魏 勇，陳美琪，王 利*，肖 云, 于吉鋒，李興玉

(1.四川省畜牧科學研究院，四川成都，610066；2.西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都 610041;3.四川省大竹縣畜牧局，四川大竹 635100)

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豬場糞污中大腸埃希菌磺胺類耐藥基因型及表型分析

魏 勇1，陳美琪2，王 利2*，肖 云3, 于吉鋒1，李興玉1

(1.四川省畜牧科學研究院，四川成都，610066；2.西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都 610041;3.四川省大竹縣畜牧局，四川大竹 635100)

為了檢測豬場糞污中大腸埃希菌對磺胺類藥物的耐藥狀況，用美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)推薦的藥敏紙片擴散法檢測11株豬場糞污中大腸埃希菌對磺胺類藥物的耐藥性表型，用multi-PCR Kit檢測磺胺類藥物的耐藥基因(sul1,sul2,sul3)。結果表明,11株豬場糞污中大腸埃希菌對磺胺復合物的耐藥率為45%，磺胺二甲基惡唑耐藥率為45%,磺胺甲基惡唑耐藥率為64%?；前奉愃幬锏腟ul 1基因檢出率為100%，sul 2基因檢出率為90.9%，sul 3基因檢出率為36.4%，磺胺類抗生素耐藥基因的總檢出率為100%。研究結果可為大腸埃希菌的耐藥性研究以及磺胺類耐藥機制的研究提供科學依據(jù)。

豬場糞污；大腸埃希菌；磺胺類；耐藥基因

大腸埃希菌(E.coli)是人和動物腸道中普遍存在的一類腸道共生菌，也是一種人獸共患的條件致病的革蘭陰性短桿菌。大腸埃希菌也是一種環(huán)境常在菌，但大腸埃希菌的出現(xiàn)通常與糞污密切相關，也通常作為環(huán)境樣品生物測試污染指示物[1]。大腸埃希菌也經(jīng)常作為抗菌素耐藥基因的貯存庫，在細菌耐藥性分析及耐藥基因傳遞研究方面起著非常重要的作用[2-3]。環(huán)境中細菌耐藥基因的消除情況也直接關系到人類醫(yī)療及動物疫病防控過程中抗生素藥物的臨床應用。近年來，隨著規(guī)模養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，大腸埃希菌等細菌病原對于動物健康的危害日趨廣泛而復雜，這也就直接導致了抗菌藥物的大量使用，使細菌耐藥及耐藥基因傳遞逐漸成為廣泛關注的嚴峻問題[4-8]，這給養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展埋下隱患，更為人與動物疾病的預防及治療帶來了極大的危害。

磺胺類藥物是一類人工合成的抗菌藥物，它具有造價便宜，抑菌作用顯著，理化性質(zhì)穩(wěn)定，藥效持久，操作方便等諸多優(yōu)點。其主要作用機制是阻礙二氫葉酸的合成，從而抑制細菌的發(fā)育和繁殖，這在治療動物疾病的應用中具有重要意義[9]。目前，有關致病性大腸埃希菌分離株耐藥性研究表明其對卡那霉素、氨芐西林、慶大霉素等具有較高的耐藥性等[10]，關于豬場糞污中大腸埃希菌對磺胺類藥物耐藥性的檢測與分析尚鮮見。本試驗主要探討豬場糞污中大腸埃希菌對于磺胺類藥物的耐藥性，以期為大腸埃希菌的耐藥性研究提供基礎數(shù)據(jù)，同時為糞污的再次利用及糞污中細菌耐藥基因?qū)Νh(huán)境造成污染等方面的研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本試驗11株大腸埃希菌來源于四川省嘉陵江上游5個飼養(yǎng)管理規(guī)范的大型豬場的糞污樣品中，按照常規(guī)方法對大腸埃希菌進行分離純化以及生化鑒定，然后進行16 S rDNA驗證，最后大腸埃希菌分離株在-20℃以200 mL/L的甘油保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 伊紅美藍培養(yǎng)基、SS瓊脂、麥康凱瓊脂、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基等均為北京奧博星生物技術有限責任公司產(chǎn)品；腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管GYZ 15E為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；MH培養(yǎng)基、藥敏紙片為廣州迪景公司產(chǎn)品；藥敏質(zhì)控菌大腸埃希菌ATCC25922為衛(wèi)生部藥品生物制品鑒定所生產(chǎn)；Mix、DNA Marker、DNA膠回收試劑盒、瓊脂糖等為博瑞克生物公司產(chǎn)品；PCR引物由上海生工生物技術服務有限公司合成；Personal cycler PCR儀，Biometra公司產(chǎn)品；電泳儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 大腸埃希菌耐藥基因型檢測 采用四川大學動物疫病防控與食品安全四川省重點實驗室研制的“細菌對磺胺類藥物耐藥基因三重PCR檢測試劑盒”對所分離的大腸埃希菌進行磺胺類抗生素耐藥基因檢測。參照文獻[11]設計磺胺類耐藥基因引物，引物序列見表1。由上海生工生物技術服務有限公司合成引物。PCR 反應體系為模板 DNA 0.8 μL，dd H2O 5.6 μL，2 ×TaqPCR Master Mix 7 μL，上、下游引物各 0.8 μL，共 15μL。PCR 擴增反應條件:94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共35 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。取 PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，120 V電壓，電泳 30 min，用凝膠成像儀觀察并拍照。

