyalophoracecropia)蛹中發(fā)現(xiàn)[1]，是一種廣譜殺菌、具有潛在開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值的抗菌肽，不僅在抗細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)和原蟲(chóng)、病毒及腫瘤方面表現(xiàn)出不同程度的抗性，在天然免疫中還具有調(diào)節(jié)免疫，促進(jìn)中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞的化學(xué)趨化和促進(jìn)傷口愈合等作用[2]。天蠶素抗菌肽由31～39個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量大小為3.5 ku～4 ku，分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為N端雙親性α-螺旋，C端疏水性α-螺旋，屬于α-螺旋類抗菌肽，該肽發(fā)揮抗菌作用與這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[3]。有別于傳統(tǒng)抗生素，天蠶素通過(guò)在細(xì)菌質(zhì)膜上形成小孔，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外流致使細(xì)菌死亡，從而不易產(chǎn)生耐藥性[4]；另外，天蠶素雖具有較強(qiáng)的抗菌活性和較廣的抑菌譜，但對(duì)真核細(xì)胞低毒性[5]。

已報(bào)道的天蠶素(Cecropins)主要有A、B、C、D、E、F等類型及類似物Factor G和Cecropin Ps。其中，Cec B是多種類型中抗菌活性最強(qiáng)的，已應(yīng)用于多個(gè)研究領(lǐng)域。鄒修平等[6]將人工合成的兩個(gè)含有信號(hào)肽的Cec B基因轉(zhuǎn)化塔羅科血橙(CitrussinensisOsbeck)上胚軸，獲得轉(zhuǎn)基因植株，提高了血橙抗?jié)儾∷剑?Wu C等[7]臨床研究發(fā)現(xiàn)天蠶素Cec B 能夠選擇性的識(shí)別細(xì)胞毒素和抗惡性細(xì)胞增生，可抑制人肝癌細(xì)胞HepG-2增殖。目前，在草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)、家蠶(Bombyxmori)、家蠅(Muscadomestica)、斜紋夜蛾(Spodopteralitura)、小菜蛾(Plutellaxyllostella)、煙草天蛾(Maducasexta)等昆蟲(chóng)中已發(fā)現(xiàn)多種天蠶素家族抗菌肽及其類似物[8]，在多種物種中已開(kāi)始功能研究。而對(duì)于致倦庫(kù)蚊天蠶素的研究?jī)H見(jiàn)零星報(bào)道[9-10]。本文利用分子生物學(xué)手段，對(duì)致倦庫(kù)蚊CecB2基因進(jìn)行體外表達(dá)研究，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及耗材 DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、T4 DNA連接酶為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；2×TaqPCR Star Mix、蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京康潤(rùn)生物科技有限公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthjo-β-D-galactoside，IPTG)、氨芐青霉素、氯霉素為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；一抗抗體Anti-His Antibody小鼠抗單克隆抗體購(gòu)于天根生物科技有限公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)山羊抗兔IgG(二抗)為武漢博士德公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純；引物合成及質(zhì)粒測(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.1.2 試驗(yàn)材料 致倦庫(kù)蚊(貴陽(yáng)株)由貴州醫(yī)科大學(xué)生物學(xué)教研室長(zhǎng)期飼養(yǎng)繁殖；pET32a(+)原核表達(dá)載體及大腸埃希菌(E.coli)Rosetta、宿主菌DH5α由貴州醫(yī)科大學(xué)生物學(xué)教研室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上公布的致倦庫(kù)蚊天蠶素基因CecB2序列( Accession :XM-001861707.1)，用軟件SignalP4.1預(yù)測(cè)其信號(hào)肽位置并應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增CecB2成熟肽的上下游引物分別引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)(下劃線部分)，并命名為CxCec-F和CxCec-R。CxCec-F：5′-CGGGATCCGGTGGTCTCAAAAAGT-3′，下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn),CxCec-R：5′-CCCAAGCTTTTTTG GTCCAA GTGCAT-3′，下劃線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn)。

1.2.2 PCR擴(kuò)增CecB2成熟肽基因 以課題組前期所得pMD-CecB2陽(yáng)性克隆菌液為模板PCR擴(kuò)增CecB2成熟肽序列。擴(kuò)增體系為20 μL，包括2×TaqPCR Star Mix 10 μL，模板菌液1 μL，上、下游引物各1 μL，滅菌水補(bǔ)足20 μL。擴(kuò)增條件：94℃ 2 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.3 陽(yáng)性克隆篩選及鑒定 pET32a(+)經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后進(jìn)行質(zhì)粒DNA切膠回收，同樣雙酶切1.2.2中所得DNA回收產(chǎn)物。用T4 DNA連接酶將回收質(zhì)粒DNA與酶切CecB2基因片段按1∶3濃度比16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，交叉PCR驗(yàn)證初步篩選陽(yáng)性克隆并抽提重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定后將陽(yáng)性克隆菌液送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)正確后命名為pET32a-CecB2。

