李茜 張國(guó)棟 劉毅, 薛麗佳 林輝

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科， 四川 瀘州 646000；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院內(nèi)科， 湖南 長(zhǎng)沙 410083；

?

·論著·

IL-17和IRF4在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)及臨床意義*

李茜1張國(guó)棟2劉毅1,3薛麗佳3林輝3

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科， 四川 瀘州 646000；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院內(nèi)科， 湖南 長(zhǎng)沙 410083；

3. 四川大學(xué)華西醫(yī)院風(fēng)濕免疫科， 四川 成都 610041)

目的 研究類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者外周血單核細(xì)胞(PBMC)中白介素17(IL-17)、干擾素調(diào)節(jié)因子4(IRF4)的表達(dá)并探討其臨床意義。方法 收集四川大學(xué)華西醫(yī)院門診及住院RA患者30例(RA組)，根據(jù)疾病活動(dòng)性評(píng)分(DAS28)分為病情活動(dòng)組16例，病情穩(wěn)定組14例，另選取健康自愿者20例(健康對(duì)照組)。分離外周血得到單核細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL-17水平，熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)IL-17 mRNA、IRF4 mRNA表達(dá)水平。同時(shí)將健康對(duì)照組PBMC給予Th17細(xì)胞極化條件(CD3/CD28聯(lián)合IL-6、IL-23、TGF-β，Th17細(xì)胞特異刺激組))及對(duì)照處理(CD3/CD28，對(duì)照組)培養(yǎng)72 h后用RT-PCR檢測(cè)IL-17 mRNA、IRF4 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 RA病情活動(dòng)組IL-17水平及IL-17 mRNA和IRF4 mRNA水平高于病情穩(wěn)定組(P<0.01)。病情穩(wěn)定組IL-17水平及IL-17 mRNA和IRF4 mRNA表達(dá)水平也高于健康對(duì)照組(P<0.05)。健康對(duì)照組PBMC在Th17細(xì)胞極化條件處理培養(yǎng)72 h后Th17細(xì)胞特異刺激組組IL-17 mRNA、IRF4 mRNA水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 RA患者中IL-17 mRNA與IRF4 mRNA表達(dá)水平升高，IRF4可能參與Th17細(xì)胞增加通過(guò)上調(diào)IL-17水平參與疾病發(fā)生，這可能成為RA治療的新靶點(diǎn)。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎； 白細(xì)胞介素17； 干擾素調(diào)節(jié)因子4

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis， RA)是一種累及多關(guān)節(jié)的慢性侵蝕性滑膜炎，其中以T細(xì)胞浸潤(rùn)滑膜，釋放大量細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致軟骨和骨質(zhì)破壞為其主要特點(diǎn)[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)， IL-23參與了實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)病環(huán)節(jié)[2]，并且IL-23能夠誘導(dǎo)一種IL-17+T細(xì)胞產(chǎn)生，正是這種產(chǎn)生IL-17+T的T細(xì)胞后來(lái)被命名為Th17細(xì)胞，其證實(shí)參與了RA的發(fā)病[2]。干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor，IRF)是一組能誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)干擾素及其信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)干擾素調(diào)節(jié)因子4(IRF4)是T細(xì)胞、B細(xì)胞和漿細(xì)胞分化成熟的必要調(diào)節(jié)因子[3]。IRF4作為Th17細(xì)胞非特異性的轉(zhuǎn)錄因子，可與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控Th17細(xì)胞分化，參與多種自身免疫性疾病[4]。本研究通過(guò)檢測(cè)RA患者外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)中IL-17蛋白水平，IL-17 mRNA和IRF4 mRNA表達(dá)水平，以及正常人PBMC在Th17細(xì)胞極化條件下 IL-17 mRNA，IRF4 mRNA表達(dá)水平，探索IRF4調(diào)控RA Th17細(xì)胞分化機(jī)制，為RA治療提供新的潛在靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年10月至2016年2月在華西醫(yī)院門診和住院部的RA患者30例，其中女性22例，男性8例，平均年齡(45.60±11.28)歲，均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1987年修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)。按照疾病活動(dòng)性評(píng)分(DAS28)將疾病活動(dòng)性分為四級(jí)：緩解(<2.6)，輕度活動(dòng)(2.6～3.2)，中度活動(dòng)(3.2～5.1)和重度活動(dòng)(>5.1)，并將DAS28評(píng)分為2.6～5.1的患者作為活動(dòng)組(16例)，治療后病情穩(wěn)定組(14例)。另選取性別和年齡匹配的健康志愿者20例為健康對(duì)照組，平均年齡(41.32±12.17)歲。

