許茵，華忠，俞萍，戴亞萍，蒯守剛

（江蘇省無(wú)錫市第五人民醫(yī)院1.檢驗(yàn)科，2.肝病科，江蘇 無(wú)錫 214005）

阿德福韋酯治療慢性乙肝后細(xì)胞免疫水平的臨床研究

許茵1，華忠2，俞萍2，戴亞萍1，蒯守剛1

（江蘇省無(wú)錫市第五人民醫(yī)院1.檢驗(yàn)科，2.肝病科，江蘇 無(wú)錫 214005）

目的探討阿德福韋酯治療慢性乙肝（CHB）患者后免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫狀態(tài)。方法采用時(shí)間分辨法檢測(cè)乙型肝炎病毒（HBV）血清標(biāo)志物，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)白細(xì)胞介素-21（IL-21）水平，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)血清HBV-DNA，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HBV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）和濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞（Tfh）的變化。結(jié)果阿德福韋酯治療72周后HBV-DNA水平下降，血清IL-21水平、外周血HBV特異性CTL和Tfh水平高于治療前（P＜0.05），治療后HBV-DNA轉(zhuǎn)陰組和HBeAg轉(zhuǎn)陰組中血清IL-21水平、外周血HBV特異性CTL、Tfh水平高于未轉(zhuǎn)陰組（P＜0.05），而HBV-DNA轉(zhuǎn)陰組和HBeAg轉(zhuǎn)陰組各檢測(cè)指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論阿德福韋酯治療CHB可提高血清IL-21、HBV特異性CTL及Tfh水平，該變化可能與CHB患者抗病毒治療后病毒性應(yīng)答有關(guān)。

慢性乙肝；HBV-DNA水平；濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞；HBV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞

全球約20億人證明有乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染，其中3.5億為慢性HBV感染。據(jù)2006年全國(guó)乙型肝炎流行病學(xué)調(diào)查推算，我國(guó)現(xiàn)有慢性HBV感染者約9 300萬(wàn)人，其中慢性乙型肝炎患者（chronic hepatitis B，CHB）約2 000萬(wàn)例。機(jī)體感染HBV后，機(jī)體的細(xì)胞免疫在病毒清除和肝細(xì)胞損害中起重要作用。慢性乙肝患者治療的方法之一是利用核苷類藥物抗病毒，其療效與患者細(xì)胞免疫功能有關(guān)，細(xì)胞免疫狀態(tài)在病毒清除過(guò)程中起重要作用[1]。本實(shí)驗(yàn)研究75例CHB患者經(jīng)阿德福韋酯治療72周后，HBV-DNA水平和細(xì)胞免疫水平的變化，探討細(xì)胞免疫在抗病毒治療過(guò)程中的作用。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象

選取2010年12月-2012年3月無(wú)錫市第五人民醫(yī)院肝病科收治的75例CHB患者，符合2010年《慢性乙型肝炎防治指南》[2]的標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：乙肝表面抗原陽(yáng)性、HBV-DNA＞1×103拷貝/ml，肝功能有不同程度的異常，肝組織學(xué)檢查有肝炎病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：甲肝病毒、丙肝病毒、丁肝病毒、戊肝病毒感染，自身免疫性疾病，使用過(guò)核苷類藥物和干擾素等抗病毒藥物或免疫調(diào)節(jié)劑。納入患者均為人類白細(xì)胞抗原-A2（Human leukocyte antigen-A2，HLA-A2）陽(yáng)性，其中男性44例（58.7%），女性31例（41.3%）；年齡21～60歲；平均病程（4.33±2.15）年。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1治療方法CHB患者口服阿德福韋酯（正大天晴藥業(yè)公司生產(chǎn)）10 mg，1次/d。按照2010年《慢性乙型肝炎防治指南》的標(biāo)準(zhǔn)，療程≥72周。

1.2.2HBV血清標(biāo)志物和HBV-DNA檢測(cè)方法HBV血清標(biāo)志物采用全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀（1235-514AUTO-DELFTA），蘇州新波生物技術(shù)有限公司試劑檢測(cè)。HBV-DNA使用聚合酶鏈反應(yīng)，上?？迫A生物工程股份有限公司試劑檢測(cè)。

1.2.3人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離釆集患者及健康對(duì)照抗凝血，與等量液混勻后，將外周血稀釋液與人外周血淋巴細(xì)胞分離液按比例沿離心管壁緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液層，室溫離心。用移液管緩慢吸出白色單個(gè)核細(xì)胞層，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌2次，離心后棄上清液。

