高 漫，李 蒙，焦向陽(yáng)

(陜西省結(jié)核病防治院，陜西西安 710100)

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·臨床研究·

結(jié)核分枝桿菌耐多藥基因檢測(cè)臨床應(yīng)用研究

高 漫，李 蒙，焦向陽(yáng)

(陜西省結(jié)核病防治院，陜西西安 710100)

目的 評(píng)價(jià)耐多藥基因檢測(cè)利福平、異煙肼藥物敏感性的可行性。方法 收集該院2014年6～12月94例結(jié)核病患者標(biāo)本采用耐多藥基因檢測(cè)儀檢測(cè)利福平、異煙肼藥物敏感性并與BACTEC MGIT 960培養(yǎng)儀檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果 2種方法同時(shí)檢測(cè)利福平、異煙肼藥物敏感性符合率為91.5%(86/94)，符合率較高。結(jié)論 耐多藥基因檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性靈敏度高，特異性強(qiáng)，對(duì)結(jié)核病患者的早期及菌陰患者的及時(shí)、有效治療具有重要意義。

分枝桿菌,結(jié)核； 微生物敏感性試驗(yàn)； 基因,MDR； 實(shí)驗(yàn)室技術(shù)和方法

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌感染引起的嚴(yán)重危害人類健康的主要傳染病，可累及全身各個(gè)臟器[1]。通過(guò)影像學(xué)檢查與實(shí)驗(yàn)室涂片檢查可快速診斷典型結(jié)核病，但對(duì)不典型病例影像學(xué)無(wú)法與其他疾病區(qū)分、涂片陰性的病例就依賴于各臟器受結(jié)核分枝桿菌感染后產(chǎn)生的痰液、胸腹腔積液、腦脊液、灌洗液、膿液等標(biāo)本的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果，這些標(biāo)本成為檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的主要對(duì)象，培養(yǎng)陽(yáng)性就可診斷為結(jié)核病，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)被視為診斷結(jié)核病的“金標(biāo)準(zhǔn)”[2]。但由于結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，就是用目前較先進(jìn)的BACTEC MGIT 960培養(yǎng)儀進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性也需平均12 d時(shí)間[3]，進(jìn)一步藥敏試驗(yàn)還需平均9 d時(shí)間[4]。臨床醫(yī)生對(duì)該類病例只能通過(guò)經(jīng)驗(yàn)用藥，等待結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果再調(diào)整用藥，對(duì)患者的治療具有一定影響。所以，一種快速、簡(jiǎn)便的藥敏檢測(cè)方法對(duì)于患者的早期及時(shí)治療極為重要。耐多藥基因檢測(cè)操作簡(jiǎn)單、快速，可以在3 h內(nèi)得出利福平、異煙肼的耐藥結(jié)果[5]。本研究對(duì)耐多藥基因檢測(cè)方法進(jìn)行了臨床應(yīng)用研究，旨在評(píng)價(jià)其臨床應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院2014年6～12月住院結(jié)核病患者痰液、胸腹腔積液、腦脊液、灌洗液、膿液等經(jīng)培養(yǎng)為結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性標(biāo)本94例作為研究組，以H37Rv(野生型)為陰性對(duì)照(對(duì)照組)，同時(shí)進(jìn)行耐多藥基因檢測(cè)并與BACTEC MGIT 960培養(yǎng)儀檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析。

1.2 儀器與試劑 耐多藥基因檢測(cè)儀由上海宏石醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)，試劑由廈門至善生物科技有限公司生產(chǎn)；BACTEC MGIT 960培養(yǎng)儀及試劑由美國(guó)BD公司生產(chǎn)。

1.3 耐多藥基因檢測(cè)方法 采用熒光PCR溶解曲線法。該法是在PCR體系中加入兩端分別標(biāo)記有熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的探針，在PCR過(guò)程中擴(kuò)增出與探針序列互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸序列，在擴(kuò)增完成后增加溶解曲線分析過(guò)程，同時(shí)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光值變化，通過(guò)計(jì)算熒光值與溫度的負(fù)導(dǎo)數(shù)獲得探針與該序列雜交產(chǎn)物的溶解曲線并得出熔點(diǎn)(Tm值)，從而推測(cè)得到該序列突變信息。如靶序列與探針完全匹配則探針與該序列雜交的熔點(diǎn)最高；如探針與序列不完全匹配如序列發(fā)生點(diǎn)突變、插入或缺失則探針與該序列雜交的熔點(diǎn)低于探針與完全匹配序列雜交的熔點(diǎn)。熔點(diǎn)降低程度與點(diǎn)突變類型、插入或缺失堿基數(shù)量及突變位點(diǎn)位置有關(guān)。耐多藥基因檢測(cè)及BACTEC MGIT 960培養(yǎng)儀檢測(cè)均嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果 陰性對(duì)照H37Rv(野生型)經(jīng)耐多藥基因檢測(cè)與BACTEC MGIT 960培養(yǎng)儀檢測(cè)異煙肼、利福平藥物敏感性均為異煙肼、利福平敏感。

