韓雪 李雯 李明錦 朱慧慧 劉會(huì)玲

·臨床研究·

宮頸癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)

韓雪 李雯 李明錦 朱慧慧 劉會(huì)玲

目的：觀(guān)察宮頸癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)。方法：選取甘肅省人民醫(yī)院婦科2014年4月至2015年4月的宮頸癌術(shù)前患者22例，宮頸癌術(shù)后患者24例和健康者29例（對(duì)照組）。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)患者外周血中的Treg細(xì)胞，通過(guò)對(duì)Treg細(xì)胞表面標(biāo)記物CD4+、CD25+及轉(zhuǎn)錄因子Foxp3+的標(biāo)記以及對(duì)宮頸癌患者外周血中Treg細(xì)胞的分布情況進(jìn)行分析。結(jié)果：宮頸癌術(shù)前、宮頸癌術(shù)后及健康人患者血中CD4+CD25+Foxp3+Treg的百分比分別為(4.012±0.784)%、（1.915±0.508）%、(0.643±0.375)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論：CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的增加可能影響機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫效應(yīng)，發(fā)生免疫逃逸而致瘤。

宮頸癌；Treg；免疫反應(yīng)

宮頸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其死亡率在婦科腫瘤中位居第二[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2008年全球新增約50萬(wàn)宮頸癌病例，其中發(fā)展中國(guó)家約1.9%、發(fā)達(dá)國(guó)家約有0.9%的女性患宮頸癌[2]。Treg細(xì)胞被認(rèn)為是一群具有抑制其他免疫細(xì)胞功能的負(fù)調(diào)控細(xì)胞，是惡性腫瘤及免疫疾病中外周免疫耐受的關(guān)鍵細(xì)胞，可以通過(guò)下調(diào)機(jī)體的免疫應(yīng)答來(lái)降低宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng)[3]。本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)宮頸癌患者外周血中Treg細(xì)胞表面標(biāo)記物CD4+、CD25+及轉(zhuǎn)錄因子Foxp3+的標(biāo)記，來(lái)分析宮頸癌外周血中的Treg細(xì)胞的數(shù)量，探討Treg細(xì)胞在宮頸癌患者外周血中的表達(dá)狀態(tài)及臨床意義，為宮頸癌免疫治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取宮頸癌術(shù)前患者22例，宮頸癌術(shù)后患者24例，所有病例均為甘肅省人民醫(yī)院婦科住院病例，為2014年4月至2015年4月的新發(fā)病例。健康對(duì)照組29例，是甘肅省人民醫(yī)院體檢中心同期進(jìn)行體檢的健康志愿者。年齡35～65歲，平均年齡為50歲；三組人群中都征求了患者的同意，且近半年內(nèi)未接受過(guò)任何免疫治療，并排除自身免疫性疾病、嚴(yán)重的系統(tǒng)性、感染性疾病和妊娠等，三組患者之間資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組年齡比較

1.2 主要儀器與試劑批號(hào)為E10610-1635的anti-hu?manCD4FITC；批號(hào)為E10284-1633 的anti-humanCD25APC；批號(hào)為E09963-1633的anti-humanFoxp3PE）；批號(hào)為E00029-1671的Foxp3轉(zhuǎn)錄因子染色緩沖液；批號(hào)為4104911的FCM裂解液（用于裂解紅細(xì)胞）；批號(hào)為4111109的流式細(xì)胞儀染色緩沖液。以上均購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。流式細(xì)胞儀：BDFACSCal?ibur（美國(guó)BD公司）；12mm×75mm的圓底流式上樣管、2ml 離心管；TGL-16 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；漩渦儀：GZ-Ⅰ多用振蕩器（北京冰箱電機(jī)廠(chǎng)）；微量移液器（1000μl、100μl、10μl）；冰浴盒。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件分析和整理數(shù)據(jù)，CD4+CD25+Foxp3+Tregs細(xì)胞的數(shù)量占所有外周血淋巴細(xì)胞的比例用（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

宮頸癌術(shù)前患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例（4.012±0.784）%；宮頸癌術(shù)后患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例（1.915±0.508）%；健康組外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例（0.643±0.375）%，三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CD4+/T細(xì)胞比例三組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2、圖1、圖2。

