張宇龍 張國栓 范曉燕 崔專義

?

·論著·

進展期胃癌Rb蛋白表達與E-cadherin及β-catenin在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞中再表達的關(guān)系及臨床意義

張宇龍 張國栓 范曉燕 崔專義

目的 探討進展期胃癌Rb蛋白表達與E-cadherin及β-catenin在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞再表達情況及與臨床病理因素的關(guān)系。方法 免疫組織化學(xué)染色方法檢測Rb在原發(fā)灶和E-cadherin及β-catenin在86例進展期胃癌原發(fā)灶及相應(yīng)淋巴結(jié)癌細胞表達情況。結(jié)果 胃癌原發(fā)灶中65.12%出現(xiàn)Rb陽性，46.51%轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)癌細胞中出現(xiàn)E-cadherin及β-catenin的再表達陽性，Rb與腫瘤的分化程度、病理類型密切相關(guān)(P<0.05)，E-cadherin及β-catenin在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)的再表達陽性與腫瘤的分化程度密切相關(guān)(P<0.05)，E-cadherin在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)的再表達與腫瘤的病理類型密切相關(guān)(P<0.05)，β-catenin在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)的再表達與腫瘤的病理類型無關(guān)(P>0.05)，Rb的表達與E-cadherin及β-catenin在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)癌細胞中的再表達情況、腫瘤的大小及浸潤程度無關(guān)(P>0.05)。E-cadherin與β-catenin在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)再表達存在相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，Rb在腫瘤原發(fā)灶表達與E-cadherin及β-catenin在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞再表達無相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。結(jié)論 Rb的表達與進展期胃癌的發(fā)展過程密切相關(guān)，E-cadherin及β-catenin在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞的再表達是進展期胃癌發(fā)生的重要事件，二者協(xié)同發(fā)揮作用，并對癌細胞在轉(zhuǎn)移灶中的聚集起重要作用，聯(lián)合評價其功能具有重要臨床意義。

Rb；E-cadherin及β-catenin；進展期胃癌；轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)；再表達；免疫組織化學(xué)；生存期

上皮鈣粘蛋白(E-cadherin)屬鈣依賴鈣粘著素家族成員，主要分布于非神經(jīng)細胞上皮組織，介導(dǎo)同種細胞-細胞間的黏附。E-cadherin功能須與配體-連接素(catenin)結(jié)合成復(fù)合體才能起作用，其表達異常與多種惡性腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[1]。 E-cadherin與β-catenin直接結(jié)合，α-、γ-catenin則介導(dǎo)E-cadherin/β-catenin與細胞骨架的肌動蛋白連接，其黏附功能降低是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因。視網(wǎng)膜母細胞基因(Rb基因)是重要腫瘤抑制基因，與細胞內(nèi)調(diào)控元件細胞蛋白及轉(zhuǎn)錄因子相互作用而調(diào)控細胞生長，同時Rb蛋白又受多因子在多層次上的調(diào)控，使其功能與細胞生長、分化相適應(yīng)[2]，在細胞周期發(fā)揮重要調(diào)控作用。本實驗采用SP免疫組化法，檢測Rb與E-cadherin、β-catenin 在進展期胃癌細胞及其相應(yīng)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細胞中的表達狀況，探討其與進展期胃癌臨床病理因素及其相互之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2009年6月至2012年6月于我院外科手術(shù)切除并經(jīng)病理證實的進展期胃癌標(biāo)本86例，男70例，年齡37～75歲；女16例，年齡42～72 歲，平均年齡59.2歲。其中71例獲隨訪。胃癌組織病理類型包括黏液腺癌21例、管狀腺癌57例、印戒細胞癌4例和腺磷癌2例、未分化癌1例，磷癌1例。其中高分化14例，中分化21例，低分化51例；侵及漿膜層78例，未侵及漿膜8例。入選病例均未進行化療或放療，無長期服用非甾體類抗炎藥物及皮質(zhì)激素藥物史。

1.2 試劑 兔抗人多克隆NF-κB、及β-catenin抗體購于NeoMarkers 公司，鼠抗人單克隆E-cadherin 抗體購于ZYMED 公司，SP法試劑盒購于北京中杉公司。

