金曉琳，金浩龍，侯 瑞，熊 坤，陳志瑾△

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室，重慶400038；2.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院感控科，重慶400037；3.第三軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室，重慶400038）

·臨床研究·

碘液在芽孢染色中的應(yīng)用研究*

金曉琳1，金浩龍2，侯 瑞3，熊 坤1，陳志瑾1△

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室，重慶400038；2.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院感控科，重慶400037；3.第三軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室，重慶400038）

目的 探尋一種滿意的芽孢染色方法，同時(shí)該方法能克服染料加溫后揮發(fā)給實(shí)驗(yàn)操作人員帶來(lái)的身體傷害。方法 以碘液為媒染劑，用冷染方法替代傳統(tǒng)芽孢加溫染色，然后進(jìn)行細(xì)菌涂片、干燥、固定、染色。初染液為石炭酸復(fù)紅5 min，碘液媒染1 min，95%乙醇脫色5 s，堿性美蘭復(fù)染1 min。比較石炭酸復(fù)紅染色后加碘液、石炭酸復(fù)紅染色不加碘液、石炭酸復(fù)紅加溫染色不加碘液的染色效果。結(jié)果 石炭酸復(fù)紅染色后加碘液與石炭酸復(fù)紅加溫染色不加碘液的染色效果相同，石炭酸復(fù)紅染色不加碘液也能看出芽孢，但不明顯。結(jié)論 用碘液助染可獲得滿意的芽孢染色結(jié)果，且用該法可減少石炭酸揮發(fā)給實(shí)驗(yàn)操作人員帶來(lái)的危害。

碘； 染色與標(biāo)記； 芽孢桿菌屬/化學(xué)； 苯酚

經(jīng)典的芽孢染色法為Schaeffer-Fulton方法（微生物學(xué)家Alice B.Schaeffer和Macdonald Fulton在20世紀(jì)30年代建立）和Wirtz-Conklin方法（Robert Wirtz和Marie E.Conklin是20世紀(jì)早期的細(xì)菌學(xué)家），即采用石碳酸（苯酚）復(fù)紅染液或孔雀綠進(jìn)行芽孢染色，在加溫條件下染5 min才能將芽孢染上顏色，然后水洗，用堿性美蘭、番紅或沙黃復(fù)染。這種加溫助染的方法稱為熱染法。但眾所周知，石碳酸是苯酚，具有明顯揮發(fā)性，在加溫條件下促進(jìn)了石碳酸的揮發(fā)，對(duì)人體皮膚、黏膜具有明顯刺激。人們?cè)谑褂檬妓峒訙卮偃緯r(shí)會(huì)感覺(jué)到眼睛和鼻部受到的刺激。再者含苯環(huán)的芳烴類物質(zhì)被認(rèn)為具有致癌性，孔雀綠也具有高毒素、高殘留、致癌、致畸、致突變等作用。本研究建立了一種應(yīng)用碘液助染，避免應(yīng)用加熱助染的芽孢冷染法，芽孢染色效果好，且避免了石碳酸加熱產(chǎn)生大量刺激性氣體對(duì)操作人員健康的損害。將這種染色法稱為芽孢冷染法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 采用枯草芽孢桿菌于牛肉蛋白棟培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)48 h的斜面培養(yǎng)物。

1.1.2 器材 干凈的玻璃載玻片、乙醇燈、顯微鏡、鏡油、蠟筆、接種環(huán)、10 μL加樣器、吸水紙、Nikon Eclipse Boi顯微鏡、照相軟件[Nls-Elements、BR3.2（Bulid710）、Nikon Ds-U2/L2 USB]等。

1.1.3 試劑 （1）0.9%氯化鈉溶液：0.900g氯化鈉加蒸餾水100 mL定溶。（2）革蘭碘液：碘片0.500 g，碘化鉀1.000g，蒸餾水150 mL定溶。（3）95%乙醇為分析純。（4）石炭酸復(fù)紅：①稱7.600 g堿性復(fù)紅（品紅）溶于200 mL 95%乙醇中，放置 2 d。②稱 90.000 g石炭酸（苯酚）溶于1 800 mL蒸餾水中配成石炭酸水溶液。將1份堿性復(fù)紅乙醇飽和液與9份5%石炭酸水溶液混合配成石炭酸復(fù)紅液。（5）美蘭液：300 mL 95%乙醇加5.328 g亞甲基藍(lán)即為飽和原液，于300 mL美蘭原液中加10 mL 1%氫氧化鉀再加1 000 mL蒸餾水即為堿性美蘭液。