1.2.4 誘導(dǎo)表達(dá)條件時(shí)間和濃度的優(yōu)化 將鑒定的菌液按1∶50轉(zhuǎn)接含有氨芐青霉素(Amp)和氯霉素(Cam)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日以同上比例將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接至新的含同上抗性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃，200 r/min 培養(yǎng)至OD600nm為 0.5左右。取8個(gè)培養(yǎng)管加入終濃度分別為0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG，37 ℃ 200 r/min誘導(dǎo)表達(dá)3 h，經(jīng)15 g/L的SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色分析，確定最佳誘導(dǎo)濃度。再以確定的最佳誘導(dǎo)濃度分別誘導(dǎo)重組菌液0、1、2、3、4、5、6、7 h后取樣，經(jīng)15 g/L SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色分析，確定其最佳誘導(dǎo)濃度。

1.2.5 重組蛋白大量表達(dá)及可溶性檢測(cè) 以優(yōu)化的濃度和時(shí)間于37℃下對(duì)重組菌進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)結(jié)束后，離心收集菌體，菌體沉淀重懸于按His-鎳蛋白純化套裝中配方配制的結(jié)合液(20 mmol/L Tris-HCl pH7.9，10 mmol/L 咪唑，0.5 mmol/L NaCl)中，反復(fù)凍融3次，在冰浴中超聲碎菌(100 W，超聲5 s，停6 s，重復(fù)80次)。4℃、12 000 r/min離心30 min，分離上清和沉淀。150 g/L SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白可溶性，再按照His-鎳蛋白純化套裝說(shuō)明進(jìn)行上清純化或沉淀變性后純化。

1.2.6 純化蛋白Western blot鑒定 將純化后的CecB2蛋白進(jìn)行2.5 mA/cm2電流半干轉(zhuǎn)40 min轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，1×PBST配制的50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，抗6×His-tag(一抗1∶1 000)室溫孵育2 h，1×PBST洗膜3次，每次5 min，山羊抗鼠IgG(二抗：1∶10 000)室溫孵育2 h，1×PBST洗膜3次，每次5 min，DAB顯色試劑盒顯色觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 CecB2成熟肽基因PCR結(jié)果

以pMD-CecB2陽(yáng)性克隆菌液為模板，PCR擴(kuò)增CecB2成熟肽基因后核酸電泳顯示，在約120 bp位置有一條特異條帶，大小與預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度相符(圖1)。測(cè)序結(jié)果證實(shí)與GenBank上的致倦庫(kù)蚊天蠶素基因去信號(hào)肽后的成熟肽基因序列一致。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; B2.CecB2 基因成熟肽PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000；B2.Mature peptide PCR products of CecB2 gene

圖1 CecB2基因成熟肽基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1 The mature peptide PCR results of CecB2 gene

2.2 pET32a-CecB2克隆菌的交叉PCR鑒定結(jié)果

用通用引物T7F/R與特異性引物CxCec-F及CxCec-R進(jìn)行陽(yáng)性克隆的交叉PCR驗(yàn)證?？梢?jiàn)CxCec-F和T7R引物對(duì)所擴(kuò)增出的產(chǎn)物片段約為250 bp，而T7F和CxCec-R引物對(duì)所擴(kuò)增出的產(chǎn)物片段約為750 bp，這與預(yù)期大小一致(圖2)。由此可知，所挑選克隆菌初步認(rèn)定為陽(yáng)性克隆，目標(biāo)序列CecB2是以正確的方向插入pET32a載體中。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.CxCec-R和T7F擴(kuò)增產(chǎn)物；2.T7R和CxCec-F擴(kuò)增產(chǎn)物

M.DNA Marker DL 2 000; 1.PCR products of CxCec-R and T7F; 2.PCR products of T7R and CxCec-F