表1 磺胺類耐藥基因引物序列

1.2.2 大腸埃希菌耐藥表型檢測 對分離得到的大腸埃希菌在超凈工作臺內(nèi)進行藥敏試驗，采用美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)推薦的藥敏紙片擴散法，用瓊脂稀釋法檢測大腸埃希菌分離株對于磺胺藥物的敏感性，測定對磺胺類藥物的最小抑菌濃度(MIC)，將大腸埃希菌ATCC25922做為質(zhì)控菌株。其判定結果根據(jù)NCCLS(2009)的標準，對耐藥性以敏感和耐藥兩種形式進行記錄。

2 結果

2.1 大腸埃希菌耐藥基因檢測結果

采用 multi-PCR 試劑盒對11株大腸埃希菌分離株進行磺胺類藥物的耐藥基因檢測，11株大腸埃希菌中均檢測出的sul 1基因，有10株檢測出sul 2基因，sul 3基因在4 株大腸埃希菌中檢出。由此可知，sul 1基因檢出率為100%，sul 2基因檢出率為91%，sul 3基因檢出率為36%?；前奉惪股啬退幓騧ulti-PCR檢測結果見圖1。

2.2 大腸埃希菌耐藥性表型檢測結果

大腸埃希菌分離株進行磺胺類藥物的耐藥表型

檢測結果表明，磺胺復合物(S3)、磺胺二甲基惡唑 (SF)、磺胺甲基惡唑 (RL)抑菌效果均較差，敏感率較低。表型檢測可知大腸埃希菌分離株對于磺胺類藥物的耐藥性較高(表2)。上述結果表明，分離的豬場糞污中大腸埃希菌對磺胺類藥物的耐藥性已經(jīng)相當嚴重。本試驗所檢大腸埃希菌分離株磺胺類藥物的總檢出率為100%，有55%的菌株表現(xiàn)為多重耐藥。由此可知，磺胺類藥物不適合在本試驗采集樣品的養(yǎng)殖場繼續(xù)使用。

3 討論

大腸埃希菌及其耐藥性研究具有重要的醫(yī)療臨床及公共衛(wèi)生意義，吸引了大量相關研究。植嬋萍等[12]報道的種鵝大腸埃希菌對于磺胺類藥物復方新諾明的耐藥率在90%以上。周瑩等[13]報道聊城地區(qū)雞源致病性大腸埃希菌對于磺胺類藥物磺胺甲噁唑的耐藥率在77.8%以上，這與本試驗研究結果相類，表明大腸埃希菌對磺胺藥物普遍表現(xiàn)耐藥，在具體檢出率上存在差異。這種檢出率差異可能來自于不同養(yǎng)殖品種、不同的病原菌譜系、不同的用藥習慣、不同的藥物使用頻率等等，導致菌株在對磺胺耐藥性的產(chǎn)生、攜帶、傳遞及消減周期表現(xiàn)存在差異。但總體看來，大腸埃希菌對磺胺藥物的敏感率呈明顯下降趨勢，原因可能是由于抗菌藥物長期、大量的不合理使用，也可能是因為大腸埃希菌對外界環(huán)境有較強的適應能力，使大腸埃希菌對藥物的抗性增加。

1～11.大腸埃希菌菌株編號；M.DNA標準DL 1 000

1-11.Codes ofE.coliisolates；M.DNA Maker DL 1 000

圖1 大腸埃希菌分離株中磺胺類藥物耐藥基因檢測結果

Fig.1 Detective results of sulfonamide-resistant genes ofE.coliisolates

表2 大腸埃希菌耐藥表型檢測結果

注：“R”表示耐藥；“S”表示敏感。

Note："R"represents resistance;"S"represents sensitive.

