周偉強

（沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室，遼寧 沈陽 110034）

瘦素調(diào)控乳腺癌MDA-MB-231細胞周期進程的研究

周偉強

（沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點實驗室，遼寧 沈陽 110034）

目的：研究瘦素誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞周期進程。方法：采用MTT、細胞活力、凋亡及細胞周期測定瘦素刺激乳腺癌MDA-MB-231細胞生長、增殖的生物學能力。并采用實時定量PCR及Western blot法測定瘦素對乳腺癌細胞周期調(diào)控的分子機制。結(jié)果：瘦素作用濃度為1.25 nmol/L、作用時間為24 h的條件下對乳腺癌MDA-MB-231細胞有誘導生長的效果。經(jīng)瘦素處理后的MDA-MB-231細胞表現(xiàn)為細胞活力顯著增強，細胞死亡率和早晚期細胞凋亡發(fā)生率明顯下降。細胞周期檢測結(jié)果也證實經(jīng)瘦素作用后MDA-MB-231細胞進入S期的細胞增多。通過篩查瘦素對細胞周期相關(guān)調(diào)控因子mRNA和蛋白水平表達影響中發(fā)現(xiàn)，瘦素對MDA-MB-231細胞周期調(diào)控因子相關(guān)的影響主要集中在G1→S期限制點調(diào)控上。結(jié)論：瘦素可顯著刺激乳腺癌MDA-MB-231細胞生長，增強乳腺癌細胞惡變性的生物學能力。

乳腺癌；MDA-MB-231；細胞周期

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，在我國，乳腺癌發(fā)病率占女性惡性腫瘤的7%～10%，僅次于子宮頸癌，近幾年發(fā)病率攀升，并有年輕化趨勢，是婦女惡性腫瘤死亡的主要原因之一，嚴重危害女性身心健康［1］。自上世紀80年代以來，隨著對乳腺癌發(fā)生的不斷認識，乳腺癌的預防、治療有了長足的進步，但有效地預防和阻斷乳腺癌發(fā)生和發(fā)展仍是乳腺癌研究的關(guān)鍵和難點之一。

瘦素（Leptin）是Zhang等［2］在1994年通過ob基因定位克隆和定性研究發(fā)現(xiàn)并命名的，由146個氨基酸組成、主要為體內(nèi)白色脂肪細胞分泌的16 kDa蛋白質(zhì)。人類Leptin基因位于第7號染色體的長臂3區(qū)1帶3亞帶（7q31.3），由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，Leptin通過與相應受體OB-Rb結(jié)合而發(fā)揮其生物學效應［3］。

Leptin和乳腺癌的發(fā)生有著千絲萬縷的聯(lián)系，它可作為一種獨立危險因素參與乳腺癌的形成過程［4］。研究表明，隨著正常乳腺細胞Leptin水平的增加，刺激雌激素過度生成。這些雌激素持續(xù)刺激乳腺鄰近脂肪組織的乳腺上皮細胞，使乳腺細胞生長紊亂、過度增殖，并誘發(fā)相關(guān)的血管增生，最終導致乳腺癌的產(chǎn)生［5］。目前臨床上大約1/3乳腺癌患者為雌激素ER-乳腺癌，以惡性程度高、侵襲性強及預后差為主要特征，對于此類乳腺癌人們還沒有完全弄清其致癌機制，本文選取雌激素ER-乳腺癌細胞系MDA-MB-231，探討Leptin在MDA-MB-231細胞增殖過程中的作用，為進一步了解雌激素ER-乳腺癌發(fā)生機制提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料人乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自美國ATCC細胞庫；Leibovitz's L-15培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素及鏈霉素購自美國Thermo公司；人重組Leptin蛋白購自美國Sigma-Aldrich公司；CellTiter96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒購自美國Promega公司；Cell Proliferation Assay試劑盒購自美國Roche公司；其他的化學試劑購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)人乳腺癌MDA-MB-231細胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清、100 U/ml的青霉素、100 μg/ml的鏈霉素的Leibovitz's L-15培養(yǎng)基中。

1.2.2細胞增殖測定將1×104/ml乳腺癌MDAMB-231細胞接種于96孔板各孔中，細胞進行無血清同步化處理后加入不同濃度的Leptin（0、0.625、1.25、2.5、6.5、12.5 μmol/L）與細胞分別孵育24、48和72 h，應用CellTiter96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒進行MTT測定MDA-MB-231細胞增殖的情況。