1.3 方法 標(biāo)本以10%甲醛固定,石蠟包埋，4 μm切片。采用免疫組化SP法，試劑盒使用依說明書，切片常規(guī)脫蠟，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，微波抗原修復(fù)，5%羊血清處理20 min后，滴加NF-κB一抗4℃一夜, 以DAB顯色，以蘇木素復(fù)染；PBS代替一抗為陰性對照，以切片上相對正常之黏膜組織為陽性對照。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 E-cadherin及β-catenin染色評級：二者只有明顯細胞膜染色被判定為正常染色；如染色不連續(xù)，或明顯減弱、缺失，或者出現(xiàn)細胞漿染色，則被評定為不正常染色。每張切片按所有癌細胞之中的正常染色的細胞的百分比評定為三級：1級0～50%；2級51%～80%；3級81%～100%[3]。

1.4.2 評級表達判定：原發(fā)灶如被評定為3級，則此病例則被認為是E-cadherin、β-catenin的正常表達，而1級與2級染色則被認為是E-cadherin、β-catenin的不正常表達；對于其轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，如染色評定為3級而原發(fā)灶為1級或2級，或轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)染色評定為2級而其原發(fā)灶染色為1級，則此病例則被評定為E-cadherin、β-catenin再表達陽性；否則評定為再表達陰性。

1.4.3 Rb蛋白顯色評分：Rb蛋白顯色陽性細胞百分比≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分；基本不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，將兩類積分相乘0～1分為陰性,≥2分為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件,計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，應(yīng)用Sperman秩相關(guān)法分析各指標(biāo)表達的相關(guān)性，繪制Kaplan-Meier曲線比較患者術(shù)后生存情況，以Wilcoxon’s log-rank test 對生存曲線行組間差別檢驗，用Cox’s proportional-hazard對影響生存率的因素進行多變量分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 E-cadherin及β-catenin在原發(fā)灶癌細胞的表達 86例進展期胃癌中，E-cadherin及β-catenin在原發(fā)灶癌細胞中絕大部分出現(xiàn)胞膜染色減弱或者缺失，部分甚至并出現(xiàn)胞漿染色。其不正常率分別為95.35%(82/86)與96.51(83/86)，僅1例在癌原發(fā)灶細胞中兩種蛋白表達均為正常。

2．2 E-cadherin及β-catenin在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞再表達及其與臨床病理因素的關(guān)系 E-cadherin及β-catenin于轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞中再表達率分別為39.53%、25.58%。86例病例中，共40例出現(xiàn)一種及一種以上蛋白陽性，26例出現(xiàn)一種連接蛋白陽性，另有14例出現(xiàn)兩種連接蛋白陽性。E-cadherin于高中分化癌之轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞的再表達率為57.14%，高于低分化癌之轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞的再表達率27.45%(P<0.05)；β-catenin在高中分化癌之轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞的再表達率為37.14%，高于低分化癌之轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞的再表達率17.65%(P<0.05)。E-cadherin再表達與腫瘤細胞病理分型(印戒細胞癌、未分化癌、磷癌及腺磷癌因樣本過小，故未予統(tǒng)計)密切相關(guān)(P<0.05)；β-catenin再表達與腫瘤細胞病理分型無關(guān)(P>0.05)。E-cadherin、β-catenin均與腫瘤大小及浸潤深度無關(guān)(P>0.05)。見表1。

2．3 Rb在原發(fā)灶癌細胞的表達 86例進展期胃癌組織中Rb陽性表達56例，陽性率達65.12%，陽性染色見于胞漿和胞核。Rb表達與進展期胃癌的的分化程度密切相關(guān)(P< 0.05)；與腫瘤細胞的病理分型(印戒細胞癌、未分化癌、鱗癌及腺鱗癌因樣本含量過小，故未予統(tǒng)計)、腫瘤大小及腫瘤浸潤深度無關(guān)(P>0.05)。見表2。

2．4 E-cadherin及β-catenin在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞再表達及與Rb表達的相關(guān)性 22例β-catenin轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞再表達陽性者中有14例E-cadherin再表達陽性，64例β-catenin轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞再表達陰性者中有44例E-cadherin再表達陰性，β-catenin、E-cadherin在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞再表達密切相關(guān)(P<0.05)。34例E-cadherin轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞再表達陽性者中30例Rb陽性表達，51例E-cadherin轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞再表達陰性者中有12例Rb陰性表達，E-cadherin轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞再表達與Rb的表達無關(guān)(P>0.05)。22例β-catenin轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞再表達陽性者中有18例Rb陽性表達，64例β-catenin轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞再表達陰性者中有12例Rb陰性表達，β-catenin轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞再表達與Rb的表達無關(guān)(P>0.05)。

