胡 青 劉 敏

(西華大學(xué)外國語學(xué)院 四川 成都 610000)

受滅鮭氣單胞菌感染的大西洋鮭編碼的可溶性TLR5轉(zhuǎn)錄編碼鑒定

胡 青 劉 敏

(西華大學(xué)外國語學(xué)院 四川 成都 610000)

本文翻譯自Elseviers收錄文章Identification of a transcript encoding a soluble formof toll-like receptor 5(TLR5)in Atlantic salmonduring Aeromonas salmonicida infection

脊椎動物和昆蟲的Toll樣受體(TLRs)在先天免疫應(yīng)答中與抗微生物病原相關(guān)。TLR的胞外區(qū)識別病原相關(guān)分子模式，胞內(nèi)區(qū)啟動免疫反應(yīng)的信號途徑。在染病大西洋鮭肝臟中發(fā)現(xiàn)一種新可溶性TLR轉(zhuǎn)錄物。BLASTN分析顯示其與最近在虹鱒中發(fā)現(xiàn)的可溶性TLR5(Genebank：AB062504)具有最高序列相似度。推導(dǎo)出蛋白質(zhì)與哺乳動物TLR5對應(yīng)的類富含亮氨酸區(qū)域(LRR)有40%的相似度。依照人類TLRs結(jié)構(gòu)，它含21個LRRs保守區(qū)域，LxxLxLxxNx*xx*xxxxFxxL模式。由于TLR5可識別細(xì)菌鞭毛蛋白，可推測，滅鮭氣單胞菌鞭毛蛋白或其他一些配體衍生物與LRR中某區(qū)域結(jié)合到這種可溶性TLR。

可溶性Toll樣受體(TLR);亮氨酸富集重復(fù)(LRR);炎癥;大西洋鮭

先天免疫系統(tǒng)是抵抗病原體的首個防線，TLRs是其中識別病原體不可缺的部分。TLRs識別入侵的病原體保守的病原相關(guān)分子模式，繼而通過相互作用的幾個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起宿主細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。其功能性研究多限于哺乳動物膜結(jié)合TLRs的胞外區(qū)。在河豚和虹鱒中也發(fā)現(xiàn)了sTLR5。本文研究在感染滅鮭氣單胞菌的大西洋鮭中的sTLR的核苷酸序列以及氨基酸序列，它與哺乳動物的TLR5相似，有21個LRR結(jié)構(gòu)域，及LRR結(jié)構(gòu)域中可能的配體識別位點。

從感染滅鮭氣單胞菌的大西洋鮭的肝臟SSHcDNA文庫中分離出了組裝哺乳動物TLR5胞外域的3種EST克隆(Genebank：BQ036495，BQ036497，BQ036528)。這些不完整的TLR序列都小于600bp，編碼不完整的TLR。為了獲得TLR完整的編碼區(qū)域，用RNeasy Maxi Kit從感染的大西洋鮭的肝臟中提取總RNA,用SMARTcDNA Library Construction Kit構(gòu)建cDNA文庫。用雙重PCR擴增。第一重PCR：側(cè)翼插入引物(5‘-CAACTTGAACAGCGTCTATCTAT-3‘)和pTriplEx引物(5‘-CGCCCTATAGTGAGTCGTA-3‘)，退火溫度55℃，90s，40個循環(huán)。第二重PCR：基因特異性引物(5‘-GGGATATCAAGCATTTACAGGAC-3‘)和pTriplEx引物，退火溫度58℃，45s，35個循環(huán)。對終產(chǎn)物進一步的測序，發(fā)現(xiàn)這種特別的TLR沒有跨膜或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。為得到5‘端的編碼區(qū)，根據(jù)虹鱒的TLR5(AB062504)設(shè)計引物。用正向基因特異性引物(5‘-CAAGCTGTAAACACATTCTTTATG-3’)和反向引物(5’-CTCTATAGACATGTTTCTAAAC-3’)進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物用TA cloning kit(Invitrogen)克隆進pCR2.1載體，再利用ABI PRISM BigDye Terminator Ready Reaction mix and Model 2700 PCR System Thermal進行PCR循環(huán)測序。蛋白質(zhì)的BLASTX分析顯示：其與哺乳動物對應(yīng)的TLR5的胞外域有40%的相似性。

