李得鑫，韓 超，楊金凱，康建南，李 林，包永占*，史萬玉*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,河北保定 071000;2.湖南圣雅凱生物科技有限公司,湖南湘潭 411228)

?

遠(yuǎn)志茯神口服液對昆明小鼠的抗應(yīng)激作用

李得鑫1，韓 超1，楊金凱1，康建南2，李 林2，包永占1*，史萬玉1*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,河北保定 071000;2.湖南圣雅凱生物科技有限公司,湖南湘潭 411228)

為探討遠(yuǎn)志茯神口服液的抗應(yīng)激作用，以昆明小鼠為實驗動物，研究了不同劑量的遠(yuǎn)志茯神口服液對慢性應(yīng)激小鼠生長指標(biāo)、血清酶活性和免疫球蛋白的影響，以及其對急性應(yīng)激小鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HPA)的影響。結(jié)果顯示，一定劑量的遠(yuǎn)志茯神口服液能顯著降低應(yīng)激小鼠的懸尾不動時間(P<0.05)；顯著抑制應(yīng)激小鼠料重比(P<0.05)和血清酶指標(biāo)的異常升高(P<0.05)，以及應(yīng)激小鼠血清免疫球蛋白水平的降低(P<0.05)；還能顯著抑制應(yīng)激小鼠ACTH和COR的釋放(P<0.05)。表明遠(yuǎn)志茯神口服液對懸尾昆明小鼠有顯著的抗應(yīng)激作用。

遠(yuǎn)志茯神口服液；小鼠；抗應(yīng)激

在現(xiàn)代規(guī)?；酿B(yǎng)雞行業(yè)中，接種疫苗和轉(zhuǎn)群時帶來的應(yīng)激影響是不可避免的，在疫苗接種和轉(zhuǎn)群后，機體內(nèi)發(fā)生一系列的不良反應(yīng)，免疫水平降低，進而病原微生物趁虛而入，對機體造成損傷，對養(yǎng)殖業(yè)帶來危害和損失。本試驗以懸尾刺激造模，以不同劑量的遠(yuǎn)志茯神口服液給小鼠灌胃。比較分析了各劑量遠(yuǎn)志茯神口服液對小鼠抗應(yīng)激作用，為中藥抗應(yīng)激口服液在臨床上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 17 g±2 g和20 g±2 g昆明小鼠各50只，斯貝福(北京)實驗科技有限公司提供。

1.1.2 中藥口服液 由遠(yuǎn)志300 g和茯苓200 g組方，按照一定的提取工藝加工而成，每毫升含量相當(dāng)原生藥1 g，湖南圣雅凱生物科技有限公司中試產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 肌酸激酶(CK)測定試劑盒(批號：150891)、堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒(批號：150891)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測定試劑盒(批號：151201)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測定試劑盒(批號：152381)，均為中生北控生物科技有限公司生產(chǎn)；IgG、IgA、IgM免疫球蛋白檢測試劑盒為南京建成生物研究所(批號：20150703)生產(chǎn)；COR ELISA試劑盒、ACTH ELISA試劑盒為萊博泰瑞(北京)科技發(fā)展有限公司(生產(chǎn)批號：20150724)生產(chǎn)。

1.1.4 儀器設(shè)備 ELx800TM吸收光酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司產(chǎn)品；UV-2100PC型紫外可見分光光度計，翱藝儀器(上海)有限公司產(chǎn)品；Microlab 300型半自動生化分析儀，荷蘭威圖科學(xué)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 遠(yuǎn)志茯神口服液對慢性應(yīng)激小鼠的影響 將50只斷奶小鼠，雌雄各半，初始體重17 g±2 g，分為5組，每組10只，Ⅰ組～Ⅲ組分別為遠(yuǎn)志茯神口服液高、中、低劑量組，Ⅳ組為應(yīng)激陽性對照組，Ⅴ組為空白對照組。Ⅰ組～Ⅲ組小鼠每天分別灌胃0.4 mL中藥口服液、0.2 mL中藥口服液+0.2mL生理鹽水和0.1 mL中藥口服液+0.3 mL生理鹽水，Ⅳ組和Ⅴ組小鼠每天分別灌服0.4 mL生理鹽水。與此同時Ⅰ組～Ⅳ組小鼠每天用雙面膠固定倒懸于鼠籠上方的橫梁上，懸掛6 min進行應(yīng)激刺激，再將小鼠放回鼠籠。Ⅴ組小鼠進行正常飼養(yǎng)。各組連續(xù)重復(fù)灌服并懸尾15 d。每天記錄各組小鼠的采食量，稱量小鼠體重，計算15 d后日增重、采食量和料重比；另待試驗結(jié)束后，立即摘眼球取血，分離血清，用于肌酸激酶(CK)、堿性磷酸酶(ALP)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)的活性測定和血清中IgG、IgA、IgM含量。