1.2 試劑與儀器 人淋巴細(xì)胞分離液Ficoll(天津?yàn)笊镏苿┕?，PRMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclo公司)，胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)。佛波酯、離子霉素、莫能霉素(Sigma公司)，固定破膜試劑盒(美國(guó)eBioscience公司)，CD3/CD28單抗混合劑(美國(guó)Gibco公司)，重組IL-6、IL-23、TGF-β(美國(guó)Gibco公司)，Hank’s平衡鹽溶液(美國(guó)Gibco公司)，Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)，RT-PCR試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)，IRF4、IL-17、β-actin引物由上海英峻生物技術(shù)有限公司合成，BV510標(biāo)記的CD4及同型對(duì)照(美國(guó)BD公司)，PE-Cy7標(biāo)記的IL-17及同型對(duì)照(美國(guó)eBioscience公司)。FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀CFX-96(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PBMC中IL-17蛋白水平 收集RA組和健康對(duì)照組肝素抗凝血采用Ficoll法分離得到單核細(xì)胞。加入佛波酯(50 ng/mL)、離子霉素(500 ng/mL)及阻斷劑莫能霉素，37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。然后取出細(xì)胞懸液，用1 ml冷PBS洗滌1次，留下200 μL細(xì)胞懸液，加入BV510標(biāo)記的抗人CD4抗體，孵育30 min，洗滌1次。留下100 μL細(xì)胞懸液，加入100 μL固定劑A反應(yīng)20 min， 再加入透膜劑B 2 ml，洗滌2次后加入PE-Cy7標(biāo)記的抗人IL-17抗體，反應(yīng)30 min后洗滌1次，以250 μL預(yù)冷PBS重懸，用流式細(xì)胞儀測(cè)定，結(jié)果用Cellquest軟件分析。上述抗體反應(yīng)均設(shè)置同型對(duì)照管。

1.3.2 熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)PBMC IL-17 mRNA和IRF4 mRNA表達(dá)水平 收集RA患者組及健康對(duì)照組PBMC后采用Trizol法提取RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，采用SYBR GreenI嵌合熒光法進(jìn)行定量PCR，按試劑盒說(shuō)明建立PCR反應(yīng)體系(總體積20 μL)。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。 PCR循環(huán)條件：95 ℃ 5 s → 各基因退火溫度(IRF4為61.2 ℃，IL-17為61.1 ℃，β-actin為57.0 ℃)10 s，40循環(huán)。用內(nèi)參基因β-actin標(biāo)準(zhǔn)化得到-ΔCT值，采用2-ΔΔCT計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 β-肌動(dòng)蛋白，IL-17和I RF4的引物序列

1.3.3 RT-PCR檢測(cè)Th17細(xì)胞極化條件處理后健康對(duì)照組PBMC IL-17 mRNA和IRF4 mRNA表達(dá)水平 收集健康對(duì)照組的PBMC后，按1×106個(gè)細(xì)胞比例接種于6孔板中，Th17細(xì)胞特異刺激組為CD3/CD28+IL-6+IL-23+TGF-β處理，對(duì)照組為CD3/CD28處理，將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，用RT-PCR檢測(cè)IL-17 mRNA和IRF4 mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組PBMC中 IL-17蛋白水平的比較 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) RA組和健康對(duì)照組PBMC IL-17蛋白水平見(jiàn)圖1。其中病情活動(dòng)組IL-17蛋白水平(1.34±0.35)顯著高于病情穩(wěn)定組(0.64±0.22，P<0.01)，而病情穩(wěn)定組也高于健康對(duì)照組(0.45±0.13，P<0.05)。

