易 品 綜述，邵超鵬，顧大勇，董瑞玲 審校

(1.南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510515；2.深圳國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心，廣東深圳 518033)

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·綜 述·

瘧色素應(yīng)用于拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)瘧疾研究進(jìn)展

易 品1綜述，邵超鵬1，顧大勇2，董瑞玲2審校

(1.南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510515；2.深圳國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心，廣東深圳 518033)

光譜分析,拉曼； 瘧疾; 實(shí)驗(yàn)室技術(shù)和方法; 瘧色素； 特征峰

瘧疾是一種由瘧原蟲感染引起的威脅生命的疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的最新情況，2013年仍有共計(jì)約1.98億瘧疾患者，其中58.4萬(wàn)人死亡。瘧原蟲侵入人體后早期寄生在肝細(xì)胞中，后期主要寄生在紅細(xì)胞內(nèi)。瘧原蟲在宿主紅細(xì)胞內(nèi)以血紅蛋白中的珠蛋白部分為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，而血紅蛋白的血紅素部分則被釋放出來(lái)成為游離血紅素，為避免游離血紅素對(duì)瘧原蟲自身的殺傷作用，瘧原蟲將游離血紅素轉(zhuǎn)化成不可溶的高鐵血紅素結(jié)晶，即瘧色素[1-2]。目前針對(duì)瘧色素檢測(cè)的研究取得許多進(jìn)展，尤其是拉曼光譜技術(shù)。拉曼光譜技術(shù)的基本原理是利用激光照射介質(zhì)后會(huì)產(chǎn)生與入射波長(zhǎng)不同的光譜，從而獲得分子振動(dòng)的相關(guān)信息，進(jìn)而獲得物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。瘧色素具有特殊的二聚體分子結(jié)構(gòu)[3]，拉曼激光照射瘧色素會(huì)產(chǎn)生不同于血紅蛋白的拉曼光譜,即特征峰，這為早期診斷瘧疾帶來(lái)希望。

1 拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)瘧色素的優(yōu)勢(shì)

1.1 樣本處理 拉曼光譜技術(shù)所需樣品量非常少，樣本無(wú)需進(jìn)行染色或去除雜質(zhì)等處理，液體、固體均可，甚至活細(xì)胞原位也能進(jìn)行檢測(cè)，而且檢測(cè)后對(duì)樣本無(wú)影響[4-5]，可避免常規(guī)檢測(cè)手段樣本處理過程中待檢物的損失和待檢物理化性質(zhì)的改變。國(guó)內(nèi)外學(xué)者將拉曼光譜技術(shù)應(yīng)用于瘧疾患者血清[5]、瘧疾感染紅細(xì)胞裂解液等的檢測(cè)，通過分析拉曼光譜技術(shù)，可深入了解血清中瘧色素是否存在，進(jìn)而判斷是否感染瘧疾。此外活細(xì)胞原位拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)可以準(zhǔn)確反應(yīng)體內(nèi)細(xì)胞和物質(zhì)的實(shí)時(shí)信息如Frosch等[6]將顯微共聚焦拉曼光譜技術(shù)應(yīng)用于瘧原蟲感染紅細(xì)胞原位檢測(cè)，獲得分辨率較高的瘧色素在紅細(xì)胞的分布圖。在瘧疾的檢測(cè)方面，活細(xì)胞原位檢測(cè)雖然直觀高效但耗時(shí)長(zhǎng)，而血清檢測(cè)既簡(jiǎn)便、快速又準(zhǔn)確。此外拉曼光譜技術(shù)具有無(wú)需標(biāo)記且無(wú)波壞性的特點(diǎn)，對(duì)臨床應(yīng)用具有極重要的意義。