1.2.2 遠(yuǎn)志茯神口服液對急性應(yīng)激小鼠血清ACTH和COR含量的影響 選取50只昆明小鼠，初始體重20 g±2 g，試驗分組和灌胃處理同1.2.1，但不進行每天懸尾處理。10 d后，試驗前禁食12 h，最后一次灌胃40 min后開始試驗。將小鼠尾部距末端2 cm處用雙面膠固定倒懸于鼠籠上方的橫梁上，懸掛6 min，記錄后4 min累計不動的時間，即懸尾不動時間。立即摘眼球取血，分離血清，用于測定各組小鼠血液中促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和皮質(zhì)醇(COR)的含量變化。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS19.0進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以O(shè)ne-way ANOVA進行差異顯著比較，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義，試驗數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 遠(yuǎn)志茯神口服液對慢性應(yīng)激小鼠的生長指標(biāo)的影響

結(jié)果見表1。由表1可知，遠(yuǎn)志茯神口服液3組平均日增重與空白對照組無顯著差異(P>0.05)，且各用藥組平均日增重均高于陽性對照組，中劑量組與空白對照組無顯著差異(P>0.05)；陽性對照組料重比顯著高于空白對照組(P<0.05)，遠(yuǎn)志茯神口服液3組均能降低應(yīng)激小鼠的料重比，且高劑量組和中劑量組的降低料重比的效果優(yōu)于低劑量組。

2.2 遠(yuǎn)志茯神口服液對慢性應(yīng)激小鼠血清酶活性的影響

結(jié)果見表2。由表2可知，從ALT水平來看，遠(yuǎn)志茯神口服液中劑量組與陽性對照組相比差異顯著(P<0.05)；從AST水平來看，遠(yuǎn)志茯神口服液高劑量組與陽性對照組相比，差異顯著(P<0.05)；從CK水平來看，遠(yuǎn)志茯神口服液中劑量組與陽性對照組相比，差異顯著(P<0.05)。從ALP水平來看，遠(yuǎn)志茯神口服液中劑量組、低劑量組與陽性對照組相比，差異顯著(P<0.05)。

表1 遠(yuǎn)志茯神口服液對慢性應(yīng)激小鼠生長指標(biāo)的影響

注：同行數(shù)據(jù)無肩標(biāo)或含有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，含不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:In the same row,values with no letter or the same letters mean no significant differernce (P>0.05),while with different letters mean significant difference(P<0.05).

表2 遠(yuǎn)志茯神口服液對慢性應(yīng)激小鼠血清酶活性的影響

注：同行數(shù)據(jù)無肩標(biāo)或含有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，含不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:In the same row,values with same letters mean no significant differernce (P>0.05),while with different letters mean significant difference(P<0.05).

2.3 遠(yuǎn)志茯神口服液對慢性應(yīng)激小鼠的免疫系統(tǒng)影響

結(jié)果見表3。由表3可知，空白對照組3項免疫球蛋白指標(biāo)均顯著高于陽性對照組(P<0.05)。遠(yuǎn)志茯神口服液高劑量組IgG、IgA、IgM水平與陽性對照組相比，差異顯著(P<0.05)，且與空白對照組相比，差異不顯著(P>0.05)。

2.4 遠(yuǎn)志茯神口服液對急性應(yīng)激小鼠懸尾不動時間的影響

結(jié)果見表4。由表4可以看出，遠(yuǎn)志茯神口服液高、中、低3個組懸尾時間均顯著低于應(yīng)激陽性對照組(P<0.05)。

2.5 遠(yuǎn)志茯神口服液對急性應(yīng)激小鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HPA)的影響

結(jié)果見表5。由表5可知，空白對照組ACTH、COR水平均顯著低于陽性對照組(P<0.05)。遠(yuǎn)志茯神口服液低劑量組的ACTH水平與空白對照組相比，無顯著差異(P<0.05)；遠(yuǎn)志茯神口服液

高、低劑量組COR水平與陽性對照組相比差異顯著(P<0.05)，且與空白對照組相比無顯著差異(P>0.05)。

表3 遠(yuǎn)志茯神口服液對慢性應(yīng)激小鼠免疫球蛋白指標(biāo)的影響

注：同行數(shù)據(jù)無肩標(biāo)或含有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，含不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:In the same row,values with same letters mean no significant differernce (P>0.05),while with different letters mean significant difference(P<0.05).