圖1 兩組PBMC細(xì)胞中IL-17蛋白水平

Figure 1 The levels of IL- 17 in PBMC of RA

2.2 兩組PBMC 中IL-17 mRNA和IRF4 mRNA表達(dá)水平比較 RT-PCR檢測(cè)兩組PBMC IL-17 mRNA，IRF4 mRNA表達(dá)水平結(jié)果顯示，RA病情活動(dòng)組高于RA病情穩(wěn)定組和健康對(duì)照組(P<0.05)，并且RA病情穩(wěn)定組同樣高于健康對(duì)照組(P<0.05)。

表2 兩組PBMC中IL-17 mRNA和IRF4 mRNA表達(dá)水平

注：與穩(wěn)定組相比，①P<0.01；與對(duì)照組相比，②P<0.05，③P<0.05。

2.3 PBMC在Th17細(xì)胞極化處理后IL-17 mRNA和IRF4 mRNA表達(dá)水平比較 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Th17細(xì)胞特異刺激組IL-17 mRNA，IRF4 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)。

Table 3 The expression of IL-17mRNA and IRF4 mRNA in different stimulation

組別IL-17mRNAIRF4mRNATh17細(xì)胞特異刺激組1.50±0.37①1.34±0.45②對(duì)照組1.04±0.290.92±0.38

注：與對(duì)照組相比，①P<0.05，②P<0.05。

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種以滑膜增生及關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)侵蝕性破壞為特征的自身免疫性疾病。Th17細(xì)胞是一種新型輔助性T細(xì)胞，主要以分泌IL-17為特征。研究發(fā)現(xiàn)，RA患者外周血中IL-17水平、關(guān)節(jié)液中IL-17水平明顯升高，其中關(guān)節(jié)液中更高[5]。關(guān)節(jié)液中的IL-17與IL-17受體結(jié)合，通過(guò)MAP激酶途徑和NF-κB途徑發(fā)揮其生物學(xué)作用。IL-17可上調(diào)滑膜成纖維細(xì)胞及軟骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞祖細(xì)胞向成熟破骨細(xì)胞分化，促進(jìn)軟骨蛋白多糖及膠原降解，加重骨質(zhì)及軟骨破壞[6]。IRF4作為Th17細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，雖不如RORγt特異性強(qiáng)，但近年在多發(fā)性硬化小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)干擾IRF4的表達(dá)可以明顯降低Th17細(xì)胞分化以及IL-17產(chǎn)生，從而降低疾病炎癥及臨床評(píng)分[7]。因此探討RA患者IL-17蛋白水平，IL-17 mRNA、IRF4 mRNA表達(dá)水平以及健康對(duì)照組的PBMC在Th17細(xì)胞極化條件下IL-17 mRNA、IRF4 mRNA表達(dá)水平變化，對(duì)了解RA中Th17細(xì)胞調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