1.2 檢測(cè)靈敏度 目前瘧原蟲感染的檢測(cè)方法主要分為3種：(1)血涂片鏡檢，血涂片鏡檢仍然是目前臨床瘧疾診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，雖然準(zhǔn)確度高，但其有對(duì)檢測(cè)者的要求高、耗時(shí)長(zhǎng)和靈敏度差等缺點(diǎn)；(2)核酸檢測(cè)，以PCR為代表的分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)瘧原蟲的特異性核苷酸片段來(lái)判斷是否有瘧原蟲感染[7-8]，其靈敏度雖然有所提高(在瘧原蟲大于或等于5個(gè)/μL時(shí)其檢測(cè)陽(yáng)性率可達(dá)100%)，但對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求高且達(dá)不到快速檢測(cè)的要求[9]；(3)抗原抗體反應(yīng)，檢測(cè)瘧原蟲的特異抗原如ELSIA、免疫膠體金技術(shù)等[9]，雖然具有操作簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)，但靈敏度不高(陽(yáng)性率為77%～98%，且是在瘧原蟲大于100個(gè)/μL條件下)[10]?？傊?，目前已有的檢測(cè)手段存在靈敏度不夠及實(shí)驗(yàn)條件要求高等缺點(diǎn)，而臨床亟須一種靈敏度高又快速的檢測(cè)手段。近年來(lái)隨著拉曼光譜技術(shù)不斷發(fā)展，市場(chǎng)上出現(xiàn)如顯微共聚焦拉曼、激光共振拉曼、表面增強(qiáng)拉曼、便攜式拉曼儀等新技術(shù)，這些新技術(shù)大大提高了拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)的靈敏度。顯微共聚焦拉曼光譜儀測(cè)量樣品可以小到1 μmoL的量，激光共振拉曼產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度可達(dá)到正常拉曼譜帶的104～106倍，表面增強(qiáng)拉曼產(chǎn)生的拉曼信號(hào)較普通拉曼強(qiáng)104～107倍。便攜式拉曼儀的應(yīng)用使瘧疾檢測(cè)儀器小型化，便于開展瘧疾的篩查。有文獻(xiàn)報(bào)道，將瘧原蟲的檢測(cè)濃度下限降低至5 nmol/L的極限(相當(dāng)于每微升體積中含有30個(gè)早期瘧原蟲體)[11]，在活細(xì)胞原位檢測(cè)時(shí)甚至可以達(dá)到納米級(jí)的信號(hào)收集，掃描的分辨率達(dá)0.5 μm。

2 瘧色素結(jié)構(gòu)特性及拉曼光譜技術(shù)特點(diǎn)

2.1 瘧色素結(jié)構(gòu)及順磁性 瘧色素是由2個(gè)高鐵原卟啉環(huán)[Fe(Ⅲ)PPIX]通過疏水鍵連接形成的二聚體結(jié)構(gòu)[3,12]，見圖1。在瘧色素形成過程中血紅素中的二價(jià)鐵被氧化成三價(jià)鐵，使原子軌道外周含有不成對(duì)電子，故使瘧色素具有順磁性。這種特性使瘧色素在外加磁場(chǎng)作用下，產(chǎn)生磁力而被吸引，可用于與外周血中其他細(xì)胞或物質(zhì)分離[13]。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，基于外加磁場(chǎng)的瘧原蟲感染紅細(xì)胞富集效果(富集效率為98%)優(yōu)于密度梯度離心(富集效率為90%～97%)[14-15]，且具有磁性的表面增強(qiáng)其瘧色素的拉曼增強(qiáng)效應(yīng)明顯強(qiáng)于無(wú)磁性的表面增強(qiáng)[16]。

圖1 瘧色素二聚體結(jié)構(gòu)