表1 Rb的表達和E-cadherin與β-catenin的再表達與臨床病理因素的關(guān)系 例

表2 Rb表達與E-cadherin及β-catenin再表達與患者預(yù)后的關(guān)系

2.5 Rb的表達與E-cadherin及β-catenin在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞的再表達與患者預(yù)后的關(guān)系 86例患者中71例獲隨訪，由手術(shù)之日起至隨訪結(jié)束，平均生存時間36.2個月(7～68個月)。獲隨訪71例患者3年生存率僅30.9%。其中β-catenin再表達陽性者生存均數(shù)95%CI(19，30)，其中位生存時間23個月，再表達陰性者生存均數(shù)95%CI(34，47)，中位生存時間31個月，再表達陽性與陰性間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；E-cadherin再表達陽性者生存均數(shù)95%CI(24，35)，中位生存時間23個月，再表達陰性者生存均數(shù)95%CI(32，47)，中位生存時間28個月，再表達陽性與陰性間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；Rb蛋白表達陽性者生存均數(shù)95%CI(29，41)，中位生存時間25個月，表達陰性者生存均數(shù)95%CI(28，44)，中位生存時間30個月，表達陽性與陰性間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。生存曲線進行組間差別檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。多變量分析發(fā)現(xiàn)，β-catenin在胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞再表達可作為預(yù)后的一個獨立因素(P<0.05)。見表3、4,圖1～3。

圖1 E-cadherin再表達情況與預(yù)后關(guān)系生存曲線

圖2 β-catenin再表達情況與預(yù)后關(guān)系生存曲線

圖3 Rb表達情況與預(yù)后關(guān)系生存曲線

表3 組間兩兩比較

3 討論

E-cadherin、β-catenin與維持正常上皮組織結(jié)構(gòu)具有重要作用。對許多上皮源性惡性腫瘤細胞來說，某些原因作用下的E-cadherin、β-catenin功能障礙都可能會造成腫瘤細胞間的黏附功能破壞，癌細胞間黏附功能破壞進而癌細胞脫離原發(fā)灶導(dǎo)致轉(zhuǎn)移。Bukholm等[4]注意到乳腺癌患者轉(zhuǎn)移灶癌細胞中β-catenin再表達的情況。另外，β-catenin是wnt基因家族控制信號傳導(dǎo)通路重要成分，在表皮生長因子(EGF)、肝細胞生長因子(HGF)、c-erb-B2及src基因等誘導(dǎo)下，發(fā)生酪氨酸磷酸化，并迅速影響與之相連的E-cadherin或APC,改變細胞黏附復(fù)合物的活性，促進細胞運動及癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[5-7]。

表4 多變量分析

國內(nèi)外研究顯示，鈣粘蛋白-連接素復(fù)合物在胃癌的異常表達率為20%～90%[6-8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅在極少的病例中，腫瘤原發(fā)灶癌細胞E-cadherin、β-catenin正常表達，即其黏附功能正常，本研究與以往報道數(shù)據(jù)的差異可能由于本研究所取樣本均為進展期胃癌而不包括早期胃癌造成的。在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞，E-cadherin及β-catenin再表達陽性率為39.53%、25.58%。該遠高于原發(fā)灶癌細胞正常表達率的再表達陽性率，說明就如E-cadherin與β-catenin在原發(fā)灶的不正常表達與癌細胞自原發(fā)灶脫落有關(guān)一樣，其在轉(zhuǎn)移灶內(nèi)的再表達陽性與癌細胞在轉(zhuǎn)移部位的再聚集和生長有關(guān)[9]。原發(fā)灶中該復(fù)合物的非正常表達與癌細胞的脫離和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞中較高再表達則造成癌細胞在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的聚集。E-cadherin與β-catenin在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞中的再表達呈正相關(guān)，說明E-cadherin與β-catenin可能偕同作用于原發(fā)灶癌細胞的脫落以及脫落癌細胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而且E-cadherin與β-catenin可能共同促進轉(zhuǎn)移癌細胞在淋巴結(jié)內(nèi)的聚集并形成轉(zhuǎn)移灶。本研究還表明，E-cadherin與β-catenin的再表達與患者預(yù)后呈正相關(guān)。

