趙一琳，崔映紅，黃少芝

(常熟市醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，江蘇常熟 215500)

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·論 著·

PCR-熒光法與PCR-膜雜交法在檢測(cè)HPV-DNA中的比較分析

趙一琳，崔映紅，黃少芝

(常熟市醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，江蘇常熟 215500)

目的 比較并分析PCR-熒光法與PCR-膜雜交法在臨床感染人乳頭瘤病毒(HPV)中的檢測(cè)結(jié)果，探討其不同的應(yīng)用價(jià)值。方法 收集204例標(biāo)本，分別采用PCR-熒光法與PCR-膜雜交法檢測(cè)HPV-DNA，以細(xì)胞組織學(xué)診斷為標(biāo)準(zhǔn)分為未見(jiàn)上皮內(nèi)病變或惡性病變(NILM)組(152例)、意義不明的非典型鱗狀上皮細(xì)胞增生(ASC-H)組(27例)、鱗狀上皮細(xì)胞低度病變(LSIL)組(21例)、鱗狀上皮細(xì)胞高度病變(HSIL)組(2例)和宮頸鱗癌(SCC)組(2例)。比較各組患者HPV-DNA陽(yáng)性率，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較2種方法的差異性。結(jié)果 204例標(biāo)本中PCR-熒光法檢測(cè)陽(yáng)性67例，陰性137例，陽(yáng)性率為32.8%。PCR-膜雜交法檢測(cè)陽(yáng)性94例，陰性110例，陽(yáng)性率為46.1%。細(xì)胞學(xué)診斷有異常細(xì)胞52例(25.5%)。NILM組患者2種方法檢測(cè)HPV陽(yáng)性率分別為12.5%、28.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.670，P=0001)；細(xì)胞異常組患者2種方法檢測(cè)HPV陽(yáng)性率分別為92.3%、98.1%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.891，P=0.363)；細(xì)胞異常組患者2種方法檢測(cè)HPV陽(yáng)性率與NILM組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 PCR核酸擴(kuò)增檢測(cè)HPV-DNA具有很高的特異性與靈敏度。在臨床篩查診療中PCR-熒光法具有更高的應(yīng)用價(jià)值，而在非高危性HPV檢測(cè)領(lǐng)域和科研領(lǐng)域PCR-膜雜交法更具優(yōu)勢(shì)。HPV-DNA檢測(cè)結(jié)合細(xì)胞組織病理學(xué)檢查可提高HPV感染診斷的準(zhǔn)確性與臨床指導(dǎo)意義。

乳頭狀瘤病毒科; 聚合酶鏈反應(yīng); 熒光; 膜雜交法

人乳頭瘤病毒(HPV)是婦女生殖道感染的常見(jiàn)病原體，是宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和宮頸癌的主要病因。有研究表明，99%宮頸癌患者存在HPV感染，在美國(guó)至少有80%婦女到50歲時(shí)有過(guò)一次以上HPV感染史[1]。由于HPV感染與宮頸癌的高度相關(guān)性，而HPV陰性者幾乎很少發(fā)生宮頸癌；且HPV感染與宮頸癌的發(fā)生具有時(shí)序關(guān)系，不同亞型HPV在致病性方面均存在差異[2]，所以在臨床對(duì)宮頸癌的篩查中進(jìn)行HPV及其分型檢測(cè)是一項(xiàng)極其重要的檢查手段。HPV分型檢測(cè)對(duì)臨床CIN和宮頸癌篩查和評(píng)估、治療后的隨訪(fǎng)、病程進(jìn)展監(jiān)測(cè)及人群流行病學(xué)狀態(tài)和病毒疫苗的研制均具有重要意義。目前國(guó)內(nèi)臨床進(jìn)行HPV DNA檢測(cè)的主要方法為實(shí)時(shí)熒光PCR與雜交捕獲法[3]。本研究采用PCR-熒光法與PCR-膜雜交法同時(shí)檢測(cè)臨床標(biāo)本中的HPV并以細(xì)胞學(xué)診斷作為依據(jù)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析和評(píng)估，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年1月至2014年12月江蘇省常熟市第二人民醫(yī)院婦科門(mén)診患者204例作為研究對(duì)象，年齡20～60歲，平均(36.5±7.0)歲，均存在性生活史并自愿接受細(xì)胞學(xué)和HPV病毒學(xué)檢測(cè)。所有檢測(cè)標(biāo)本均為從受檢者宮頸口鱗、柱狀上皮交界處采集，使用一次性棉拭子。采樣前拭去宮頸口過(guò)多分泌物，將宮頸刷伸入宮頸外口，輕壓旋轉(zhuǎn)取得脫落細(xì)胞。迅速將宮頸刷浸入盛有1 mL無(wú)菌生理鹽水的樣本管中，充分漂洗，貼壁擠干后即刻送檢。細(xì)胞學(xué)檢查標(biāo)本采用專(zhuān)用脫落細(xì)胞采集器采集，即時(shí)送檢。

