潘艷芳，賈曉濤，方 艷

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，陜西咸陽(yáng)712046；2.西安市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西710003）

·論 著·

Exendin4拮抗Aβ1-42所致大鼠識(shí)別記憶損傷的保護(hù)效應(yīng)研究*

潘艷芳1，賈曉濤2，方 艷1

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，陜西咸陽(yáng)712046；2.西安市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西710003）

目的 探討Exendin4拮抗淀粉樣β蛋白（amyloid β-protein，Aβ）引起大鼠識(shí)別記憶功能傷害的保護(hù)作用。方法 將80只健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（PBS組）、Aβ1-42組、不同劑量Exendin4組（0.02、0.20、2.00 nmol）、不同劑量Exendin4（0.02、0.20、2.00 nmol）聯(lián)合Aβ1-42組，每組10只。各組大鼠經(jīng)側(cè)腦室給藥后進(jìn)行新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)，曠場(chǎng)中間隔5 h分別放置2種物體，每次大鼠自由探索10 min。檢測(cè)指標(biāo)為新物體識(shí)別指數(shù)（NOI）=探索新物體時(shí)間/（探索新物體時(shí)間+探索舊物體時(shí)間）×100%。結(jié)果 Aβ1-42組大鼠NOI明顯低于對(duì)照組，0.20、2.00 nmol Exendin4聯(lián)合Aβ1-42組大鼠NOI明顯高于A(yíng)β1-42組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 Exendin4預(yù)處理能劑量依賴(lài)性對(duì)抗Aβ1-42引起的大鼠識(shí)別記憶損傷。

淀粉樣β蛋白； 大鼠； 記憶； 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)； Exendin4

淀粉樣β蛋白（amyloid β protein，Aβ）是阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）的病理變化基礎(chǔ)，Aβ只要形成聚集體就能表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)毒性[1-2]。然而，目前為止仍缺乏有效的治療AD的手段。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)，Exendin4能減緩神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，減輕相應(yīng)臨床癥狀[3-4]。然而，迄今為止，尚未見(jiàn)關(guān)于Exendin4對(duì)AD大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，特別是關(guān)于對(duì)空間識(shí)別記憶能力的影響。因此，本研究通過(guò)新物體辨別實(shí)驗(yàn)，比較不同劑量Exendin4處理組大鼠新物體識(shí)別指數(shù)（novel object index，NOI），探討Exendin4對(duì)Aβ1-42所致的空間工作能力損害的保護(hù)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料 Aβ1-42、Exendin4均購(gòu)自Sigma（St.Louis，MO，USA）。

1.2 方法

1.2.1 Aβ1-42配制及老化處理 將1 mg粉末狀A(yù)β1-42溶于1 mL HFIP中，間斷振蕩1 h后充分溶解。然后按每管100 μL分裝保存于-80℃冰箱。使用前每管Aβ1-42加二甲基亞砜6μL，充分混懸后加DPBS 34 μL，37℃孵育72 h。

1.2.2 Exendin4的處理 將粉末狀Exendin4溶于PBS中，分裝后保存于-20℃冰箱。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制備及分組 將成年雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（230~250 g）用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后固定于腦立體定位儀（68004，瑞沃德公司）。暴露顱骨，以前囟點(diǎn)為基準(zhǔn)，用骨鉆于擬插入給藥導(dǎo)管部位鉆孔，將自制不銹鋼給藥導(dǎo)管插入麻醉大鼠側(cè)腦室（前囟點(diǎn)后0.8mm、中線(xiàn)旁開(kāi)1.3mm），利用微量注射泵（KD Scientific，Inc，KDS 310 Plus，USA）和5 μL微量注射器行腦內(nèi)注射給藥。各組動(dòng)物注射藥物總體積為3 μL，給藥速度為0.5 μL/min，注射結(jié)束后留針5 min，藥物注射間隔15 min。將80只健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（PBS組）、Aβ1-42組、不同劑量Exendin4組（0.02、0.20、2.00 nmol）、不同劑量Exendin4（0.02、0.20、2.00 nmol）聯(lián)合Aβ1-42組，每組10只。

1.2.4 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn) 首先將2個(gè)形狀大小、顏色完全相同的物體置于曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)，2個(gè)物體間相距25 cm，分別距離曠場(chǎng)宮體壁15 cm，然后將大鼠由非物體區(qū)域的中點(diǎn)貼壁放入，讓其自由探索10 min后取出大鼠，將曠場(chǎng)中1個(gè)物體換為材質(zhì)相同、顏色和形狀不同的新物體，大鼠休息5 h后再?gòu)耐晃恢梅湃?，讓其自由探?0 min，由頂部的紅外攝像頭記錄大鼠探究物體時(shí)間，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由 Ethovision3.0軟件系統(tǒng)（Noldus InformationTechnology，Wageningen，荷蘭）采集，計(jì)算NOI[5]=探索新物體時(shí)間/（探索新物體時(shí)間+探索舊物體時(shí)間）× 100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用75%乙醇擦洗曠場(chǎng)以消除異味對(duì)下一只大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用two-way ANOVA。采用Sigmaplot10.0作圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Aβ1-42組、對(duì)照組大鼠NOI比較 Aβ1-42組大鼠NOI[（53.21±1.23）%]明顯低于對(duì)照組[（67.02±1.04）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 Aβ1-42組、對(duì)照組大鼠NOI比較