圖2 陽(yáng)性克隆菌PCR鑒定

Fig.2 Identification of the positive clones by PCR

2.3 pET32a-CecB2質(zhì)粒雙酶切及測(cè)序鑒定結(jié)果

用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切pET32a-CecB2重組質(zhì)粒，核酸電泳檢測(cè)結(jié)果顯示酶切后的pET32a-CecB2在約120 bp的位置出現(xiàn)了一條與PCR成熟肽擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致的條帶，而在約6 000 bp得位置有一條大小與空質(zhì)粒pET32a(+)雙酶切后大小一致的條帶(圖3)，綜合結(jié)果2.2說(shuō)明目的基因與載體連接成功。將測(cè)序結(jié)果與目的基因序列比對(duì)，結(jié)果完全一致，說(shuō)明成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET32a-CecB2。

2.4 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

SDS-PAGE電泳顯示(圖4和圖5)，終濃度為0.05 mmol/L時(shí)目的蛋白的表達(dá)量較高，且濃度的增加并沒(méi)有引起目的蛋白表達(dá)量的明顯增加。以0.05 mmol/L IPTG濃度進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，1 h～4 h表達(dá)量較高，目的蛋白可能對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生了毒性作用或細(xì)胞內(nèi)蛋白酶較敏感，致使5 h～7 h時(shí)蛋白出現(xiàn)了類似降解的現(xiàn)象。

2.5 重組蛋白大量表達(dá)及可溶性檢測(cè)結(jié)果

IPTG濃度為0.05 mmol/L，表達(dá)時(shí)間為3 h，37℃大量誘導(dǎo)表達(dá)，離心所得菌體重懸后超聲破碎并離心分離得到上清和沉淀，樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果顯示(圖6)，重組蛋白主要以可溶形式表達(dá)。His-鎳蛋白純化柱純化獲得大小約25 ku的融合蛋白，與預(yù)期結(jié)果相符。

M1.DNA標(biāo)準(zhǔn)λ-HindⅢ；M2.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 ；1.質(zhì)粒pET32a(+)；2.經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后的空質(zhì)粒pET32a(+)；3.重組質(zhì)粒pET32a-CecB2；4.經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后的重組質(zhì)粒pET32a-CecB2；5.PCR產(chǎn)物

M1.DNA Marker λ-HindⅢ; M2.DNA Marker DL 2 000; 1.Products of pET32a(+) plasmid; 2.Products of pET32a(+) digested byBamHⅠ andHindⅢ; 3.The recombinant plasmid pET32a-CecB2; 4.Products of pET32a-CecB2 digested byBamHⅠ andHindⅢ; 5.PCR products

圖3 pET32a-CecB2重組質(zhì)粒的酶切鑒定

Fig.3 Identification of recombinant plasmid pET32a-CecB2 by enzyme digestion

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET32a-CecB2誘導(dǎo)前；2～9.0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L IPTG濃度誘導(dǎo)重組菌

M.Protein molecular weight Marker；1.CecB2 expression before IPTG inducted； 2-9.Products of CecB2 inducted with 0,0.05,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mmol/L IPTG,respectively

圖4 不同IPTG濃度對(duì)重組蛋白表達(dá)量的影響

Fig.4 The effect of different IPTG concentrations on expression levels of recombinant proteins

2.6 Western blot鑒定純化蛋白

以鼠抗His-tag單克隆抗體為一抗，辣根過(guò)氧化物酶山羊抗鼠IgG為二抗,Western blot免疫印記經(jīng)DAB顯色(圖7)顯示，免疫印跡反應(yīng)呈陽(yáng)性反應(yīng)，在約25 ku處出現(xiàn)一條特異性條帶，與預(yù)測(cè)的重組蛋白大小相符。

3 討論

致倦庫(kù)蚊(Culexquinquefasciatus)屬于昆蟲(chóng)綱(Insecta)、雙翅目(Diptera)、長(zhǎng)角亞目(Nematocera)中的蚊科(Culicidae)，是一類重要的醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)。致倦庫(kù)蚊呈世界性分布，其滋生環(huán)境復(fù)雜，攜帶多種病原體，能夠抵御多種病原體侵襲，推測(cè)其具有強(qiáng)大的天然免疫防御系統(tǒng)。因此，對(duì)致倦庫(kù)蚊先天免疫分子的深入研究有助于了解其在致倦庫(kù)蚊體內(nèi)的免疫防御機(jī)制。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET32a-CecB2誘導(dǎo)前；2～9.0、1、2、3、4、5、6、7 h誘導(dǎo)的重組菌

M.Protein molecular weight Marker； 1.CecB2 expression before IPTG inducted；2-9.Products of CecB2 induction for 0,1,2,3,4,5,6,7 h respectively

圖5 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白表達(dá)量的影響

Fig.5 The effect of different induction time on expression levels of recombinant proteins