1.2.3細胞活力測定將5×105/ml乳腺癌MDAMB-231細胞接種于6孔板各孔中，無血清培養(yǎng)液同步化處理后加入不同濃度Leptin（0、0.625、1.25、2.5、6.5、12.5 μmol/L）與細胞孵育24 h。細胞活力實驗參照試劑盒說明書進行。將孵育后的細胞經(jīng)胰酶消化，收集2×105個細胞加入450 μl Count&Viability reagent靜置5 min后應用自動細胞分析儀Muse Cell Analyzer（Millipore）進行檢測。

1.2.4細胞凋亡檢測按1.2.3方法將不同濃度Leptin與MDA-MB-231細胞共同培養(yǎng)24 h后，收集1×106個細胞與100 μl Muse Annexin V&Dead Cell reagent室溫孵育20 min。應用自動細胞分析儀Muse Cell Analyzer檢測Leptin作用下MDA-MB-231細胞凋亡發(fā)生的情況。

1.2.5細胞周期檢測將1.25 nmol/L Leptin與5× 105/ml的MDA-MB-231細胞置于6孔板中共同培養(yǎng)24 h后，加入10 μmol/L BrdU 37℃靜置60 min。加入包被Fluorescein熒光素的抗BrdU單克隆抗體按照Cell Proliferation Assay試劑盒說明書操作程序分別通過流式細胞儀和熒光顯微鏡分析Leptin對MDA-MB-231細胞增殖周期的影響。

1.2.6細胞周期相關(guān)調(diào)控因子mRNA表達的檢測

細胞RNA抽提按試劑盒說明書進行，第一條鏈cDNA合成后應用SYBR Green方法以GAPDH為內(nèi)參進行實時定量PCR反應。25 μl反應體系中包含1×SYBR Green Supermix試劑12.5 μl，0.1 μmol/L上、下游引物各0.5 μl，2 μl cDNA（10 ng）和9.5 μl雙蒸水。實時定量PCR擴增參數(shù)為：50℃2 min，95℃預變性2 min；95℃變性15 s，60℃延伸1 min，延伸后檢測熒光信號，共40個循環(huán)。每個樣品設置3個復孔，mRNA相對表達量按照2-△△Ct法計算。細胞周期蛋白Cyclin E1引物序列：上游為5'-AGCGGTAAGAAGCAGAGCAG-3'，下游為5'-TTTGATGCCATCCACAGAAA-3'；CDK4引物序列：上游為5'-GAAACTCTGAAGCCGACCAG-3'，下游為5'-AGGCAGAGATTCGCTTGTGT-3'；CDK2引物序列：上游為5'-CATTCCTCTTCCCCTCATCA-3'，下游為5'-CAGGGACTCCAAAAGCTCTG-3'；NF-κB引物序列：上游為5'-TCTGCTTCCAGGTGA CAGTG-3'，下游為5'-ATCTTGAGCTCGGCAGTG TT-3'；Bcl-2引物序列：上游為5'-GGATGCCTTT GTGGAACTGT-3'，下游為5'-AGCCTGCAGCTTT GTTTCAT-3'；VEGF引物序列：上游為5'-AAGG AGGAGGGCAGAATCAT-3'，下游為5'-ATCTGCA TGGTGATGTTGGA-3'；GAPDH引物序列：上游為5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，下游為5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'。

1.2.7細胞周期相關(guān)調(diào)控因子蛋白表達的檢測將1.25 nmol/L Leptin與1×106/ml的MDA-MB-231細胞37℃共同孵育24 h。細胞經(jīng)胰蛋白酶消化、離心后，將離心后的細胞團塊裂解，應用BCA蛋白分析試劑盒測定各樣品的蛋白濃度。將20 μg蛋白樣品液上樣進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜后與相關(guān)一抗4℃振蕩過夜。PVDF膜經(jīng)沖洗后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗振蕩孵育1 h。將等體積混合的ECL化學發(fā)光底物A、B液均勻加在PVDF膜上，顯色5 min?；瘜W發(fā)光成像系統(tǒng)曝光呈像。應用ImageJ軟件標定膜上各顯影帶的灰度值量化Leptin對MDA-MB-231細胞中各周期調(diào)控因子表達的影響。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用Student's t-test分析軟件進行統(tǒng)計處理，結(jié)果以（±s）表示，采用單因素方差分析方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1Leptin對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的影響MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Leptin對乳腺癌MDAMB-231細胞確實有誘導細胞生長的效果。在各實驗組中，僅0.625 nmol/L的Leptin未表現(xiàn)出明顯的誘導增殖的作用，當Leptin濃度達到1.25 nmol/L時，作用24 h后即表現(xiàn)出明顯的刺激乳腺癌細胞生長的特性，這種刺激作用一直維持到48 h。隨著作用時間的延長及培養(yǎng)液養(yǎng)分的消耗，孵育時間持續(xù)72 h后濃度為1.25 nmol/L的Leptin還有誘導作用。見圖1。

