張淼，崔岱宗，張昊，何如寶，趙敏

（東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150036）

生物固定化技術(shù)及其在染料廢水脫色中的應(yīng)用

張淼，崔岱宗，張昊，何如寶，趙敏

（東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150036）

在染料廢水的生物處理法中，固定化技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用。根據(jù)造價及其穩(wěn)定性，不同的固定化技術(shù)適用于不同的染料降解反應(yīng)中。較游離態(tài)而言，生物固定化技術(shù)具有高穩(wěn)定性、高生物活性和重復(fù)利用性。最近，關(guān)于固定化技術(shù)的報道已經(jīng)有很多。然而，大多數(shù)研究均針對于特定的固定化技術(shù)的應(yīng)用。綜述了菌體與酶固定化的主要方法，比較了不同固定化技術(shù)的優(yōu)缺點及不同載體材料特性，簡述了固定化技術(shù)在處理染料廢水中的應(yīng)用。

固定化技術(shù)；載體材料；染料廢水；脫色

近年來，合成染料廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的各個領(lǐng)域〔1〕。目前全球已有十萬種不同種類的合成染料，其生產(chǎn)量高達7×107t。在自然條件下，染料降解十分緩慢。此外，染料還具有高致毒性、致突變性和致癌性，嚴重威脅著人類健康。因此對染料廢水的處理迫在眉睫。

傳統(tǒng)的廢水處理方法包括物化法和生物法。物化法雖然能夠使染料廢水脫色，但受到各種因素限制〔2〕。與物化法相比，生物法是一種低成本、高效率、環(huán)境友好型的處理方法，其利用微生物體內(nèi)的多種酶系共同作用，不僅能破壞染料的發(fā)色團使其脫色，還可以破壞染料的分子結(jié)構(gòu)，將其復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成無毒害的小分子，從而達到降解染料的目的〔3〕。

隨著生物法的廣泛應(yīng)用，其不足也逐漸顯現(xiàn)。在實際生產(chǎn)中，游離細胞或酶會在反應(yīng)器運行時隨流動相大量流失，導(dǎo)致降解效率降低，生產(chǎn)成本增加。研究表明，生物固定化技術(shù)能夠解決這一問題。其可提高生物質(zhì)濃度，增強反應(yīng)穩(wěn)定性，確保生物活性。固定化的細胞或酶可更好地適應(yīng)不同理化環(huán)境及減輕有毒物質(zhì)的毒害性，有助于反應(yīng)的連續(xù)性和可操控性。此外，固定化細胞或酶更容易進行固液分離，因此更適用于污水處理系統(tǒng)中。

筆者就生物固定方法、載體材料的研究及其應(yīng)用現(xiàn)狀做了綜述，總結(jié)了生物固定化技術(shù)的方法、載體材料的特性及在染料廢水中的應(yīng)用前景，展望了生物載體材料的發(fā)展方向。

1 生物固定化的分類

1.1 酶固定化

1953年，Grubhofer和Schleith率先采用重氮化法將多種酶固定在聚氨基苯乙烯樹脂上，制成固定化酶。1969年，固定化酶第一次應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。從

此固定化酶技術(shù)得到廣泛的推廣〔4〕，大大提高了酶的重復(fù)利用率。

1.2 細胞固定化

微生物能夠被吸附到固體支持物上。其在固定化態(tài)時具有高生物催化活性、細胞長期穩(wěn)定性、生物催化再生性以及低擴散性等優(yōu)點。

2 生物固定化的方法

2.1 化學(xué)固定法

2.1.1 共價結(jié)合法

共價結(jié)合是指生物分子帶有的功能基團與載體的活化基團通過共價鍵方式穩(wěn)定地結(jié)合。在實際生產(chǎn)中避免了酶脫離載體現(xiàn)象的發(fā)生，具有很高的熱穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性，是目前酶固定化研究中最為活躍的領(lǐng)域。但這種緊密的結(jié)合嚴重地限制了酶的自由移動，影響了酶與反應(yīng)底物的自由結(jié)合，從而降低了酶的活性〔5〕。