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET32a(+)誘導(dǎo)前；2.pET32a(+)誘導(dǎo)后；3.pET32a-CecB2誘導(dǎo)前；4.pET32a-CecB2誘導(dǎo)后；5.上清；6.沉淀；7.純化蛋白

M.Protein molecular weight Marker；1.pET32a(+) vector expression before IPTG induction；2.pET32a(+) vector expression after IPTG induction；3.CecB2 expression before IPTG induction；4.CecB2 expression after IPTG induction；5.Supernatant；6.Precipitate；7.Purified proteins

圖6 重組蛋白純化

Fig.6 Purification of the recombinant protein

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pET32a(+)誘導(dǎo)前；2.pET32a(+)誘導(dǎo)后；3.pET32a-CecB2誘導(dǎo)前；4.純化蛋白

M.Protein molecular weight Marker；1.pET32a(+) vector expression before IPTG induction；2.pET32a(+) vector expression after IPTG induction；3.CecB2 expression before IPTG induction；4.Purified proteins

圖7 Western blot鑒定純化蛋白

Fig.7 Identification of purified protein by Western blot

天蠶素抗菌肽作為昆蟲(chóng)免疫系統(tǒng)重要成分，是一種小分子多肽，體外表達(dá)時(shí)對(duì)宿主易產(chǎn)生毒性，若直接在表達(dá)宿主中進(jìn)行表達(dá)，不僅產(chǎn)量不高，也容易受到宿主細(xì)胞蛋白酶的降解[11]。本試驗(yàn)采用融合表達(dá)的方式將CecB2基因成熟肽定向克隆到pET表達(dá)載體中實(shí)現(xiàn)原核表達(dá)。與真核表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸埃希菌具有繁殖力強(qiáng)、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)量高且成本低等優(yōu)點(diǎn)，所以常常作為基因工程表達(dá)的首選宿主[12]。pET原核表達(dá)載體是一種應(yīng)用廣泛的載體，可提供多個(gè)純化標(biāo)簽如His標(biāo)簽，Trx標(biāo)簽和S標(biāo)簽，便于外源蛋白的分離純化。本試驗(yàn)選用pET32a表達(dá)載體帶有的6×組氨酸(His-Tag)序列作為融合表達(dá)標(biāo)簽，簡(jiǎn)化了蛋白純化和免疫印跡鑒定[13]。

外源蛋白的表達(dá)受多種因素的影響，為得到高效表達(dá)的融合蛋白，研究者們通常會(huì)對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。海力且木·艾力等[14]對(duì)光滑鱉甲抗菌肽原核表達(dá)條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)低濃度短時(shí)間及低溫低轉(zhuǎn)速可增加可溶性蛋白表達(dá)量；Salimi A等[15]通過(guò)對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)165在大腸埃希菌中表達(dá)時(shí)的誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)濃度等表達(dá)條件的優(yōu)化，得到VEGF165可溶性最高表達(dá)的最佳條件。本試驗(yàn)對(duì)IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在低濃度0.05 mmol/L時(shí)重組蛋白就可高表達(dá)，且在此濃度條件下誘導(dǎo)1 h～4 h內(nèi)重組蛋白表達(dá)量相近，而誘導(dǎo)5 h后目的蛋白出現(xiàn)了類似降解的現(xiàn)象，7 h時(shí)又表現(xiàn)出回緩的趨勢(shì)，推測(cè)該融合蛋白可能會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用或與細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的敏感性特性有關(guān)。然而本試驗(yàn)這些結(jié)果只是對(duì)優(yōu)化濃度條件下的時(shí)間優(yōu)化結(jié)果，在更低濃度或低溫條件下是否會(huì)有所改善將在下一步試驗(yàn)中繼續(xù)驗(yàn)證。

本試驗(yàn)通過(guò)分子生物學(xué)手段成功構(gòu)建了致倦庫(kù)蚊CecB2基因成熟肽原核表達(dá)載體，可在原核表達(dá)系統(tǒng)中以可溶性形式表達(dá)，為下一步研究致倦庫(kù)蚊天蠶素生物活性奠定理論基礎(chǔ)。遇到的蛋白降解問(wèn)題也暗示我們可在此基礎(chǔ)上更進(jìn)一步從溫度、轉(zhuǎn)速等方面優(yōu)化表達(dá)條件以期獲得更佳的高效表達(dá)條件。

[1] Hultmark D，Steiner H，Boman H G，et al.Insect immunity:Purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae ofHyalophoracecropia[J].Eur J Biochem，1980，106(1):7-16.