圖1　Leptin誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的MTT分析

2.2Leptin對乳腺癌MDA-MB-231細胞活力和細胞凋亡的影響細胞活力實驗結(jié)果顯示：Leptin作用24 h后，與對照組相比，雖然Leptin并未表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性刺激乳腺癌細胞增殖的特性，但隨著Leptin的加入，MDA-MB-231活細胞比率還是有不同程度的增加，其中1.25 nmol/L Leptin誘導下MDA-MB-231活細胞比率由63.9%上升至85.6%，刺激乳腺癌細胞生長效果最明顯；而隨著Leptin作用濃度的增加，MDA-MB-231細胞活力并未隨之增加，這說明單純增加Leptin作用濃度并不能達到持續(xù)誘導乳腺癌細胞生長的目的，見圖2。細胞凋亡結(jié)果顯示：與對照組相比，Leptin作用24 h后發(fā)生凋亡的細胞明顯減少，其中1.25 nmol/L Leptin作用下MDA-MB-231細胞中已死亡和發(fā)生凋亡的細胞比率由對照組的15.75%和5.40%下降至0.95%和1.70%，見圖3。

圖2　Leptin誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的細胞活力測定

圖3　Leptin誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的細胞凋亡測定

2.3Leptin對乳腺癌MDA-MB-231細胞周期的影響熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組細胞BrdU熒光點主要集中于細胞的胞質(zhì)和核周，呈散在發(fā)布；而在1.25 nmol/L Leptin作用下，MDA-MB-231細胞中的熒光點主要集中在細胞核內(nèi)，呈密集團塊狀分布，提示此刻細胞正處于細胞復制旺盛期，見圖4A。細胞周期檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1.25 nmol/ L Leptin作用MDA-MB-231細胞24 h后，MDAMB-231細胞中S期細胞比率由對照組的22.6%增加至36.5%，與之對應的是G0/G1期細胞由35.0%下降至28.4%，見圖4B。

圖4　Leptin誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的細胞周期測定

2.4Leptin對乳腺癌MDA-MB-231細胞周期相關(guān)分子表達變化的影響實時定量PCR結(jié)果表明，與對照組比較，Leptin作用后乳腺癌MDA-MB-231細胞中CDK2、CDK4、Cyclin E1、Bcl-2、NF-κB和VEGF mRNA表達水平都有不同程度的增加，見圖5；Western blot結(jié)果顯示，CDK2、Cyclin E1和Bcl-2蛋白表達水平在Leptin誘導下表達量增加，而CDK4和Cyclin D1蛋白表達水平未發(fā)生變化，見圖6。

圖5　Leptin作用乳腺癌MDA-MB-231細胞周期調(diào)控系統(tǒng)的分子mRNA表達的測定

圖6　Leptin作用乳腺癌MDA-MB-231細胞周期調(diào)控系統(tǒng)的分子蛋'白表達的測定

3　討論

肥胖癥一直被認為是乳腺癌發(fā)生的一個重要危險因素，Leptin與肥胖癥密切相關(guān)，其表達水平的高低與乳腺癌相關(guān)［6］。Ozet等［6］采用放射免疫測定法對58例乳腺癌患者血清Leptin水平進行檢測，并選取58例健康人作為對照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌組血清Leptin水平高于對照組（P＜0.05）；絕經(jīng)前后、早期和晚期乳腺癌患者血清Leptin水平比較差異無統(tǒng)計學意義。于華等［7］應用放射免疫分析分別檢測46例乳腺癌、28例乳腺良性病變患者及41例正常對照組外周血中Leptin水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌組外周血中Leptin水平明顯高于乳腺良性病變組及正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義。Leptin表達水平與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，提示Leptin可作為乳腺癌診斷的實驗室指標，可用于指導乳腺癌的分期和預后評價及治療方案的選擇。