2.2 瘧色素的拉曼光譜技術(shù)特點(diǎn) 瘧色素在拉曼光譜技術(shù)激光照射下會(huì)產(chǎn)生特異性拉曼光譜，且在不同波長(zhǎng)(532、568、633、647、676、830、1 064 nm)下照射下會(huì)產(chǎn)生不同特征的拉曼光譜[17]，見圖2，可能與不同波長(zhǎng)激光照射時(shí)激光頻率與分子內(nèi)部相應(yīng)分子鍵或結(jié)構(gòu)共振有關(guān)。瘧色素的拉曼光譜總結(jié)起來(lái)有以下幾個(gè)特點(diǎn)：(1)在568、830 nm波長(zhǎng)下，拉曼位移1 372 cm-1處拉曼強(qiáng)度明顯強(qiáng)于其他幾個(gè)波長(zhǎng)，且瘧色素拉曼位移在1 372 cm-1處峰強(qiáng)度較血紅蛋白高，這與瘧色素二聚體之間的四吡喏重疊區(qū)域共振有關(guān)，1 372 cm-1反映卟啉環(huán)反π*軌道電荷濃度相關(guān)[18]；(2)由于血紅蛋白衍生物在400 nm附近均有強(qiáng)大的吸收帶[邵氏帶(Soret band)]的存在，在420 cm-1處附近有較強(qiáng)的峰，這與卟啉化合物結(jié)構(gòu)有關(guān)，可依據(jù)此鑒定是否為卟啉化合物；(3)Q帶，其在未插入金屬離子時(shí)會(huì)出現(xiàn)4個(gè)峰，插入金屬離子后減少到1～2個(gè)峰；(4)在532～647 nm波長(zhǎng)中343、368 cm-1處峰強(qiáng)度隨著波長(zhǎng)增加而增強(qiáng)，且343 cm-1峰強(qiáng)度強(qiáng)于368 cm-1處。但當(dāng)波長(zhǎng)超過647 nm時(shí)343、368 cm-1處慢慢減弱，這與瘧色素二聚體之間形成的丙酸酯鍵有關(guān)；(5)755 cm-1峰強(qiáng)度在633、647、676 nm波長(zhǎng)激光檢測(cè)時(shí)明顯高于其他波長(zhǎng)，755 cm-1反映卟啉呼吸環(huán)振動(dòng)[19]；(6)1 623、1 568 cm-1除在568、830 nm波長(zhǎng)處的強(qiáng)度稍弱外，其他波長(zhǎng)下的強(qiáng)度均較強(qiáng)，這與吡咯環(huán)振動(dòng)有關(guān)，1 623、1 568 cm-1不僅能反映鐵離子的自旋狀態(tài)，還能反映卟啉環(huán)中心孔徑(core size,鐵離子到吡喏氮離子的距離)的大小[20]。瘧色素與血紅蛋白的拉曼光譜比較見表1，瘧色素的主要拉曼光譜特征峰見表2。

圖2 不同波長(zhǎng)下瘧色素的拉曼光譜

血紅蛋白(cm-1)感染紅細(xì)胞中的瘧色素(cm-1)瘧色素(cm-1)16381638-16181619-16041604-15811578158115651563-15461545-14281427143013981396139813671366-13421343--1310130812491249-12261225-11721174-11291131-10901087-996998--972971-796797-757754

-：無(wú)數(shù)據(jù)。

表2 瘧色素的特征峰[22]

注：此表根據(jù)平面對(duì)稱卟啉系統(tǒng)評(píng)價(jià)，其中ν為伸縮振動(dòng)，vinyl為乙烯基，δ為平面內(nèi)變形振動(dòng)，pyr為吡咯，deform為變形，sym為對(duì)稱性，half-ring為半環(huán)；-無(wú)數(shù)據(jù)。