表2 各組外周血CD4+/T細(xì)胞與CD4+CD25+Foxp3+/CD4+細(xì)胞比例

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Treg細(xì)胞，LYM：淋巴細(xì)胞

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞

3 討論

近年來(lái)，宮頸癌的發(fā)病率越來(lái)越高，預(yù)防和防治宮頸癌刻不容緩。目前臨床上尚未嘗試用細(xì)胞免疫治療的方法來(lái)抑制腫瘤。許多小鼠腫瘤模型的研究證實(shí)，無(wú)論是在體內(nèi)還是體外免疫，下調(diào)Treg細(xì)胞數(shù)目或抑制其功能有助于打破免疫抑制，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞殺滅腫瘤細(xì)胞[4]。

Treg細(xì)胞就是通常所稱(chēng)的CD4+CD25+Foxp3+的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，它有兩種分化方式，一種是在外周，幼稚型Treg細(xì)胞受抗原刺激，由TGF-β誘導(dǎo)產(chǎn)生Foxp3，形成了CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞。另一種是在胸腺，由未成熟的T淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟，CD4+細(xì)胞通過(guò)Foxp3分化為CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞，稱(chēng)為自然產(chǎn)生的Treg細(xì)胞[5]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3是CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的主要調(diào)控因子。Foxp3不僅對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的活化有影響，而且對(duì)Treg細(xì)胞的發(fā)育和抑制也起一定作用[6,7]。Treg細(xì)胞可以通過(guò)多種途徑來(lái)抑制機(jī)體免疫，例如：破壞細(xì)胞代謝、依賴(lài)抑制性、調(diào)節(jié)抗原呈遞細(xì)胞功能、細(xì)胞因子以及溶解細(xì)胞途徑[8]。Treg細(xì)胞還可以通過(guò)對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答的抑制，使機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受。宮頸癌眾多發(fā)病機(jī)制之一是癌細(xì)胞的免疫逃逸[9]。免疫逃逸可以使?jié)摲跈C(jī)體內(nèi)的HPV長(zhǎng)時(shí)間不被發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞上調(diào)分泌免疫抑制因子TGF-β,IL-10、IL-35等，下調(diào)Th1、Th2細(xì)胞，抑制機(jī)體免疫[8]，此過(guò)程與Foxp3基因關(guān)系密切，F(xiàn)oxp3影響Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能。研究表明，Treg細(xì)胞在宮頸癌患者中數(shù)量較多，Treg細(xì)胞數(shù)量與宮頸癌的分期及腫瘤大小密切相關(guān)，宮頸癌分期越高，腫瘤體積越大，Treg細(xì)胞的數(shù)量就越高[10]。

本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)宮頸癌術(shù)前、宮頸癌術(shù)后及健康人患者血中的Treg細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞在宮頸癌患者血中顯著升高。通過(guò)對(duì)Treg細(xì)胞表面標(biāo)記物CD4+、CD25+及轉(zhuǎn)錄因子Foxp3+的染色標(biāo)記以及對(duì)宮頸癌患者外周血中Treg細(xì)胞的分布情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，宮頸癌術(shù)前、宮頸癌術(shù)后及健康人患者血中CD4+CD25+Foxp3+Treg的百分比分別為(4.012± 0.784)%、（1.915±0.508）%和(0.643±0.375)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。由此說(shuō)明CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的增加可能影響機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫監(jiān)視，發(fā)生免疫逃逸而致腫瘤的發(fā)生。

綜上所述，Treg細(xì)胞數(shù)量與宮頸癌患者病情進(jìn)展程度、預(yù)后以及生存率有關(guān)。近幾年研究也表明，免疫治療可能成為抑制腫瘤進(jìn)而治療腫瘤的導(dǎo)向。因此，研究Treg數(shù)量在腫瘤性疾病中增高的原因、尋找抑制或清除Treg細(xì)胞的有效方法來(lái)降低Treg細(xì)胞數(shù)量，調(diào)節(jié)機(jī)體腫瘤微環(huán)境的變化，將為以后腫瘤性疾病的研究及自身免疫性疾病的治療提供新的方向。

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A

1004-2725（2016）11-0822-03

甘肅省科技計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：1105TCYA016）

730000甘肅 蘭州，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院（韓雪、李雯、朱慧慧）；730000甘肅 蘭州，甘肅省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科（劉會(huì)玲、李明錦）

劉會(huì)玲，E-mail:liuhuiling75@163.com