1.2 方法

1.2.1 PCR-熒光法 13 000 r/min離心5 min，取沉淀，采用港龍生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒提取標(biāo)本DNA，取2 μL待測(cè)DNA加入試劑盒提供的反應(yīng)管。管內(nèi)含有根據(jù)13種高危型HPV的L1基因靶序列設(shè)計(jì)一組高度特異的引物和探針，在同一PCR反應(yīng)中檢測(cè)宮頸脫落細(xì)胞中的13種高危型HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)DNA。反應(yīng)參數(shù)為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，40個(gè)循環(huán)(95 ℃ 15 s，52 ℃ 30 s，62 ℃ 1 min)。PCR-熒光法是在PCR過(guò)程中使用熒光PCR檢測(cè)儀同時(shí)記錄熒光標(biāo)記探針在分子雜交時(shí)每次PCR循環(huán)釋放出的熒光能量變化，直接反映出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化。采用美國(guó)ABI 7500自動(dòng)記錄熒光值變化并轉(zhuǎn)換成DNA模板量，用以判斷檢測(cè)結(jié)果。設(shè)立HPV陰性對(duì)照、臨界陽(yáng)性對(duì)照和強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照，以保證質(zhì)量受到控制。

1.2.2 PCR-膜雜交法 該法采用基因擴(kuò)增技術(shù)及導(dǎo)流雜交原理，通過(guò)反向點(diǎn)雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物與包被有型特異性探針膜雜交結(jié)果，再用堿性磷酸酶系統(tǒng)定性檢測(cè)，從而對(duì)21種HPV基因型(6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68和CP8304)進(jìn)行分型檢測(cè)分析。標(biāo)本采集與DNA提取與PCR-熒光法相同，采用凱普生物化學(xué)有限公司提供的分型檢測(cè)試劑盒，將PCR Mix、Taq酶和DNA模板按比例混勻。擴(kuò)增參數(shù)：95 ℃ 9 min，40個(gè)循環(huán)(95 ℃ 20 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)；72 ℃ 5 min。所有產(chǎn)物用于雜交過(guò)程，詳細(xì)步驟參照說(shuō)明書(shū)操作。在顯色過(guò)后檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性為清晰可見(jiàn)的藍(lán)紫色圓點(diǎn)。根據(jù)膜條HPV分型分布圖，判斷陽(yáng)性點(diǎn)為何種HPV類(lèi)型。全程設(shè)立陰、陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 細(xì)胞組織學(xué)檢查 根據(jù)2001年貝塞斯達(dá)分類(lèi)系統(tǒng)(TBS)將宮頸鱗狀上皮細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果分為未見(jiàn)上皮內(nèi)病變或惡性病變(NILM)、意義不明的非典型鱗狀上皮細(xì)胞增生(ASC-H)、鱗狀上皮細(xì)胞低度病變(LSIL)、鱗狀上皮細(xì)胞高度病變(HSIL)和宮頸鱗癌(SCC)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)和相關(guān)性分析比較兩種方法的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞組織學(xué)檢查結(jié)果 204例受檢者中NILM 152例(74.5%)，提示存在細(xì)胞異常52例(25.5%)，其中ASC-H 27例，LSIL 21例，HSIL 2例，SCC 2例。