Rb基因是定位于染色體長臂(13q14)，主要通過抑制轉(zhuǎn)錄因子E2F阻止細胞周期，對細胞生長、分化起調(diào)控作用。Rb基因正常情況下對細胞分裂起重要抑制作用，這種抑制作用減弱導(dǎo)致細胞可能發(fā)生異常增殖，最終發(fā)生癌變。Rb基因?qū)毎鲋撤只恼{(diào)控與多個因子如cyclins、CDKs、TGF-β2參與相關(guān)。p16-cyclinD1-pRb和p53-p21-pRb通路是細胞周期中G1-S期轉(zhuǎn)變的兩條獨立分子信息傳導(dǎo)途徑，Rb蛋白在細胞周期調(diào)節(jié)中起著重要作用。Rb蛋白功能與磷酸化狀態(tài)密切相關(guān)。一方面，磷酸化Rb蛋白與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合，細胞增殖停滯于G1期，有助于細胞DNA的損傷修復(fù)；另一方面，磷酸化Rb蛋白抑制細胞由G0-G1期轉(zhuǎn)化所必須的c-myc與c-fos癌基因表達。當(dāng)由于某些原因致Rb蛋白磷酸化水平升高，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子E2F激活并釋放，DNA復(fù)制，細胞過度增殖，細胞于G1期未充分發(fā)育便進入S期，有可能導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生[10-12]。

He[13]發(fā)現(xiàn)C-mgc基因是β-Cat-Tcf/lef復(fù)合物的靶基因。此外，細胞周期素(cyclinD1，CD1)是作用于G1期的細胞周期相關(guān)蛋白，促進細胞由G1/G0期進入S期?？梢奟b與β-catenin在腫瘤原發(fā)灶的發(fā)生、發(fā)展中存在一定的相關(guān)性。Rb作為一種重要的抑癌基因，本應(yīng)在原發(fā)灶腫瘤細胞中呈低表達，但本研究發(fā)現(xiàn)，Rb蛋白在原發(fā)灶腫瘤細胞中為65.12%的高陽性率，從理論上講，Rb的表達抑制細胞的增殖，不利于腫瘤的演進。不是所有的Rb基因突變均可測到Rb蛋白的缺失，相反，可能導(dǎo)致一種無功能的Rb蛋白，即突變型的Rb蛋白表達。而有學(xué)者證實野生型Rb蛋白有抑制細胞增殖的功能，突變型的Rb蛋白則失去抑制作用[14]。本研究也表明，Rb蛋白的表達與β-catenin在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞再表達有相關(guān)性，二者很可能有共同的作用基因，不僅在原發(fā)灶癌細胞中發(fā)生作用時有一定相關(guān)性，并且可能與β-catenin在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞再表達也有一定關(guān)系，但具體機制不清。本研究與既往研究一致表明，Rb基因與患者的預(yù)后密切相關(guān)。

綜上所述，E-cadherin與β-catenin功能異常很可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)，可能與其他因素協(xié)同作用促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。在進展期胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞存在E-cadherin與β-catenin的再表達情況與患者預(yù)后密切相關(guān)。Rb在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，與β-catenin在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌細胞再表達有關(guān)，并且與患者預(yù)后密切相關(guān)。

1 Tamura S.The E-cadherin,edeated cell-cell adhesion system in human cancers.Br J Surg,1997,84:899-900.

2 Weiberg RA. The retinoblastoma and cell cycle control.Cell,1995,81:323-327.

3 Andrews NA, Jones AS, Heliwell TR, et al. Exression of the E-cadherin-catenin cell adherin complex in primary squamous cell carcinoma of the head and neck and their nodal metastases. Br J Cancer, 1997, 75:1474-1480.

4 Bukholm IK, Nesland JM, Borresen Dale Al.Re-expression of E-cadherin,α-andβ-catenin, but not of γ-catenin, in metastatic tissue from breast cancer patients.J Pathol,2000,190:15-19.

5 Shibamoto S, Haya Kawa M, Takeuchi K, et al.T yrosine phosphorylation of β-catenin and plakoglobin enhanced by heprocyte growth factor and epidermal growth factor in human carcinoma cells.Cell Adhesion and Communication,1994,1:295.