1.2 方法 用蠟筆在15張玻璃載玻片邊緣編號(hào)，載玻片上分別滴加0.9%氯化鈉溶液5 μL，用接種環(huán)無(wú)菌操作轉(zhuǎn)移枯草桿菌到載玻片上，涂片，自然干燥，用乙醇燈外焰加熱固定。（1）石炭酸復(fù)紅染色后加碘液：1～5號(hào)玻片菌膜上加石炭酸復(fù)紅液染5 min，水洗，加碘液1 min，水洗，用95%乙醇脫色，從紅色至液體為無(wú)色，堿性美蘭液染1 min，水洗，吸水紙吸干玻片上多余的水分，鏡檢。（2）石炭酸復(fù)紅染色不加碘液：6～10號(hào)玻片菌膜上加石炭酸復(fù)紅液染5 min，水洗，用95%乙醇脫色，從紅色至液體為無(wú)色，堿性美蘭液染1 min，水洗，吸水紙吸干玻片上多余的水分，鏡檢。（3）石炭酸復(fù)紅加溫染色不加碘液：11～15號(hào)玻片菌膜上加石炭酸復(fù)紅液加溫染，微微冒熱氣，需不斷補(bǔ)充染液，否則載玻片會(huì)變干，染5 min，待玻片冷卻后方能水洗，否則載玻片會(huì)破碎或炸裂，用95%乙醇脫色，從紅色至液體為無(wú)色，堿性美蘭液染1 min，水洗，吸水紙吸干玻片上多余的水分，鏡檢。

2 結(jié) 果

2.1 石炭酸復(fù)紅染色后加碘液染色效果 1～5號(hào)玻片染色效果好，可見(jiàn)清晰芽孢，見(jiàn)圖1。

圖1 石炭酸復(fù)紅染色后加碘液染色效果

2.2 石炭酸復(fù)紅染色不加碘液染色效果 6～10號(hào)玻片染色效果不好，也能看出芽孢，但不明顯，見(jiàn)圖2。

2.3 石炭酸復(fù)紅加溫染色不加碘液染色效果 11～15號(hào)玻片芽孢清晰可見(jiàn)，見(jiàn)圖3。但因苯酚的揮發(fā)，環(huán)境受到污染。

圖2 石炭酸復(fù)紅染色不加碘液染色效果

圖3 石炭酸復(fù)紅加溫染色不加碘液染色效果

3 討 論

細(xì)菌芽孢是細(xì)菌處于不利生存環(huán)境下將胞質(zhì)脫水濃縮，包裹細(xì)胞核，在菌體內(nèi)形成的一個(gè)圓形或橢圓形小體，是細(xì)菌的休眠形式。在芽孢期間細(xì)菌并不繁殖，是細(xì)菌在不利條件下保存生命的特殊形式。當(dāng)條件適應(yīng)細(xì)菌繁殖時(shí)細(xì)菌芽孢又可出芽，長(zhǎng)成典型的生長(zhǎng)態(tài)細(xì)菌，即繁殖體形式。細(xì)菌能否形成芽孢是由細(xì)菌遺傳因素決定的，并非所有細(xì)菌均能形成芽孢，能形成芽孢的細(xì)菌多為革蘭陽(yáng)性菌，如炭疽芽孢桿菌、破傷風(fēng)梭菌等。

細(xì)菌芽孢形態(tài)可有差異，有的為圓形，有的為橢圓形，有的大于菌體直徑，有的小于菌體直徑，有的位于菌體中間位置，有的存在于菌體近末端甚至完全在末端，這些特征均是細(xì)菌種屬的特征性標(biāo)志，因此，芽孢染色在臨床具有診斷意義。如在鏡下見(jiàn)到菌體末端帶有芽孢的細(xì)菌極可能是破傷風(fēng)梭菌；如見(jiàn)到大于菌體、位于次極端的橢圓形芽孢則很可能是肉毒梭菌。因此，芽孢染色與鏡下觀察是臨床微生物學(xué)常用技術(shù)。此外，在微生物學(xué)教學(xué)中常涉及細(xì)菌芽孢染色與觀察。但由于芽孢壁很厚，染料不易進(jìn)入，故芽孢不易染色。

碘液因其低毒、黏稠度低、擴(kuò)散均勻、吸收快等優(yōu)點(diǎn)在臨床得到廣泛應(yīng)用。熟知的碘酊、聚維酮碘可消毒殺菌，給患者注射碘水可用于脊髓造影，口服2%碘液可進(jìn)行胰腺、十二指腸、空腸CT檢查，比淡水獲得更清楚的掃描圖像；為避免內(nèi)鏡引起小腸梗阻加重、穿孔改用碘水造影，診斷小腸梗阻即簡(jiǎn)便又安全[1]；殼聚糖碘液對(duì)真菌、紅色毛癬菌、絮狀表皮癬菌、石膏樣毛癬菌、白假絲酵母等均具有明顯的殺菌作用，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、乙型肝炎病毒也具有較好的滅活作用[2-5]。

碘液具有助染作用，這是不容置疑的。在經(jīng)典的革蘭染色中即應(yīng)用了碘液助染。碘液在革蘭染色中具有重要作用[6-7]。革蘭染色中碘液染色時(shí)間為1 min時(shí)正確率最高[8]。近年來(lái)，芽孢染色方法在不斷改進(jìn)，細(xì)菌特殊染色條件不斷優(yōu)化[9]，芽孢染色改用紙片加熱[10]、沸水浴加熱20 min[11-12]、微波加熱20 min[13-14]等。有研究用石炭酸復(fù)紅、堿性美蘭及孔雀綠、沙黃染液不同濃度、不同加溫時(shí)間對(duì)芽孢染色效果進(jìn)行了仔細(xì)觀察比較[15-16]。