所得sTLR的cDNA序列全長2274bp，包括21bp的5‘非翻譯區(qū)，1992bp的開放讀碼框，編碼664個氨基酸殘基，以及258bp的3‘非翻譯區(qū)。前28個氨基酸殘基構(gòu)成一個單肽，其后富含脯氨酸的區(qū)域(圖1下劃線)以及富含亮氨酸(LRR)的重復(fù)區(qū)域。利用哺乳動物TLRs的LRR一致序列(xLxxLxLxxNx*xx*xxxxFxxLxxx，x代表任意氨基酸，*代表疏水的氨基酸)來鑒定大西洋鮭LRRs，發(fā)現(xiàn)其有21個LRR區(qū)域。C末端的序列是以一致的LRR結(jié)構(gòu)域開始，其后是近50個氨基酸殘基包括4個特殊構(gòu)造的半胱氨酸殘基xLxxLxLxxNxFxCxCx(24-26)Cx(18-21)C。大西洋鮭中的這種sTLR僅2個半胱氨酸殘基是保守的。多數(shù)沒有跨膜結(jié)構(gòu)或TIR結(jié)構(gòu)域的sTLR5也適用于這種情況。哺乳動物的mTLR5的四個半胱氨酸殘基都用于維持C端的穩(wěn)定性并保持整個胞外域靠近細(xì)胞膜。

LRR特征序列最初發(fā)現(xiàn)于人類血清基本結(jié)構(gòu)，富含亮氨酸的α2糖蛋白，有24個氨基酸殘基重復(fù)序列和特殊構(gòu)造的疏水殘基。大西洋鮭sTLR5含21個LRRs。除LRR7、9和18具有較大插入序列外，大西洋鮭sTLR的大多數(shù)LRRs組裝與哺乳動物TLR-LRR是一致特征序列。在哺乳動物TLR4、5、7、8和9中，插入序列是常見現(xiàn)象，這對PAMP的識別是至關(guān)重要的。至今未知，LRR7、9和18的插入序列是否會影響大西洋鮭sTLR5配體結(jié)合微生物毒力因子。

與mTLR5s不同，這種特殊的sTLR5最早報道于河鲀基因組。它在與mTLR5不同染色體上的一個稀有基因編碼的。在虹鱒中發(fā)現(xiàn)mTLR5和sTLR5有81%的相似性。用虹鱒肝瘤細(xì)胞系RTH-149，用鰻利斯頓氏菌或mTLR5的其他配體來刺激mTLR5，sTLR5的表達(dá)上調(diào)。人類TLR5的配體識別位點已定位于LRR特征序列，第386-407個氨基酸之間，LRR14中。鮭科魚有6個獨特的殘基，至今未知這些序列是否與配體鞭毛蛋白識別的特異性相關(guān)。

若大西洋鮭LRR14能識別鞭毛蛋白，mTLR5和sTLR5將競爭性的結(jié)合配體，sTLR5可能被誘導(dǎo)為一種反饋調(diào)節(jié)機制來阻止對鞭毛蛋白的過量炎癥反應(yīng)。在小鼠的巨噬細(xì)胞系中，選擇性的敲除可溶性mTLR4，有效阻止LPS介導(dǎo)的TNF-α的轉(zhuǎn)導(dǎo)以及NF-κB的激活。在調(diào)節(jié)sTLR5介導(dǎo)的鞭毛蛋白的炎癥反應(yīng)中，正反饋和負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制均存在。TLR5家族復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑要等到配體結(jié)合位點確定后才能更加深入了解。

[1] Bell,J.K.,Mullen,G.E.,Leifer,C.A.,Mazzoni,A.,Davies,D.R.,Segal,D.M.,2003.Leucine-rich repeats and pathogen recognition in toll-like receptors.Trends Immunol.24(10),528-533.

[2] Takeda,K.,Kaisho,T.,Akira,S.,2003.Toll-like receptors.Annu.Rev.Immunol.21,335-376.456.

胡青(1991—)，女，漢族，湖北武漢人，研究生在讀，西華大學(xué)外國語學(xué)院，研究方向：英語筆譯。劉敏(1986—)，女，回族，江蘇南京人，研究生在讀，西華大學(xué)外國語學(xué)院，研究方向：英語筆譯。

S917.4

A

1672-5832(2016)04-0281-01