磺胺類藥物具有抗菌譜廣，抑菌效果顯著等優(yōu)點，被廣泛應用于動物疾病的治療，但因其應用較為普遍，細菌對其耐藥性也迅速增加。大腸埃希菌對磺胺類藥物的耐藥機制，是由于攜帶耐藥基因的質(zhì)?？梢酝ㄟ^一系列作用而在細菌之間以較高的頻率進行轉(zhuǎn)移，從而導致了新二氫葉酸合成酶的出現(xiàn)，它具有可替代性及對磺胺類藥物親和力更低的特點。而編碼這類酶的sulR基因可以在細菌間通過整合子、轉(zhuǎn)座子以及質(zhì)粒等方式進行傳遞，并且該基因可導致二氫葉酸合成酶表達水平提高，從而導致大腸埃希菌對磺胺類藥物的抗性增加[1]。sulR基因包括sul1、sul2、sul3這3種基因，其中sul2基因在豬源大腸埃希菌中分布是最廣泛的，在大腸埃希菌對磺胺藥物耐藥性方面的研究也具有重要意義[14]。本試驗中，sul 1基因檢出率為100%、sul 2基因檢出率為90.9%、sul 3基因檢出率為36.4%，與以上研究結果相似；sul3基因的檢出率略低，究其原因可能是由于大腸埃希菌本身所擁有的該基因較少，也可能是由于基因的突變或質(zhì)粒的缺失而導致的。

大腸埃希菌在豬場生產(chǎn)線上普遍存在，磺胺藥物在規(guī)模豬場應用面也較廣泛。本試驗通過檢測豬場糞污中大腸埃希菌對磺胺藥物的耐藥性，及時了解大腸埃希菌對磺胺藥物耐藥狀況及其分子流行病學，探索其耐藥基因分布及傳播規(guī)律，并為大腸埃希菌的臨床防治、磺胺耐藥性研究以及尋找養(yǎng)殖糞污中耐藥研究的生物指示器提供科學依據(jù)。

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Detection of Drug Resistance Phenotypes and Genotypes of Sulfonamides inEscherichiacoliIsolated from Piggery Wastes

WEI Yong1，CHEN Mei-qi2,WANG Li2, DUAN Hui-qin2,XIAO Yun3,YU Ji-feng1,LI Xingyu1

(1.SichuanAnimalScienceAcademe,Chengdu,Sichuan,610064,China; 2.CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu,Sichuan,610041,China; 3.AnimalHusbandryBureauofDazhuCounty,Dazhu, 635100,China)

In order to understand the drug resistance of sulfonamides inEscherichiacoliisolated from piggery wastewater, eleven isolates ofE.coliwere analyzed by K-B method according to the recommendation of the CLSI.Then, multi-PCR Kit method was used to detect sulfonamides-resistant genes(sul1,sul2,sul3).The result shows that resistant rates of elevenE.coliisolates to peptidylsulfanilamide, sulfamoxole and sulfamethoxazole were 45%，45% and 64% respectively.The detection rates of sul 1, sul 2 and sul 3 gene were 100%, 90.9% and 36.4%,respectively.The detection rate of all sulfonamide resistance genes was 100%.It will benefit the further study of drug-resistant mechanism ofE.coli.

E.coli；sulfonamide；drug resistance gene; piggery waste

2015-10-28

四川生豬產(chǎn)業(yè)技術體系創(chuàng)新團隊項目(sccxtd-004)； 四川省富民強縣項目(鄰水縣優(yōu)質(zhì)生豬健康養(yǎng)殖關鍵技術集成與產(chǎn)業(yè)化示范，2014)

魏 勇(1974-)，男，四川南充人，博士，副研究員，主要從事獸醫(yī)微生物學研究。*通訊作者

S852.612;S859.795

A

1007-5038(2016)11-0057-04