2.1.2 交聯(lián)法

交聯(lián)法是指酶分子之間通過多功能試劑使分子內(nèi)形成交聯(lián)從而聚合成一個三級結(jié)構(gòu)或多級結(jié)構(gòu)。常用的交聯(lián)劑是戊二醛。該方法操作簡單，但固定化效率低、機械性能差、穩(wěn)定性低。

2.2 物理固定

2.2.1 吸附法

吸附結(jié)合是指酶或細胞通過吸附被固定在某種載體上的方法，包括物理吸附和離子吸附。其載體有多種材料，如：有機高分子、礦物質(zhì)鹽、金屬氧化物等。該法具有易操作、低成本、高活性的優(yōu)勢，在工業(yè)生產(chǎn)中普遍使用。但這種酶或細胞與載體結(jié)合是最微弱的，容易受周圍環(huán)境影響，使酶或細胞與載體脫離。

2.2.2 包埋法

包埋法是指具有半滲透性的滲透膜將酶或細胞物理性包埋在其網(wǎng)格或微囊內(nèi)的方法。該方法可以實現(xiàn)不同酶或細胞的共包埋。此外，包埋法是以生物分子誘捕作為基礎(chǔ)，這種技術(shù)允許小分子物質(zhì)通過，因而更適用于酶的固定化技術(shù)。

表1是對以上幾種固定化技術(shù)的比較。

表1 幾種固定化技術(shù)特性的比較

3 gysc201611固定化常用的傳統(tǒng)載體

固定化載體材料需要滿足以下要求：（1）機械性能好，化學(xué)性能穩(wěn)定；（2）在下游過程中，被固定的細胞與載體媒介的易分離性；（3）能夠保證固定化細胞或酶的活性。載體材料主要分為兩大類：天然聚合物和合成聚合物。

3.1 合成聚合物

3.1.1 聚丙烯酰胺

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑N，N-亞甲基二丙烯酰胺在催化劑作用下聚合形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。常用的催化劑是過硫酸銨，引發(fā)劑是四甲基乙二胺或三乙醇胺。聚丙烯酰胺包埋的優(yōu)點是機械強度高，化學(xué)性能穩(wěn)定，抗微生物分解性強。但在包埋過程中細胞會受到化學(xué)試劑毒害，從而導(dǎo)致酶活降低。由于聚丙烯酰胺本身具有細胞毒性和環(huán)境毒性，因而嚴重影響其在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用。目前，已有對聚丙烯酰胺固定方法進行改良的研究，如：劉桂萍等〔6〕將低分子的聚丙烯酰胺、甲醛和單體丙烯酰胺添加的質(zhì)量比改為1∶0.6∶0.6后，合成的聚丙烯酰胺對固定的細胞毒害性大大降低，固定化的細胞活性比經(jīng)傳統(tǒng)聚丙烯酰胺固定化后的細胞活性高出42.4%。

3.1.2 聚乙烯醇

聚乙烯醇（PVA）固定化技術(shù)對細胞無毒害、機械性強、穩(wěn)定性高、恢復(fù)性好。在熱溶于水的聚乙烯醇水溶液中加入添加劑或在低溫（-10℃）下可以發(fā)生凝膠化，從而將細胞包埋固定。常用的添加劑為硼酸（H2BO3）。近年來，研究者對PVA-H2BO3包埋固定技術(shù)進行了大量的完善工作。大量研究表明，在PVA交聯(lián)過程中加入海藻酸鹽可以增強其成球的能力。K.M.Khoo等〔7〕將溶解的PVA和海藻酸鈣混合后加入細胞懸浮液制作凝膠小球，發(fā)現(xiàn)海藻酸鈣的加入增大了小球的直徑且降低了物質(zhì)傳遞的阻礙。K.Y.A.Wu等〔8〕將海藻酸鈉的質(zhì)量濃度控制在4 g/L下，可以阻止PVA小球形成的黏附問題。