2.2 Aβ1-42組、不同劑量Exendin4聯(lián)合Aβ1-42組大鼠NOI比較 0.02、0.20、2.00 nmol Exendin4組大鼠NOI [分別為（69.01±0.97）、（69.36±1.21）、（70.25±1.03）]與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。0.02 nmol Exendin4聯(lián)合Aβ1-42組大鼠NOI[（53.62±1.06）%]與Aβ1-42組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但0.20、2.00 nmol Exendin4聯(lián)合Aβ1-42組大鼠NOI[分別為（57.21±2.01）、（63.01±1.32）%]明顯高于A(yíng)β1-42組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 Aβ1-42組、不同劑量Exendin4聯(lián)合Aβ1-42組大鼠NOI比較

3 討 論

寡聚體形式Aβ1-42是引起神經(jīng)細(xì)胞毒性和導(dǎo)致AD發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素[6]。因此，本研究應(yīng)用經(jīng)“老化”后的Aβ1-42進(jìn)行側(cè)腦室注射，結(jié)果顯示，Aβ1-42損害了大鼠識(shí)別記憶功能；Exendin4預(yù)處理可劑量依賴(lài)性改善Aβ1-42引起的識(shí)別記憶損傷；該結(jié)果與Jia等[3]發(fā)現(xiàn)的Exendin4有效拮抗Aβ1-42所致的空間學(xué)習(xí)記憶傷害是一致的。2種行為學(xué)檢測(cè)方法從不同角度考察了Exendin4對(duì)AD大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。

近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)，AD與2型糖尿?。╰ype 2 diabetesmellitus，T2DM）具有相關(guān)性[7]。所以，有學(xué)者提出，利用控制T2DM的手段拮抗Aβ的神經(jīng)毒性治療AD。已有研究表明，胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）可減輕Aβ1-42導(dǎo)致的海馬突觸可塑性損傷和空間學(xué)習(xí)記憶損傷[8-9]。GLP-1與腦內(nèi)GLP-1受體結(jié)合后可抵制興奮毒性和氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，甚至減輕 AD患者腦內(nèi)病理改變[10]。本研究應(yīng)用的Exendin4較 GLP-1半衰期長(zhǎng)且更易通過(guò)血腦屏障。Exendin4發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制較復(fù)雜。已有研究證實(shí)，Aβ能抑制PI3K通路引發(fā)大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力下降[9]；同時(shí)，Aβ可導(dǎo)致GSK3β過(guò)表達(dá)，從而使Aβ聚集、Tau蛋白磷酸化、細(xì)胞凋亡等[11-12]。而GLP-1受體激動(dòng)劑通過(guò)興奮GLP-1受體激活PI3K，從而活化PDK和Akt，抑制 GSK3β發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[13]。Exendin4能通過(guò)與GLP-1受體結(jié)合，激活腺苷酸環(huán)化酶催化腺苷三磷酸生成環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP），提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，觸發(fā)鈣離子內(nèi)流，增加神經(jīng)遞質(zhì)釋放，加快神經(jīng)興奮性傳導(dǎo)，從而增強(qiáng)學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知能力[4]。提示Exendin4對(duì)Aβ可能具有強(qiáng)大的中樞拮抗效應(yīng)。

盡管Aβ的神經(jīng)毒性和Exendin4神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制十分復(fù)雜，但Exendin4拮抗Aβ后的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)無(wú)論在細(xì)胞水平還是整體行為學(xué)表現(xiàn)上均是肯定的。提示Exendin4可能對(duì)AD，特別是伴T(mén)2DM的AD具有潛在的治療價(jià)值

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Study on protective effects of Exendin4 for antagonizing Aβ1-42-induced recognition memory impairment in rats*

Pan Yanfang1，Jia Xiaotao2，F(xiàn)ang Yan1
（1.Teaching and Researching Section of Pathology，School of Basic Medical Science，Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang，Shaanxi 712046，China；2.Department of Neurology，Xian Municipal Central Hospital，Xian，Shaanxi 710003，China）

Objective To investigated the protective action of Exendin4 for antagonizing recognition memory impairment induced by amyloid β-protein-42（Aβ1-42）in rats.Methods Eighty healthy adult male Wistar rats were randomly divided into the control group（PBS），Aβ1-42，group，different concentrations of Exendin4（0.02，0.20，2.00 nmol）groups and different concentrations of Exendin4（0.02，0.20，2.00 nmol）combined Aβ1-42 group，10 cases in each group.The rats in all groups were performed the new object recognition experiment after lateral cerebral ventricular medication injection.Two kinds of object were respectively placed in the open-field for interval of 5 h.The each time free exploration in rat lasted for 10 min.The detection index was the novel object recognition index（NOI）=exploring novel object time/（exploring novel objects time+exploring familiar objects time）×100%.Results The NOI percentage in the Aβ1-42 group was significantly lower than that in the control group（P<0.01）and the NOI percentage in the 0.20，2.00 nmol Exendin4 combined Aβ1-42 group was significantly higher than that in the Aβ1-42 group，the differences were statistically significant（P>0.05）.Conclusion Exendin4 pretreatment can dose-dependently antagonize against the Aβ1-42-induced recognition memory impairment in rats.

Amyloid beta-protein； Rats； Memory； Animal experimentation； Exendin4

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.22.001

A

1009-5519（2016）22-3421-02

2016-07-22）

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2015JQ8299）。

潘艷芳（1982-），博士研究生，講師，主要從事淀粉樣β蛋白毒性的產(chǎn)生機(jī)制及防治研究。