2.2 研究組檢測(cè)結(jié)果 94例標(biāo)本中耐多藥基因檢測(cè)利福平陰性率為80.9%(76/94)，陽(yáng)性率為19.1%(18/94)；BACTEC MGIT 960培養(yǎng)儀檢測(cè)利福平陰性率為84.0%(79/94)，陽(yáng)性率為16.0%(15/94)。94例標(biāo)本中耐多藥基因檢測(cè)異煙肼陰性率為83.0%(78/94)，陽(yáng)性率為17.0%(16/94)；BACTEC MGIT 960培養(yǎng)儀檢測(cè)異煙肼陰性率為76.6%(72/94)，陽(yáng)性率為23.4%(22/94)。見(jiàn)表1。

表1 研究組檢測(cè)結(jié)果(n=94)

2.3 2種方法符合率 對(duì)照組耐多藥基因檢測(cè)與BACTEC MGIT 960培養(yǎng)儀特異性與靈敏度相當(dāng)，研究組94例標(biāo)本中耐多藥基因與BACTEC MGIT 960培養(yǎng)儀同時(shí)檢測(cè)利福平、異煙肼結(jié)果相符86例，符合率為91.5%(86/94)，結(jié)果不符8例，不符率為8.5%(8/94)。

3 討 論

利福平、異煙肼是抗結(jié)核的主要一線藥，敏感與否直接影響結(jié)核病患者療效。用BACTEC MGIT 960培養(yǎng)儀檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性前提是結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性才能進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏試驗(yàn)還需平均9 d才能出結(jié)果，總共需23 d左右[6]，若患者送標(biāo)本之前經(jīng)抗結(jié)核治療，體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌已死亡則BACTEC MGIT 960培養(yǎng)儀檢測(cè)結(jié)果為陰性，不能進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[7]。耐多藥基因檢測(cè)快速、簡(jiǎn)單，從分子生物學(xué)方面進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性或核酸提取陽(yáng)性(對(duì)有生命力或無(wú)生命力的結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)均為陽(yáng)性)標(biāo)本均可進(jìn)行耐多藥基因檢測(cè)，僅需3 h即可檢測(cè)出藥物敏感性結(jié)果。

本研究結(jié)果顯示，耐多藥基因檢測(cè)與BACTEC MGIT 960培養(yǎng)儀檢測(cè)具有較好的一致性，符合率為91.5%(86/94)，在檢測(cè)時(shí)間方面具有很大優(yōu)勢(shì)，僅需3 h即可檢測(cè)出利福平、異煙肼藥物敏感性結(jié)果，對(duì)結(jié)核病早期、菌陰結(jié)核病有效藥物的選擇具有重要意義。

作為一種實(shí)驗(yàn)方法，耐多藥基因檢測(cè)也有其局限性：(1)該實(shí)驗(yàn)只篩選核酸序列而不是氨基酸序列，因此，有可能不引起氨基酸改變的突變也會(huì)被判為突變；(2)耐藥菌占總菌含量的40%以下可能會(huì)造成假陰性結(jié)果；(3)該產(chǎn)品從方法學(xué)上不能區(qū)分具體突變位點(diǎn)，因此，報(bào)告為突變的結(jié)果并不絕對(duì)表示耐藥。但耐多藥基因檢測(cè)陽(yáng)性率與BACTEC MGIT 960培養(yǎng)儀檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)，價(jià)格相當(dāng)，檢測(cè)所需時(shí)間僅為3 h，臨床可根據(jù)患者病情需要選擇檢測(cè)方法。

[1]袁偉，秦川.結(jié)核病動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2010，20(9)：55-59.

[2]沈玉禎.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，34(4)：563-565.

[3]梁亞萍，高漫.BACTEC MGIT 960用于結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)的初步評(píng)價(jià)[J].中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，12(6)：521-522.

[4]周昌明，羅丹，廖光付.結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)概述(綜述)[J].中國(guó)城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生，2009(4)：89-91.

[5]馬艷艷，李輝，趙東陽(yáng)，等.熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐利福平突變研究[J].口岸衛(wèi)生控制，2011，16(5)：21-24.

[6]馬艷艷，李輝，錢成，等.結(jié)核桿菌基因型耐藥檢測(cè)研究[J].河南預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，21(5)：321-324.

[7]趙立平，于霞，姜廣路，等.對(duì)BACTECTM MGIT960培養(yǎng)報(bào)告結(jié)果為陰性的培養(yǎng)管中顆粒性物質(zhì)的研究[J].中國(guó)防癆雜志，2013，35(1)：27-31.

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.02.041

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