3 表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)在瘧色素檢測(cè)中的應(yīng)用

拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)最大的缺點(diǎn)是拉曼散射信號(hào)弱，在瘧原蟲感染率極低的情況下，拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)可能出現(xiàn)假陰性，如果拉曼信號(hào)能被增強(qiáng)，將大大提高檢出率。表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)的發(fā)現(xiàn)，使瘧原蟲的檢測(cè)信號(hào)大大增強(qiáng)，可達(dá)普通拉曼的104～107倍。SERS定義為當(dāng)物質(zhì)分子吸附在一些特定粗糙的金屬表面時(shí)分子的拉曼散射強(qiáng)度得到大大提升[23]，國(guó)外許多文獻(xiàn)報(bào)道了SERS在拉曼光譜檢測(cè)瘧色素應(yīng)用中的不錯(cuò)表現(xiàn)如2011年Yuen等[11]設(shè)計(jì)了一種以Fe3O4納米顆粒為核心，以納米銀顆粒為包殼模式的表面增強(qiáng)，使得這種表面增強(qiáng)帶有磁性富集作用，提升了檢測(cè)靈敏度，達(dá)到5 nM的濃度極限(相當(dāng)于每微升體積中含有30個(gè)早期瘧原蟲體)；2年后Yuen等[24]調(diào)整了Fe3O4納米顆粒厚度及納米銀包殼大小，優(yōu)化了以上表面增強(qiáng)，更進(jìn)一步增強(qiáng)了拉曼信號(hào)；Garrett等[16]根據(jù)蝴蝶翅膀納米結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了一種在以蝴蝶翅膀的納米結(jié)構(gòu)為基質(zhì)表面鍍納米金的表面增強(qiáng)，這種增強(qiáng)能使檢測(cè)極限達(dá)到蟲血率為0.000 05%；Wood等[25]結(jié)合納米探針技術(shù)與表面增強(qiáng)技術(shù)，設(shè)計(jì)了一種針尖增強(qiáng)拉曼散射(TERS)，克服了普通表面增強(qiáng)信號(hào)收集范圍廣所帶來(lái)的信號(hào)干擾，實(shí)現(xiàn)了納米級(jí)信號(hào)的收集，極大地提高了檢測(cè)分辨率。新型材料石墨烯，具有理想的單層碳原子的二維結(jié)構(gòu)，形成一個(gè)蜂窩狀晶格平面，具有做表面增強(qiáng)的特性，最近研究表明，石墨烯具有明顯的熒光猝滅現(xiàn)象，存在表面增強(qiáng)效應(yīng)[26-27]。

4 瘧色素應(yīng)用于拉曼光譜技術(shù)檢測(cè)瘧疾的前景

拉曼光譜技術(shù)作為新興手段應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，即高靈敏度、高分辨率、快速及標(biāo)本無(wú)需處理等特點(diǎn)，近年來(lái)該技術(shù)逐漸成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。拉曼光譜技術(shù)不僅用于血清、體液等的檢測(cè)，還拓展到活細(xì)胞或組織原位研究如正常和感染瘧疾的紅細(xì)胞原位檢測(cè)、血清中腫瘤標(biāo)記物檢測(cè)與定量分析、動(dòng)脈粥樣硬化的早期診斷等，這些研究均取得較好的結(jié)果。同時(shí)伴隨著石墨烯表面增強(qiáng)納米材料、表面增強(qiáng)、微流控等相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，檢測(cè)閾值和檢測(cè)時(shí)間進(jìn)一步縮小(或縮短)，這對(duì)早期診斷瘧疾意義非凡。但石墨烯材料作為新發(fā)現(xiàn)的材料本身具有做表面增強(qiáng)基底的特性，其將具有巨大應(yīng)用前景分子印跡技術(shù)結(jié)合表面增強(qiáng)將來(lái)會(huì)發(fā)揮巨大的應(yīng)用潛力。拉曼光譜技術(shù)推廣到臨床使用還需要克服幾個(gè)缺點(diǎn)如固體(或晶體)樣品的檢測(cè)效果優(yōu)于液體、復(fù)雜樣品的信號(hào)會(huì)受到干擾、檢測(cè)范圍小及自動(dòng)化程度差等。相信在未來(lái)這些缺點(diǎn)會(huì)被一一克服，拉曼光譜技術(shù)憑借其檢驗(yàn)特性將有望為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)科的發(fā)展增添新動(dòng)力。

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國(guó)家質(zhì)檢總局科研基金項(xiàng)目(2014IK054)。 作者簡(jiǎn)介：易品，男，在讀碩士研究生，主要從事光譜學(xué)方法在瘧疾的診斷中的應(yīng)用及血液免疫分子生物學(xué)的研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.02.035

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1673-4130(2016)02-0229-04

2015-08-27)