2.2 HPV-DNA檢測(cè)結(jié)果 細(xì)胞異常組2種方法的HPV-DNA檢出率均很高，PCR法檢測(cè)HPV-DNA具有很高的靈敏度與特異性。PCR-熒光法檢測(cè)陰性137例，陽(yáng)性67例，陽(yáng)性率為32.8%；NILM組檢測(cè)陽(yáng)性19例，陽(yáng)性率為12.5%，細(xì)胞異常組檢測(cè)陽(yáng)性48例，陽(yáng)性率為92.3%。PCR-膜雜交法檢測(cè)陰性110例，陽(yáng)性94例，陽(yáng)性率為46.1%；NILM組檢測(cè)陽(yáng)性43例，陽(yáng)性率為28.3%；細(xì)胞異常組檢測(cè)陽(yáng)性51例，陽(yáng)性率為98.1%。細(xì)胞異常組患者2種方法檢測(cè)HPV陽(yáng)性率與NILM組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2種方法在細(xì)胞組織學(xué)分組中檢測(cè)陽(yáng)性情況比較[n(%)]

*：與NILM組比較，P<0.05。

2.3 2種方法檢測(cè)結(jié)果比較 PCR-熒光法和PCR-膜雜交法在NILM組檢測(cè)陽(yáng)性率分別為12.5%、28.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在細(xì)胞異常組檢測(cè)陽(yáng)性率分別為92.3%、98.1%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 2種方法檢測(cè)結(jié)果比較[n(%)]

3 討 論

從方法學(xué)來(lái)看，PCR-膜雜交法也是建立在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上的，增加膜雜交顯色過(guò)程，其檢測(cè)結(jié)果只能進(jìn)行定性分析，以檢測(cè)位點(diǎn)出現(xiàn)信號(hào)與否進(jìn)行判斷，信號(hào)點(diǎn)的強(qiáng)弱不能提供定量方面的參考。除PC位點(diǎn)外膜條上各檢測(cè)位點(diǎn)有信號(hào)，說(shuō)明感染了相應(yīng)的基因型，即使是混合型感染也能分辨[4]。但該法比PCR-熒光法多一步雜交顯色，操作步驟稍顯繁瑣，同時(shí)雜交顯色過(guò)程中增加了實(shí)驗(yàn)室PCR產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)。PCR-熒光法是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針，從擴(kuò)增到檢測(cè)完均在封閉反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行，從而避免了實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)物交叉污染的可能。PCR-熒光法可以實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程并且能提供準(zhǔn)確的半定量分析，結(jié)果可靠，非常適用于針對(duì)高危HPV亞型流行病學(xué)的篩查[5]。由于該法檢測(cè)宮頸HPV感染具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，且適用于多種樣本類(lèi)型，成本相對(duì)較低，在嚴(yán)格進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的情況下，該法不失為臨床HPV檢測(cè)的一種理想方法[6-8]。

本研究結(jié)果顯示，HPV感染在細(xì)胞組織學(xué)分類(lèi)檢測(cè)中呈現(xiàn)不同的陽(yáng)性比例，NILM組明顯低于細(xì)胞異常組。從表1可見(jiàn)，PCR-熒光法與PCR-膜雜交法檢測(cè)結(jié)果均證明這一點(diǎn)，建立在PCR基礎(chǔ)上的HPV-DNA檢測(cè)技術(shù)具備很高的靈敏度與特異性。2種方法在細(xì)胞異常組檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明HPV感染與宮頸病變具有直接相關(guān)性。但在NILM組中2種方法檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，主要原因在于PCR-熒光法檢測(cè)目標(biāo)群只局限于13種類(lèi)型的高危HPV，而PCR-膜雜交法可以檢測(cè)21種類(lèi)型的HPV亞型，不僅包括PCR-熒光法所含的13種高危型，還能檢測(cè)5種低危型(HPV6、11、42、43、44)及2種高危型(HPV66、CP8304)[7]。