1.2.4外周血濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞（T follicular helper cells，Tfh）及特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）百分率的檢測(cè)將上述PBS洗滌2次后的外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）計(jì)數(shù)重懸，使100μl懸液中含1×106個(gè)細(xì)胞。分別加入抗人CD4-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate isomerⅠ，F(xiàn)ITC）和抗人CXCR5-PerCP/Cy5.5流式抗體。室溫避光孵育30 min后PBS洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CXCR5+細(xì)胞的百分率。加入抗人CD8-PerCP/ Cy5.5抗體、抗人HLA-A2-FITC抗體、抗人Pro5 MHC Pentamer A-PE流式抗體，室溫避光孵育30 min后PBS洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測(cè)HLA-A2+CD8+MHC+細(xì)胞的百分率?？贵w均購(gòu)自美國(guó)BD biosciences公司。

1.2.5外周血白細(xì)胞介素-21（Interleukin-21，IL-21）的檢測(cè)采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法，試劑由美國(guó)ADL公司提供，檢測(cè)儀器為北京德朗公司的酶標(biāo)分析儀。

1.2.6肝功能檢測(cè)采用日本奧林帕斯公司5400全自動(dòng)生化分析儀，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CHB患者治療前后谷丙轉(zhuǎn)氨酶、HBV-DNA、白細(xì)胞介素-21、HBV特異性CTL和Tfh的變化

75例CHB患者經(jīng)阿德福韋酯治療72周后，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、HBV-DNA、IL-21、HBV特異性CTL和Tfh與治療前比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），ALT和HBVDN下降，而IL-21、HBV特異性CTL和Tfh上升。見(jiàn)表1。

表1　CHB患者治療前后ALT、HBV-DNA、IL-21、HBV特異性CTL和Tfh的變化（n=75±s）

表1　CHB患者治療前后ALT、HBV-DNA、IL-21、HBV特異性CTL和Tfh的變化（n=75±s）

組別ALT/（IU/L）HBV-DNA/（log 10拷貝/ml）IL-21/（ng/L）HBV特異性CTL/%Tfh/%治療前277.301±89.6116.542±0.81313.741±2.3130.363±0.0713.472±2.133治療72周后36.530±5.2142.081±0.22243.612±15.0200.844±0.1136.073±1.581 t值3.9727.5648.5733.2724.511 P值0.0000.0000.0000.0000.000

2.2治療后HBV-DNA陰轉(zhuǎn)組與未轉(zhuǎn)陰組IL-21、HBV特異性CTL和Tfh濃度變化

經(jīng)阿德福韋酯治療72周后，HBV-DNA轉(zhuǎn)陰組與HBV-DNA未轉(zhuǎn)陰組IL-21、HBV特異性CTL和Tfh比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IL-21、HBV特異性CT和Tfh上升，HBV-DNA轉(zhuǎn)陰組高于HBV-DNA未轉(zhuǎn)陰組；乙型肝炎E抗原（hepatitis Be antigen，HBeAg）轉(zhuǎn)陰組與HBeAg未轉(zhuǎn)陰組IL-21、HBV特異性CTL和Tfh比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HBeAg轉(zhuǎn)陰組IL-21、HBV特異性CTL和Tfh高于HBeAg未轉(zhuǎn)陰組。見(jiàn)表2、3。

表2　治療后HBV-DNA陰轉(zhuǎn)組與未轉(zhuǎn)陰組IL-21、HBV特異性CTL和Tfh濃度變化（±s）

表2　治療后HBV-DNA陰轉(zhuǎn)組與未轉(zhuǎn)陰組IL-21、HBV特異性CTL和Tfh濃度變化（±s）

組別IL-21/（ng/L）HBV特異性CTL/%Tfh/% HBV-DNA轉(zhuǎn)陰組（n=54）42.672±15.1010.872±0.0624.974±2.413 HBV-DNA未轉(zhuǎn)陰組（n=21）t值16.754±9.241 3.021 0.561±0.103 5.064 2.663±0.791 4.523 P值0.0000.0000.000

表3　治療后HBeAg陰轉(zhuǎn)組與未轉(zhuǎn)陰組IL-21、HBV特異性CTL和Tfh濃度變化（±s）

表3　治療后HBeAg陰轉(zhuǎn)組與未轉(zhuǎn)陰組IL-21、HBV特異性CTL和Tfh濃度變化（±s）

組別HBV特異性CTL/%Tfh/% HBeAg轉(zhuǎn)陰組（n=19）0.983±0.0605.362±2.312 IL-21/（ng/L）39.833±17.142 HBeAg未轉(zhuǎn)陰組（n=56）t值11.851±10.210 4.872 0.613±0.074 6.323 2.784±1.461 4.217 P值0.0000.000 0.000