表4 遠(yuǎn)志茯神口服液對急性應(yīng)激小鼠懸尾不動時間的影響

注：同行數(shù)據(jù)無肩標(biāo)或含有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，含不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:In the same row,values with same letters mean no significant differernce (P>0.05),while with different letters mean significant difference(P<0.05).

表5 遠(yuǎn)志茯神口服液對急性應(yīng)激小鼠促腎上腺激素和皮質(zhì)醇指標(biāo)的影響

注：同行數(shù)據(jù)無肩標(biāo)或含有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，含不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:In the same row,values with same letters mean no significant differernce (P>0.05),while with different letters mean significant difference(P<0.05).

3 討論

小鼠懸尾試驗是用于鑒定和篩選抗抑郁藥物的經(jīng)典動物模型[1]。小鼠在懸尾倒掛這一強烈應(yīng)激下，最初會強烈掙扎并企圖逃離這一環(huán)境，掙扎無果后表現(xiàn)絕望出現(xiàn)不動狀態(tài)，而抗應(yīng)激藥物具有減少不動時間、增強動物抗應(yīng)激的作用。因此小鼠的懸尾試驗也可作為篩選抗應(yīng)激藥物的模型。本試驗中，遠(yuǎn)志茯神口服液高、中、低3個組懸尾時間都顯著低于陽性對照組(P<0.05)。這說明遠(yuǎn)志茯神口服液能顯著降低小鼠不動時間，提高抗應(yīng)激能力。

小鼠受到懸尾刺激后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)識別刺激，隨后機體組織發(fā)起一系列的生物學(xué)反應(yīng)進行防御，進而影響到動物的采食、消化和吸收。體重下降，機體儲備能量耗竭，免疫力遭到破壞，此不僅影響生產(chǎn)性能，也會引起疾病甚至死亡[2]。因此，可以通過測定應(yīng)激小鼠的增重和飼料轉(zhuǎn)化率來評價抗應(yīng)激藥物的藥效。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)懸尾應(yīng)激處理后日增重下降，飼料轉(zhuǎn)化率降低，這與劉曉暉等[3]報道一致。而遠(yuǎn)志茯神口服液可以緩解這種應(yīng)激反應(yīng)，維持正常平均日增重，抑制料重比升高，保證飼料轉(zhuǎn)化率,且中劑量遠(yuǎn)志茯神口服液效果最好。

AST、ALT主要存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞受損后進入血漿。輕度的肝損傷即可使血清中的ALT顯著升高[4]，當(dāng)重度肝損傷時血清中AST也會快速上升[5]。本試驗發(fā)現(xiàn)，持續(xù)的懸尾應(yīng)激可以造成小鼠AST、ALT指標(biāo)的顯著升高，表明懸尾刺激對小鼠的肝細(xì)胞有一定的損傷。而高、中劑量遠(yuǎn)志茯神口服液能顯著抑制應(yīng)激小鼠AST、ALT水平的升高，表明其具有較好保護肝細(xì)胞的功效；CK主要存在于骨骼肌和心肌的細(xì)胞漿和線粒體中，是參與體內(nèi)的能量代謝的一種酶。一般來說，長時間運動負(fù)荷以及一些對機械性影響較大的活動會導(dǎo)致血清肌酸激酶的活性升高[6]。ALP是一種廣泛分布于機體肝臟、骨骼等組織的一組同功酶。當(dāng)肝臟或骨骼系統(tǒng)疾病時會出現(xiàn)ALP偏高。當(dāng)機體受到應(yīng)激的刺激時，毛細(xì)血管收縮，血管內(nèi)血流加快，肝臟代謝增強，使ALP釋放入血液，血清中ALP水平增高[7]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，中劑量遠(yuǎn)志茯神口服液能顯著抑制應(yīng)激小鼠血清中CK和ALP水平的升高，這可能與遠(yuǎn)志茯神口服液提高機體對應(yīng)激的耐受性，進而降低應(yīng)激對機體的刺激，從而使CK和ALP進入血清的量減少有關(guān)。