PCR-膜雜交法可以對(duì)患者所感染的HPV進(jìn)行高危和低危分型，能通過(guò)一次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)獲得相對(duì)較多的檢驗(yàn)信息。PCR-膜雜交法可明確患者具體所感染的HPV類(lèi)型，對(duì)判斷多重感染和療效監(jiān)測(cè)有著較大的應(yīng)用價(jià)值。但也有研究表明，只有高危型HPV基因組能整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體內(nèi)，精確的分型檢測(cè)具有的臨床診療意義不大，其在學(xué)術(shù)研究、病毒感染與組織病變的機(jī)制關(guān)系及疫苗研發(fā)方面等具有更大的應(yīng)用價(jià)值[9]。PCR-熒光法與PCR-膜雜交法比較具有時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、交叉污染少、可以允許同一反應(yīng)墊板更多具備臨床意義的高危HPV類(lèi)型，可適用于大批量樣本的篩查[10]。同時(shí)PCR-熒光法還提供了半定量分析，檢測(cè)臨床標(biāo)本中的病毒DNA承載量，這對(duì)于預(yù)測(cè)宮頸病變的危險(xiǎn)程度具有一定應(yīng)用價(jià)值[11]。

總之，HPV的檢測(cè)方法學(xué)選擇應(yīng)根據(jù)患者自身病情的實(shí)際需求，選擇更適合于臨床診療需求的HPV檢測(cè)方法。一方面能更快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行檢測(cè)分析；另一方面能為臨床醫(yī)生提供更有價(jià)值的檢驗(yàn)信息。

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The comparative analysis on the detection of HPV-DNA by PCR- fluorescence and PCR-membrane hybridization

ZhaoYilin，CuiYinghong，HuangShaozhi

(ChangshuMedicalTestingCenter，Changshu，Jiangsu215500，China)

Objective To explore different application of PCR- fluorescence method and PCR- hybridization method in the diagnosis of human papilloma virus (HPV) infection.Methods Clinical samples were collected and detected by PCR- fluorescence method and PCR- hybridization method respectively.The cell histological diagnosis was used to compare the positive rate of HPV-DNA detection between the two methods，and the difference was analyzed by statistical method.The specimens were divided into no intraepithelial lesion or malignancy(NILM) group(152 cases),atypical squamous cell hyperplasia of unknown significance(ASC-H) group (27 cases),low-grade squamous intraepithelial lesion(LSIL) group(21 cases),high-grade squamous intraepithelial lesion(HSIL) group (2 cases) and squamous cell cervical carcinoma(SCC) group (2 cases).Results Among 204 cases of specimens，the results of PCR- fluorescence showed 67 cases were positive，137 cases were negative，the positive rate was 32.8%.The detection results of PCR- membrane hybridization showed 94 cases were positive，110 cases were negative，the positive rate was 46.1%.52 cases with abnormal cells were found by using cytological examination，the proportion is 25.5%.Within NILM group PCR- fluorescence method and PCR- membrane hybridization HPV positive rates were 12.5% and 28.3% respectively，the difference was statistically significant(P<0.05).Meanwhile the positive rate in the group of abnormal cells were 92.3% and 98.1%，the difference was not statistically significant(P>0.05).At the same time，the difference was statistically significant between the positive rate of abnormal HPV cell group and the NILM group(P<0.05).Conclusion HPV-DNA detected by PCR are specific and sensitive.During clinical diagnosis and treatment，PCR- fluorescence method has higher application value，while in the detection and research of low-risk HPV，PCR membrane hybridization has more advantages.The detection of HPV-DNA combined with cell histological diagnosis can improve the diagnostic accuracy of HPV viral infection.

papillomaviridae； polymerase chain reaction； fluorescence； membrane hybridization

趙一琳，女，主管檢驗(yàn)技師，主要從事分子生物學(xué)檢驗(yàn)的研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.02.025

A

1673-4130(2016)02-0205-03

2015-08-16)