前期研究發(fā)現(xiàn)，Leptin可誘導乳腺癌MDAMB-231細胞的游走，增強其侵襲力［8］。本實驗發(fā)現(xiàn)，Leptin具有明顯的誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞生長的特性。經(jīng)Leptin處理后的MDA-MB-231表現(xiàn)為細胞活力顯著增強，細胞死亡率和早晚期細胞凋亡發(fā)生率明顯下降；經(jīng)Leptin作用后MDA-MB-231進入S期的細胞增多。Leptin通過誘導芳香化酶（Aromatase）的活性來調(diào)節(jié)雌激素的生物活性，因此Leptin具有影響雌激素依賴性乳腺癌發(fā)生的生物學能力［9-11］。但Leptin對ER-乳腺癌的作用機制目前還不是十分清楚。我們通過篩查Leptin對細胞周期相關(guān)調(diào)控因子mRNA和蛋白表達水平的影響發(fā)現(xiàn)，Leptin對MDA-MB-231細胞周期相關(guān)調(diào)控因子的影響主要集中在G1→S期限制點調(diào)控上，表現(xiàn)為激活CDK2、CDK4和Cyclin E1的表達，并通過誘導細胞凋亡因子Bcl-2的表達抑制細胞凋亡的發(fā)生。同時在本實驗中，經(jīng)Leptin作用后，MDA-MB-231細胞中NF-κB和VEGF的表達也顯著增加，由于炎癥發(fā)生、細胞增殖和凋亡等多種通路都是由NF-κB調(diào)控的［12-13］，因此Leptin可能在乳腺癌發(fā)生過程中以自分泌或旁分泌方式促進了正常組織的致癌作用和癌細胞的遠處轉(zhuǎn)移，通過激活細胞內(nèi)相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路，在乳腺癌的病程發(fā)展和癌細胞侵襲性方面起著重要的作用。

綜上所述，Leptin作為脂肪細胞因子之一，在本實驗中被證明可以刺激乳腺癌MDA-MB-231細胞生長，增加腫瘤惡變性的生物學能力。但目前對Leptin和乳腺癌關(guān)系的認識遠未成熟，對Leptin誘導乳腺癌發(fā)生的具體機制也尚不清楚，因此本實驗為更好地解釋乳腺癌發(fā)生和在不遠的將來開發(fā)抗乳腺癌藥物提供了理論和實驗依據(jù)。

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（文敏編輯）

Leptin Regulates the Progression of Cell Cycle for Breast Cancer Cell Line MDA-MB-231

ZHOU Weiqiang
（Shenyang Medical College，Key Laboratory of Environmental Pollution and Microecology of Liaoning Province，Shenyang 110034，China）

Objective：To study cell cycle progression induced by leptin in breast cancer cell line MDA-MB-231.Methods：MTT，cell viability test，apoptosis assays and cell cycle analysis were used to detect the effects of leptin on cell growth and proliferation of breast cancer cell line MDA-MB-231.QPCR and Western blot assay were used to assess the molecular mechanisms of leptin on cell cycle regulation of MDA-MB-231 cells.Results：When treated with 1.25 nmol/L leptin for 24 hours，the MDA-MB-231 cells were stimulated to grow obviously.With the leptin treatment，the cell viability was increased markedly and the cell death rate and apoptosis rate was decreased significantly.Cell cycle assay displayed that S phase cells increased after leptin induction.By screening the mRNA and protein levels of cell cycle regulatory factors，the results were demonstrated that leptin could speed up the transition from G1 to S phase in MDA-MB-231 cells.Conclusion：Leptin can significantly stimulate breast cancer MDA-MB-231 cell growth，strengthen the malignant ability of breast cancer cells.

breast cancer；MDA-MB-231；cell cycle

R394.3

A

1008-2344（2016）06-0421-05

10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.06.002

國家自然科學基金項目（No.81172509）

周偉強（1970—），男（漢），教授.研究方向：乳腺癌發(fā)生與調(diào)控.E-mail：zhouwq@hotmail.com

2016-05-09