3.2 天然聚合物

與合成聚合物相比，天然聚合物能夠提高固定化后的細胞或酶的存活率，避免其在干燥后和保存期間快速地失活。

3.2.1 藻朊酸鹽

海藻酸是由β（1，4）-D-甘露糖醛酸和α（1，4）-L-古羅糖醛酸組成的線性聚合物單體。根據(jù)這兩種酸的性能，海藻酸鹽可以在內(nèi)部形成不同孔徑的凝

膠小球。當(dāng)海藻酸與Ca2+接觸時，Ca2+會與線性的聚古羅糖醛酸結(jié)合形成交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。由于古羅糖醛酸與Ca2+的結(jié)合能力要遠遠高于甘露糖醛酸對Ca2+的結(jié)合能力，所以古羅糖醛酸含量越高，凝膠形成就越好。在典型的包埋制作中，海藻酸鹽的質(zhì)量濃度一般控制在10~80 g/L。

曾胤新〔9〕將5m L的Kluyveromyces sp.r-85細胞加到20mL的20 g/L海藻酸鈉溶液中，再將之滴入到40 g/L的CaCl2溶液中，最終得到了直徑約為2mm的小球。該方法操作簡單，所制小球機械性能好。

3.2.2 к-角叉菜膠

к-角叉菜膠是由α（1，4）-D半乳糖和β（1，3）-D半乳糖交替組成基本骨架。其作為螯合劑較海藻酸鹽敏感性低，然而，к-角叉菜膠比較脆弱，容易引起固定材料的破裂。在傳統(tǒng)操作中，經(jīng)常使用槐樹豆膠增強角叉菜膠的強度。此外，高含量的鉀離子也可以提高其強度。

表2是對上述幾種載體材料特性的比較。

表2 傳統(tǒng)載體材料特性的比較

4 新型載體材料

4.1 納米材料載體

近年來，納米材料廣泛應(yīng)用于酶固定化技術(shù)。較傳統(tǒng)載體，納米載體具有明顯優(yōu)勢：顆粒直徑微小、比表面積較大、易于在其表面偶聯(lián)一些特異性的配體，進而調(diào)控酶的結(jié)構(gòu)和特性。此外，納米材料具有更高的表面自由能，易于分離，提高了生物相容性等獨特的優(yōu)勢〔10〕。

4.2 纖維素材料載體

纖維素是一種天然生物降解材料，具有良好的生物相容性和親水性。作為載體，其具有較強的機械性。R.O.Cristóv?o等〔11〕將綠椰纖維素用3-丙基三甲氧基硅烷硅烷化后將漆酶固定其上。被固定的漆酶可以高效對染料廢水進行脫色。此外，纖維素單寧樹脂載體，多孔醋酸纖維素載體都是較新型的固定化載體〔12〕。

4.3 磁性材料載體

磁性高分子微球是指因內(nèi)部含有磁性金屬或金屬氧化物的超細粉末而具有磁響應(yīng)性的高分子微球。其中，F(xiàn)e3O4是使用比較廣泛的金屬氧化物。Lincheng Zhou等〔13〕在厭氧條件下將FeCl3和FeCl2溶解后，滴到NaOH溶液中，從而得到Fe3O4納米物質(zhì)。這類純磁性載體分離效果良好，但是對酶的親和性不高，降低了酶負載量，基于此，他們將Fe3O4與聚氨酯泡沫體（PUF）結(jié)合共同包埋細胞用于甲苯的降解。Fe3O4-PUF提高了非親水性的Fe3O4的熱穩(wěn)定性，這種復(fù)合型的磁性材料具有較好的順磁性，可以通過外部磁場來調(diào)控其磁性化和控制其性能。

4.4 介孔材料載體

介孔材料孔徑大小可以調(diào)控，孔徑連通性能好，可為不同大小的酶提供適合的介孔載體。此外，該類型載體還可以促進基底與物質(zhì)的接觸。目前，大孔徑、高比表面和孔容的新型介孔材料不斷被引入酶固定化領(lǐng)域。近年來，無機-有機復(fù)雜介孔材料得到了重視，如：介孔氧化硅、介孔聚合物和介孔金屬有機物質(zhì)。有機物質(zhì)的加入可以提高載酶量，提高酶的穩(wěn)定性，增強酶的物理吸附。