應(yīng)激會引起交感神經(jīng)系統(tǒng)和HPA軸(下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸)興奮，導(dǎo)致兒茶酚胺的快速短期釋放。隨后，糖皮質(zhì)激素被釋放到循環(huán)中[8]，進而抑制抗體的合成，使機體的免疫力降低[9]。IgG、IgA、IgM是體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要抗體[10]，本試驗發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激狀態(tài)下小鼠血清IgG、IgA、IgM水平顯著較低，而一定劑量的遠(yuǎn)志茯神口服液能顯著抑制應(yīng)激小鼠血清IgG、IgA、IgM水平的降低。在正常條件下，動物體液內(nèi)90%以上的皮質(zhì)酮以高度的親和力與皮質(zhì)類固醇結(jié)球蛋白結(jié)合，但只有血液中游離的皮質(zhì)醇才能發(fā)揮激素的作用[11]。因此，檢測血清中促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)醇的含量變化可以反映機體的抗應(yīng)激情況。本試驗表明，在對小鼠短期急性懸尾應(yīng)激后，小鼠體內(nèi)ACTH、COR水平會顯著增高。一定劑量的遠(yuǎn)志茯神口服液能顯著降低急性懸尾應(yīng)激小鼠顯著升高的ACTH和COR水平。說明遠(yuǎn)志茯神口服液能抑制應(yīng)激狀態(tài)下過分活躍的腎上腺皮質(zhì)軸，抑制過多的ACTH和COR釋放入血，使機體合成IgG、IgA、IgM等抗體的能力得以恢復(fù)。遠(yuǎn)志茯神口服液對懸尾昆明小鼠有顯著的抗應(yīng)激作用。

[1] 孫世光，李子峰，劉 健，等.昆明小鼠焦慮與抑郁動物模型相關(guān)性研究：明暗箱實驗與懸尾試驗[J].中國藥理學(xué)通報,2012,28(2):289-293.

[2] 張永英，石玉祥，王雪敏.中藥復(fù)方對熱應(yīng)激下肉雞免疫功能的影響[J].中國家禽，2008，30(7)：22-24．

[3] 劉曉暉，張 莉，張 嶺，等.紅景天苷對慢性重復(fù)懸尾應(yīng)激動物的保護作用[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011(9)：199-202.

[4] 朱安妮，李 蕊，劉三海，等.四氯化碳誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型的建立和優(yōu)化[J].中國肝臟病雜志:電子版，2014，6(1):27-31.

[5] 傅 穎，王 茵.新生牛肝活性肽對小鼠血清中ALT和AST酶活力的影響[J].中國生物制品學(xué)雜志，2007，20(9)：677-679.

[6] 孫桂芳.天鹿膠囊對力竭游泳小鼠CK、BUN、LA的影響[J].山東體育學(xué)院學(xué)報，2009(11)：43-45.

[7] 胡建斌，盧勝明，車路平，等.10種常見SPF級實驗大、小鼠血液學(xué)及生化指標(biāo)正常參考值的探討[J].實驗動物科學(xué)，2007，24(2)：5-10.

[8] Verbrugghe E,Boyen F,Gaastra W,et al The complex interplay between stress and bacterial infections in animals[J].Vet Microbiol,2012,155:115-127.

[9] Padgett D A,Glaser R.How stress influences the immune response[J].Trends Immuunol,2003, 24(8):444-448.

[10] 杜三軍.熱量限制及姜黃對大鼠血清及脾組織勻漿IgA、IgG、IgM水平及免疫器官指數(shù)的影響[D].河北石家莊：河北醫(yī)科大學(xué),2010.

[11] 唐 嘉，謝 佳，李中文，等.熱應(yīng)激對雞免疫系統(tǒng)的影響及預(yù)防研究進展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(12)：170-173.

Anti-stress Effects ofPolygalaandPoriacocosOral Liquid in Kunming Mice

LI De-xin1,HAN Chao1,YANG Jin-kai1,KANG Jian-nan2,LI Lin2, BAO Yong-zhan1, SHI Wan-yu1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding,Hebei,071000,China; 2.HunanShengyakaiBiologicalTechnicalCo.,Ltd,Xiangtan,Hunan,411228,China)

To investigate the anti-stress effects ofPolygalaandPoriacocosoral liquid,this experiment took Kunming mice as experimental animals,detailedly studied the effects of the different doses ofPolygalaandPoriacocosoral liquid on growth index,serum enzyme activities,the levels of immunoglobulins in mice with chronic stress,and hypothalamus-pituitary-adrenal cortical axis (HPA) in mice with acute stress.The results showed that a certain dose ofPolygalaandPoriacocosoral liquid can significantly reduce the immobility time of suspension tail in mice(P<0.05),inhibit the feed-weight ratio and abnormal elevations of serum enzymes in mice with chronic stress(P<0.05),as well as the decrease of immunoglobulin levels(P<0.05)and the releases of ACTH and COR in mice with acute stress.The result indicated thePolygalaandPoriacocosoral liquid has prominent anti-stress effect in Kunming mice.

PolygalaandPoriacocosoral liquid;mouse;anti-stress

2016-03-18

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項項目(201403051-08)

李得鑫(1991-)，男，山東濰坊人，碩士研究生，主要從事中藥藥理學(xué)研究。*通訊作者

S852.33

A

1007-5038(2016)11-0070-04