在本研究中，活動(dòng)期RA患者中IL-17蛋白水平及IL-17 mRNA、IRF4 mRNA表達(dá)水平明顯高于RA病情穩(wěn)定組及健康對(duì)照組，且病情穩(wěn)定組上述指標(biāo)也高于健康對(duì)照組。但RA是如何產(chǎn)生大量Th17細(xì)胞具體機(jī)制尚不清楚，既往大多數(shù)的研究集中在Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt[8]，而近年發(fā)現(xiàn)IRF4對(duì)Th17細(xì)胞分化也是必不可少的，雖然具體調(diào)節(jié)機(jī)制不清，但一些研究發(fā)現(xiàn)可能通過(guò)以下機(jī)制調(diào)控Th17細(xì)胞分化：①IRF4通過(guò)IL-1信號(hào)通路激活而大量表達(dá)，調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞分化。Chung等[9]研究顯示，在Th17細(xì)胞分化早期， IL-1受體mRNA 表達(dá)水平明顯增高，IL-1通過(guò)與IL-6的協(xié)同作用促進(jìn)IRF4及RORγt產(chǎn)生，其中IRF4增加更明顯，從而促進(jìn)早期Th17細(xì)胞分化。②Mudter等[10]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)IRF4可與STAT3共同誘導(dǎo)RORγt表達(dá)，增強(qiáng)RORγt誘導(dǎo)Th17細(xì)胞產(chǎn)生的能力，從而間接調(diào)控Th17細(xì)胞分化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)IRF4缺乏時(shí)，T細(xì)胞中RORγt表達(dá)降低，IL-17水平降低，即使上調(diào)RORγt也只能部分恢復(fù)Th17細(xì)胞的分化[11]。③此外還有研究報(bào)道在腸道黏膜中IRF4能通過(guò)CD103+CD11b+ DC細(xì)胞產(chǎn)生IL-6來(lái)促進(jìn)腸道Th17細(xì)胞分化，當(dāng)CD103+CD11b+ DC細(xì)胞缺乏IRF4時(shí)，不僅會(huì)影響樹(shù)突狀細(xì)胞分化同樣IL-17水平也同時(shí)降低[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)中在體外培養(yǎng)健康對(duì)照組PBMC中發(fā)現(xiàn)CD3/CD28聯(lián)合IL-6、IL-23、TGF-β刺激后IL-17 mRNA、IRF4 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高。既往研究也證實(shí)，CD3/CD28可協(xié)同促進(jìn)Th17細(xì)胞產(chǎn)生，IL-6和TGF-β是促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞所必需的[14-15]，IL-23對(duì)維持Th17細(xì)胞增殖也十分重要[16]。在Th17細(xì)胞極化條件下，不僅IL-17 mRNA水平升高，而IRF4 mRNA水平也增加，間接表明IRF4與Th17細(xì)胞增多有關(guān)，IRF4參與了Th17細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。這和Huber等[17]的研究結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)在體外Th17細(xì)胞極化條件下，IL-6可誘導(dǎo)IL-21產(chǎn)生，而IRF4通過(guò)IL-21促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，此外IL-21在IRF4維持Foxp3, RORα，RORγt平衡中起關(guān)鍵性作用。

4 結(jié)論

RA患者病情活動(dòng)組中存在高水平IL-17 mRNA、 IRF4 mRNA表達(dá)，并且體外培養(yǎng)健康對(duì)照組PBMC在Th17細(xì)胞特異性刺激下IL-17 mRNA、IRF4 mRNA的表達(dá)水平也明顯升高，這進(jìn)一步說(shuō)明IRF4作為Th17細(xì)胞的間接調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子參與了RA的發(fā)病機(jī)制。因此，通過(guò)深入研究IRF4對(duì)RA Th17細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，可能為RA Th17細(xì)胞的靶向治療提供新的靶點(diǎn)。

[1]Imboden JB. The immunopathogenesis of rheumatoid arthritis[J]. Annu Rev Pathol, 2009,4:417-434.

[2]Yousefi B, Jadidi-Niaragh F, Azizi G,etal. The role of leukotrienes iimmunopathogenesis of rheumatoid arthritis[J]. Mod Rheumatol, 2014,24(2):225-235.

[3]Xu WD, Pan HF, Ye DQ,etal. Targeting IRF4 in autoimmune diseases[J]. Autoimmun Rev, 2012,11(12):918-924.

[4]Biswas PS, Bhagat G, Pernis AB. IRF4 and its regulators: evolving insights into the pathogenesis of inflammatory arthritis[J]. Immunol Rev, 2010,233(1):79-96.

[5]林輝， 周燕莉，李箭，等. 關(guān)節(jié)液Th17細(xì)胞變化在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎免疫炎癥中的作用[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2013，44(6)：907-910.

[6]Lubberts E, Joosten LA, van de Loo FA,etal. Reduction of interleukin-17-induced inhibition of chondrocyte proteoglycan synthesis in intact murine articular cartilage by interleukin-4[J]. Arthritis Rheum, 2000,43(6):1300-1306.

[7]Yang C, He D, Yin C,etal. Inhibition of Interferon Regulatory Factor 4 Suppresses Th1 and Th17 Cell Differentiation and Ameliorates Experimental Autoimmune Encephalomyelitis[J]. Scand J Immunol, 2015,82(4):345-351.

[8]Yang J, Xu P, Han L,etal. Cutting edge: Ubiquitin-specific protease 4 promotes Th17 cell function under inflammation by deubiquitinating and stabilizing RORgammat[J]. J Immunol, 2015,194(9):4094-4097.