5 固定化技術(shù)在染料廢水脫色中的應(yīng)用

5.1 偶氮染料

5.1.1 酶固定化技術(shù)用于處理偶氮染料廢水

M.Chhabra等〔14〕在降解偶氮染料酸性紅27的研究中，采用PVA-硝酸鹽共價交聯(lián)的方式固定化漆酶，該方法能夠保證漆酶90%的活性，且在4℃的條件下保存5個月后，漆酶的活性仍高于70%，說明固定化漆酶具有較好的穩(wěn)定性。采用固定化體系對染料進行連續(xù)降解，發(fā)現(xiàn)在10~20個循環(huán)中，脫色率仍保持在90%~95%。S.V.Mohan等〔15〕比較了辣根過氧化物酶分別在游離態(tài)和聚丙烯酰胺包埋下對酸性黑10BX的降解能力。結(jié)果表明，較游離態(tài)而言，聚丙烯酰胺凝膠包埋后的HRP具有較好的降解效果，明顯縮短了染料的降解時間。

5.1.2 細胞固定化技術(shù)用于處理偶氮染料廢水

目前，多種細胞固定化技術(shù)已成功地應(yīng)用于偶氮廢水的連續(xù)處理中。A.Moutaouakkil等〔16〕在甲基紅脫色的研究中，分別采用海藻酸鈣、聚丙烯酰胺、蛭石和庫伯山毛櫸固定化Enterobacteragglomerans。相比之下，海藻酸鈣固定化的小球表現(xiàn)出最優(yōu)的脫色率。在連續(xù)脫色的研究中，海藻酸鈣小球在連續(xù)7個循環(huán)中，脫色率并沒有明顯的下降。LeiYu等〔17〕在分別用海藻酸鹽、海藻酸鹽-TiO2納米和海藻酸

鹽-活性炭固定化Bacillus sp.CICC23870研究中發(fā)現(xiàn)，固定化后的菌體可以高效地降解多種偶氮染料。

5.1.3 生物反應(yīng)器用于處理偶氮染料廢水

在工業(yè)廢水處理中一般采用生物反應(yīng)器實現(xiàn)對大量偶氮廢水的連續(xù)降解。C.J.Ogugbue等〔18〕用海藻酸鈣將Bacillus firmus固定化后，應(yīng)用于對染料C.I.Direct red 80的序批式活性污泥法（SBR）處理系統(tǒng)中，該固定化小球表現(xiàn)出高效的染料脫色能力，且在反應(yīng)器連續(xù)運行中固定化小球始終能夠保證較高的機械強度。

混合菌群也被應(yīng)用到了生物反應(yīng)器降解偶氮染料的實踐中，由好氧菌B acillus vallismortis、B.pumilus、B.cereus、B.subtilis、B.megaterium組成的混合菌群通過大理石碎片固定在上流式生物反應(yīng)器中降解直接紅28，研究發(fā)現(xiàn)，在0.6mmol/min的曝氣率和60mL/h的流速下，固定化的好氧混合菌群具有較高的脫色率〔19〕。

5.2 蒽醌及三苯甲烷染料

M.D.Stanescu等〔20〕將生物酶固定成小球降解兩種蒽醌衍生物酸性藍和溴氨酸。研究發(fā)現(xiàn)，固定后的酶具有更高的穩(wěn)定性，可以適應(yīng)較為惡劣的環(huán)境，且對染料的降解沒有干擾作用。D.K.Sharma等〔21〕將Bacillus sp.、Alcaligenes sp.、Aeromonas sp.固定化后，在上流式反應(yīng)器中探究降解一種三苯甲烷染料酸性藍15，研究發(fā)現(xiàn)，該種三苯甲烷可以被降解成簡單的中間代謝產(chǎn)物，降解率可達94%。