3 討論

阿德福韋酯是單磷酸腺苷的核苷酸類似物，在體內(nèi)通過(guò)細(xì)胞激酶作用被磷酸化為具有活性作用的二磷酸阿德福韋，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)脫氧腺苷三磷酸底物來(lái)抑制HBV-DNA逆轉(zhuǎn)錄酶活性，進(jìn)入復(fù)制的HBVDNA內(nèi)，終止病毒DNA鏈的延伸。

IL-21是由多種活化的CD4+T細(xì)胞（主要為T(mén)h17細(xì)胞、濾泡性輔助性T細(xì)胞）、自然殺傷細(xì)胞等分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子。IL-21可以通過(guò)增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的活化，增殖和效應(yīng)功能調(diào)節(jié)細(xì)胞毒性的T淋巴細(xì)胞的分化。IL-21在乙型肝炎的發(fā)病過(guò)程及疾病轉(zhuǎn)歸中起重要作用[3]。Tfh可通過(guò)分泌IL-21增加病毒特異性CTL的增值[4-6]。

CHB患者抗病毒治療后HBV-DNA轉(zhuǎn)陰，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)陰是CHB患者療效較好的標(biāo)志[7]。CHB患者抗病毒療效與患者特異性細(xì)胞免疫有關(guān)。本研究采用阿德福韋酯治療CHB患者72周，觀察病毒學(xué)應(yīng)答與HBV特異性CTL的關(guān)系，結(jié)果表明，治療72周后患者IL-21和Tfh、HBV特異性CTL水平較治療前明顯升高。治療后HBV-DNA轉(zhuǎn)陰，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)陰患者IL-21和Tfh、HBV特異性CTL高于治療后HBV-DNA未轉(zhuǎn)陰、HBeAg血清學(xué)未轉(zhuǎn)陰的患者。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)阿德福韋酯治療72周后，Tfh、HBV特異性CTL明顯升高，說(shuō)明抗病毒藥物的治療不僅直接抑制HBV復(fù)制[8]，而且還通過(guò)提高HBV特異性CTL水平發(fā)揮對(duì)HBV的清除作用，并且阿德福韋酯治療慢性乙肝可增加Tfh的細(xì)胞比例和血清IL-21表達(dá)水平，Tfh可通過(guò)分泌IL-21進(jìn)一步增加抗病毒特異性CTL細(xì)胞的增值活化。

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（童穎丹 編輯）

Cellular immune status in patients with chronic hepatitis B after treatment with Adefovir dipivoxil tablets

Yin Xu1,Zhong Hua2,Ping Yu2,Ya-ping Dai1,Shou-gang Kuai1
(1.Clinical Laboratory;2.Department of Hepatology,the Fifth People's Hospital of Wuxi,Wuxi,Jiangsu 214005,China)

Objective To investigate the dynamic variations of virological response and cellular immunity of patients with chronic hepatitis B(CHB)after Adefovir dipivoxil treatment.Methods Serum IL-21 level was analyzed by ELISA.HBV-DNA level was assayed by fluorescent quantitative polymerase chain reaction(FQPCR).Peripheral T lymphocyte subsets of HBV special CTL and T follicular helper cells(Tfh)were examined by flow cytometry(FACS).Results After treatment with Adefovir dipivoxil for 72 weeks,the serum HBV-DNA level was dramatically decreased,the levels of serum IL-21 and HBV special CTL and Tfh were significantly higher compared to those before treatment(P＜0.05).Moreover,the levels of serum IL-21 and HBV special CTL and Tfh in the HBV-DNA conversion and HBeAg conversion groups were significant higher than those in the HBV-DNA non-conversion and HBeAg non-conversion groups,respectively(P＜0.05).Conclusions The levels of serum IL-21,peripheral HBV special CTL and Tfh in CHB patients increase after thetreatment with Adefovir dipivoxil,which might be related with the cellular immune status of patients after antiviral treatment.

chronic hepatitis B;IL-21;Tfh;HBV special CTL

R512.62

B

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.21.019

1005-8982（2016）21-0094-03

2016-02-16

蒯守剛，E-mail：kuaishougang@163.com