6 Ochiai A, Aakimoto S, Kana Y, et al.C-erbB-2 gene product associates with catenins in human cancer cells.Biochem Biophys Res Commun,1994,205:73.

7 Papkoff J. Regulation of complexed and free catenin pools by distinct mechanisms: Differential effects of Wnt-1 and src. J Biolchem,1997,272:4536.

8 戴冬秋, 陳峻青, 徐惠綿, 等. E-鈣黏附素及α-鏈接素的表達與胃癌生物學(xué)行為及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移規(guī)律的關(guān)系. 中華腫瘤雜志,2001,23:35-38.

9 劉津，池口正英，閻慶輝，等. 鈣黏蛋白鏈蛋白復(fù)合體在進展期胃癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的再表達及其臨床意義. 中華實驗外科雜志,2004,21:535-537.

10 Peter M, Herskowitz I. Joining the complex: cyclin-depedent kinase inhibitory proteins and the cell cycle.Cell,1994,79:181.

11 Kamb A, Gruis NA, Weaver-Feldhaus J, et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science,1994,264:436-440.

12 Gunther T, Schheider-Stock R, Pross M, et al.Alterations of the Rb/MTS1- tumor suppressor gene in human cancer.Pathol Res Pract,1998,194:809-813.

13 He TC. Identifition of c-myc as a target of the APC pathway.Science,1998,281:1509.

14 Robbims PO, Horonitz JM, Mmalligan RC,et al.Negative regulation of human C-fos expression by retinoblastomas gene product.Nature,1990,346:668.

Expression and clinical significance of Rb protein, E-cadherin and β-catenin in metastatic lymph nodes from advanced gastric carcinoma

ZHANGYulong,ZHANGGuoshuan,FANXiaoyan,etal.DepartmentofSurgery,TheFirstHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China

Objective To investigate the expression and clinical significance of Rb protein as well as the re-expression of E-cadherin and β-catenin in cancerous cells of metastatic lymph nodes from advanced gastric carcinoma.Methods The expression levels of Rb protein in primary focus, and expression levels of E-cadherin and β-catenin were detected by immunohistochemistry in primary focus of 86 cases of advanced gastric carcinoma and the corresponding metastatic lymph nodes. Results In primary focus of gastric cancer, the positive rate of Rb protein was 65.12%, and the positive rate of re-expression of E-cadherin and β-catenin was 46.51% in cancerous cells of metastatic lymph nodes from advanced gastric carcinoma,moreover, the expressions of Rb were closely correlated to the differentiation degree and pathological types of tumor (P<0.05). The re-expression levels of E-cadherin and β-catenin in metastatic lymph nodes were closely related with the differentiation degree of tumor (P<0.05). The re-expression levels of E-cadherin in metastatic lymph nodes were closely correlated to the pathological types of tumor (P<0.05), however, the re-expression levels of β-catenin were not correlated to the pathological types of tumor (P>0.05).The re-expression levels of Rb protein were not correlated to those of E-cadherin and β-catenin in cancerous cells of metastatic lymph nodes,and to tumor’s size and infiltration degree (P>0.05). The re-expression of E-cadherin was closely correlated to that of β-catenin in metastatic lymph nodes (P<0.05),however, the expression levels of Rb protein in primary focus of tumor were not related with those of E-cadherin or β-catenin in metastatic lymph nodes (P>0.05). Conclusion The expression of Rb protein is closely correlated to the pathogenesis and development of advanced gastric carcinoma. The re-expressions of E-cadherin and β-catenin in cancerous cells of metastatic lymph nodes from advanced gastric carcinoma play an important role in the pathogenesis of advanced gastric carcinoma,with a synergism effect,thus, combination detection of E-cadherin with β-catenin has important clinical significance in evaluating their effects in tumor metastasis.

Rb; E-cadherin;β-catenin; advanced gastric carcinoma; metastatic lymph nodes; re-expression; immunohistochemically; survival time

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.22.003

050011 河北省石家莊市第一醫(yī)院外三科

張國栓，050011 河北省石家莊市第一醫(yī)院外三科；

E-mail：zgs4898@163.com

R 735.2

A

1002-7386(2016)22-3373-05

2016-02-11)