[2] Nhung D，Günther W，Lisa G,et al.Cationic membrane-active peptides-anticancer and antifungal activity as well as penetration into human skin[J].Exp Dermatol，2014，23(5):326-331.

[3] Godreuil S，Leban N，Padilla A，et al.Aedesin:structure and antimicrobial activity against multidrug resistant bacterial strains[J].PLoS One，2014，9(8)：e105441.

[4] Eunjung L，Areum S，Yangmee K.Anti-inflammatory activities of cecropin A and its mechanism of action[J].Arch Insect Biochem Physiol，2015，88 (1):31-44.

[5] Akhilesh R，Sandra P，Marta B E.High-density antimicrobial peptide coating with broad activity and low cytotoxicity against human cells[J].Acta Biomat，2016，33:64-77.

[6] 鄒修平，彭愛(ài)紅，劉琦琦，等.分泌型 Cecropin B 抗菌肽基因轉(zhuǎn)化血橙提高其抗?jié)儾∷絒J].園藝學(xué)報(bào)，2014，41(3):417-428.

[7] Wu C，Geng X，Wan S，et al.Cecropin-P17，an analog of Cecropin B，inhibits human hepatocellular carcinoma cell HepG-2 proliferation via regulation of ROS，Caspase，Bax，and Bcl-2[J].J Pept Sci，2015，21(8):661-668.

[8] Anchalee T,Kunlaya S,Piti A.Sequence diversity and evolution of antimicrobial peptides in invertebrates[J].Develop Comp Immunol,2015,48 :324-341.

[9] 康 哲，張春林，陳漢彬.致倦庫(kù)蚊Cecropin基因克隆及序列分析[J].貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，6(33):643-646.

[10] 趙文靜，張春林，王吉平，等.致倦庫(kù)蚊Cecropin基因家族的比較和系統(tǒng)發(fā)育分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2016，35(2)：294-301.

[11] Skosyrev V S， Kulesskiy E A， Yakhnin A V， et al.Expression of the recombinant antibacterial peptide sarcotoxin IA inEscherichacolicells[J].Protein Expr,2003，28(2):350-356．

[12] Rosano G L，Ceccarelli E.Recombinant protein expression inE.coli:Advances and challenges[J].Frontiers Microbiol，2014，5:1-17

[13] 磨健悅，孫寶麗，魏鐘艷，等.豬流行性腹瀉病毒COE基因的原核表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的生物活性分析[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2015，45(5):503-508.

[14] 海力且木·艾力，徐 鑫，劉忠淵.光滑鱉甲抗菌肽的原核表達(dá)條件優(yōu)化及其抗菌活性[J].昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2016，59(1)：8-15.

[15] Salimi A，Babashamsi M.Cloning and optimization of soluble vascular endothelial growth factor 165 expression inE.coli[J].Avicenna J Med Biotechnol，2016，8(1):23-28.

Prokaryotic Expression and Protein Purification of Cecropin CecB2 Gene ofCulexquinquefasciatus

WANG Ji-ping，ZHANG Di，ZHANG Chun-lin，ZHAO Wen-jing，ZHANG Jing，ZHAI Su-zhen

(DepartmentofBiology,GuiyangMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou,550025,China)

To construct the prokaryotic expression vector of cecropin CecB2 gene ofCulexquinquefasciatusfor prokaryotic expression recombinant protein.The mature peptide of CecB2 was inserted into the multiple cloning sites of the expression vector pET32a to construct recombinant plasmid firstly,then transformed it intoE.coliRosetta for expression by IPTG induction.The expression conditions were optimized by investigating the effects of concentration of IPTG and induction time.SDS-PAGE and Western blot were used to detect and indentify the recombinant protein respectively.The results showed that prokaryotic expression vector pET32a-CecB2 was constructed successfully and optimum induction condition of fusion protein were as follows:IPTG concentration 0.05 mmol/L,induction time 3 h.The recombinant protein was about 25 ku and identified to react with monoclonal antibody 6×His tag by Western blot.This suggested that the recombinant plasmid was constructed successfully and can be expressed as a soluble fusion protein inE.coliRosetta.It laid the necessary theoretical basic for further study of biological funtions of cecropin ofCulexquinquefasciatusin future.

Culexquinquefasciatus; cecropin gene; prokaryotic expression; protein purification

2016-04-07

貴州省科技廳項(xiàng)目(黔科合LH字[2015]7363號(hào))

王吉平(1989-)，女，貴州遵義人，碩士研究生，主要從事醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)分子生物學(xué)研究。*通訊作者

S859.799.9；S881.3

A

1007-5038(2016)11-0031-05