5.3 苯及苯的衍生物

染料經(jīng)脫色后會產(chǎn)生一些難以降解的物質(zhì)，苯和苯的衍生物就是其代表之一。研究發(fā)現(xiàn)，生物固定化技術(shù)也可以應(yīng)用在苯及苯的衍生物的降解。

M.L.Paje等〔22〕采用海藻酸鈣固定Rhodococcus sp.形成凝膠小球，并將其固定在含有陶瓷的生物膜上連續(xù)處理廢水中的苯，固定后的菌體對苯的降解率達到97%，與游離態(tài)的菌體相比，固定化沒有影響其降解效果。

S.A.Ahmad等〔23〕采用7.5 g/L的吉蘭糖膠將Acinetobacter sp.固定后降解苯酚，研究發(fā)現(xiàn)游離態(tài)的細胞在較高的苯酚濃度下會失去降解活性，而固定化的菌體不但可以在高濃度的苯酚環(huán)境下依然保持對其的降解能力，而且降解效果與游離態(tài)菌體類似。此外，該固定化材料的機械性能較好，可以保持活性連續(xù)進行45個降解循環(huán)。

表3例舉了固定化技術(shù)在染料降解中的應(yīng)用。

表3 固定化技術(shù)在染料廢水中的應(yīng)用

6 總結(jié)和展望

固定化技術(shù)雖然具有很大的發(fā)展?jié)摿?，但是很多方面還不夠成熟。固定化方法的改良、固定化材料的探索和優(yōu)良菌種的選育是實現(xiàn)固定化技術(shù)大規(guī)模應(yīng)用的重要途徑。其中，載體材料的選擇對固定化技術(shù)的優(yōu)化十分重要。固定化材料的穩(wěn)定性、生物負載、造價成本及生物毒性是決定其經(jīng)濟可行性的關(guān)鍵。但由于載體材料造價高、穩(wěn)定性差，嚴重限制了固定化技術(shù)的推廣，使得固定化技術(shù)的發(fā)展遇到了瓶頸。因此，新型材料的開發(fā)至關(guān)重要。目前，高分子復(fù)合材料、納米材料、磁性材料因其性能穩(wěn)定、成本低廉、傳遞性高的特點逐步成為研究的熱點，但依然存在技術(shù)上的不足。這些問題的解決有賴于生物、材料及化工的聯(lián)合研究。隨著科研技術(shù)的發(fā)展和理論的深入及綜合知識的運用，這些問題可以逐一攻克，固定化技術(shù)在染料廢水處理的領(lǐng)域可以得到廣泛的應(yīng)用。

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Biologicalimmobilized techniques and theirapplication to the decolorization of dyeing wastewater

ZhangMiao，CuiDaizong，Zhang Hao，He Rubao，ZhaoMing
（Northeast Forestry University，Harbin 150036，China）

Immobilization techniques have widely been applied to the biological treatment methods for dyeing wastewater.Different immobilization techniques are suitable for different dyeing degradation reaction，according to their project costand stability.Compared to its free form，bio-immobilization techniques have high stability，high biological activity and reusability.Recently，there have been a lot of reports on immobilization techniques，butmost studies areonly aiming at the application ofspecific immobilization techniques.Themainmethods for thalliand enzyme immobilizationsare introduced and summarized，and the advantagesand disadvantages of immobilization techniques，and the characteristics of different carriermaterials compared.In addition，an accounton the application of immobilization techniques to the treatmentofdyeingwastewater ispresented briefly.

immobilization techniques；carriermaterials；dyeingwastewater；decolorization

X703.1

A

1005-829X（2016）11-0016-05

張淼（1989—），碩士。電話：18646213825，E-mail：540162649@qq.com。通訊作者：趙敏，博士生導(dǎo)師，教授。電話：13104510480，E-mail：82191513@163.com。

2016-09-21（修改稿）

國家自然科學(xué)基金（J1210053）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費（2572015BA04）