[9]Chung Y, Chang SH, Martinez GJ,etal. Critical regulation of early Th17 cell differentiation by interleukin-1 signaling[J]. Immunity, 2009,30(4):576-587.

[10] Mudter J, Yu J, Zufferey C,etal. IRF4 regulates IL-17A promoter activity and controls RORgammat-dependent Th17 colitis in vivo[J].Inflamm Bowel Dis,2011, 17(6): 1343-1358.

[11] Brustle A, Heink S, Huber M,etal. The development of inflammatory T(H)-17 cells requires interferon-regulatory factor 4[J]. Nat Immunol, 2007,8(9):958-966.

[12] Persson EK, Uronen-Hansson H, Semmrich M,etal. IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation[J]. Immunity, 2013,38(5):958-969.

[13] Schlitzer A, McGovern N, Teo P,etal. IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses[J]. Immunity, 2013,38(5):970-983.

[14] Bettelli E, Carrier Y, Gao W,etal. Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells[J]. Nature, 2006,441(7090):235-238.

[15] Veldhoen M, Hocking RJ, Atkins CJ,etal. TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells[J]. Immunity, 2006,24(2):179-189.

[16] Hirota K, Martin B, Veldhoen M. Development, regulation and functional capacities of Th17 cells[J]. Semin Immunopathol, 2010,32(1):3-16.

[17] Huber M, Brustle A, Reinhard K,etal. IRF4 is essential for IL-21-mediated induction, amplification, and stabilization of the Th17 phenotype[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008,105(52):20846-20851.

Expression and significance of IL-17 and IRF4 in patients with rheumatoid arthritis

LI Xi1, ZHANG Guodong2, LIU Yi3, et al

(1.DepartmentofRheumatologyandImmunology，SouthwestMedicalUniversity，Luzhou646000,Sichuan,China;2.DepartmentofInternalMedicine,XiangyaHospital,CentralSouthUniversity，Changsha410083,China;3.DepartmentofRheumatologyandImmunology，WestChinaHospital，SichuanUniversity，Chengdu610041,China)

Objective To investigate the expression and clinical significance of IL-17 and IRF4 in patients with rheumatoid arthritis (RA). Methods 30 RA patients were divided into active RA patients (16 cases) and stable RA patients (14 cases). 20 healthy people were taken as the healthy controls (HC). The peripheral blood monocyte cells (PBMC) from HC and RA patients were collected. The levels of IL- 17 were measured by flow cytometry. The expression levels of IL- 17mRNA and IRF4 mRNA in HC and RA patients were measured by real-time PCR (RT- PCR). The PBMC from HC were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 monoclonal antibodies in the absence or presence of IL-6、IL-23 and TGF-β. After co-culture, the levels of IL-17mRNA and IRF4mRNA were analyzed by RT- PCR. Results The levels of IL-17, IL-17mRNA and IRF4 mRNA of RA stable patients were significantly higher than that of active RA patients(P<0.01)．The levels of IL-17, IL-17mRNA and IRF4 mRNA in RA stable patients were higher than that of HC (P<0.05). Under A-CD3/A-CD28+IL-6+IL-23+TGFβ stimulated PBMC the expression of IL- 17mRNA, IRF4 mRNA were all higher than that of controls (A-CD3/ A-CD28) (P<0.05).Conclusion IL- 17mRNA and IRF4 mRNA in RA patients are highly expressed. IRF4 may play an important role in the development of RA. IRF4 may regulate the differentiation of Th17 cells, which makes IRF4 to be potential target for RA therapy.

Rheumatoid arthritis; IL-17; Interferon regulatory factor 4

國(guó)家自然科學(xué)基金(81102274)；四川省科技廳國(guó)際合作項(xiàng)目(2014HH0027)；成都市科技攻關(guān)項(xiàng)目(10GGYB644SF-023)

劉毅，教授，博士生導(dǎo)師，本刊常務(wù)編委，E-mail：yi2006liu@163.com

R 593.22

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.11.007

2016-07-01；

2016-08-13； 編輯： 張文秀)