不論在乙醇燈上加熱或改用沸水浴、微波爐加熱方法均沒(méi)有減少因操作中加熱帶來(lái)的染料揮發(fā)。對(duì)芽孢進(jìn)行冷染，目前報(bào)道的要么耗時(shí)長(zhǎng)，用石炭酸復(fù)紅染芽孢時(shí)采用了延時(shí)15 min，在堿性美蘭中加入了氫氧化鉀；要么濃度加大，即用10%孔雀綠染色，常規(guī)采用0.9%孔雀綠、加長(zhǎng)浸染時(shí)間10 min[17]。

本研究建立的冷染法借鑒了革蘭染色法中采用碘液助染替代了傳統(tǒng)染色中采用加溫助染，取得良好效果。在石碳酸復(fù)紅初染后染料滲透入芽孢，采用碘液助染后碘與滲透入芽孢的復(fù)紅燃料形成更大顆粒的復(fù)合物，故在隨后的脫色中不易被洗脫，因而能使芽孢獲得更好的染色。冷染實(shí)驗(yàn)中所使用的試劑與傳統(tǒng)方法完全一致，唯一不同的是在石炭酸復(fù)紅染色5 min后增加了1個(gè)步驟，即用碘液媒染1 min，碘液與革蘭染色采用的碘液完全一致，不需另配，方法簡(jiǎn)單易行，操作時(shí)間也與傳統(tǒng)方法基本一樣。因取消了加熱過(guò)程，極大減少了石炭酸或孔雀綠在加熱過(guò)程中產(chǎn)生的刺激性氣體，保證了實(shí)驗(yàn)操作人員的健康，且染色效果優(yōu)于傳統(tǒng)熱染法，本研究采用的芽孢冷染法是一種較好的細(xì)菌芽孢染色方法，值得在學(xué)生實(shí)驗(yàn)、臨床檢驗(yàn)科微生物室、感控科、消毒室推廣應(yīng)用。

[1] 江南芳，于紅剛，沈磊．雙氣囊內(nèi)鏡與系統(tǒng)碘水造影對(duì)小腸梗阻診斷價(jià)值的比較[J/CD]．中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2012，6（18）：188-190．

[2] 何淑雅，王芳宇．殼聚糖碘液的制備及抗真菌活性研究[J]．南華大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2001，29（4）：359-360．

[3] 王科兵，肖激文，王芳宇，等．殼聚糖碘液體外抗真菌活性研究[J]．解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2002，18（6）：372-373．

[4] 張啟鋒，伍甜，秦濤，等．殼聚糖碘液抗白色念珠菌活性的研究[J]．衡陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，31（6）：64-66．

[5] 王科兵，肖激文，王芳宇．殼聚糖碘液對(duì)乙型肝炎病毒血清指標(biāo)物滅活效果觀察[J]．中國(guó)消毒學(xué)雜志，2004，21（3）：244-245．

[6] 丁紅輝．革蘭染色二步法在陰道分泌物涂片中的臨床應(yīng)用[J]．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2009，24（10）：755-756．

[7] 葉元康．革蘭染色的現(xiàn)況和進(jìn)展[J]．中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2011，6（6）：424-425．

[8] 黃玉柳．大腸菌群革蘭染色技術(shù)條件探討[J]．微生物學(xué)雜志，2009，29（6）：94-96．

[9] 黃銀歡，鐘云．微生物實(shí)驗(yàn)中常用細(xì)菌染色方法的改良[J]．齊魯藥事，2010，29（11）：679-682．

[10]胡紅杰，王玉，施魯?shù)?，等．抗酸染色和芽胞染色的改良型濾紙覆蓋加熱法[J]．中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2009，4（1）：51-52．

[11]林君榮．幾種細(xì)菌染色方法的改良[J]．淮海醫(yī)藥，2007，25（3）：251．

[12]李殊．幾種細(xì)菌染色方法的改良[J]．甘肅醫(yī)藥，2008，27（2）：51-52．

[13]趙世鴻，夏世平，向麗，等．炭疽桿菌芽胞染色法的改進(jìn)[J]．中國(guó)誤診學(xué)雜志，2004，4（9）：1429-1430．

[14]楊冬華，楊君玲．動(dòng)態(tài)載片培養(yǎng)法批量制作永久細(xì)菌標(biāo)本片[J]．實(shí)驗(yàn)科學(xué)與技術(shù)，2012，10（4）：26-29．

[15]姚文琴，劉曉焱．兩種改良芽胞染色法染色效果觀察[J]．檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2008，5（7）：428-429．

[16]劉曉焱，姚文琴，徐曉青．細(xì)菌芽胞兩種染色法最佳實(shí)驗(yàn)條件觀察[J]．現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，35（24）：4862-4865．

[17]鄭冬超，樊佳，王雨昊，等．浸染法改良細(xì)菌芽胞染色實(shí)驗(yàn)的探索[J]．實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2015，32（7）：191-192．

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.22.021

B

1009-5519（2016）22-3477-02

2016-07-21）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31570173）。

△通訊作者，E-mail：zhijinchen888@163.com。